失眠穴方合臍內(nèi)環(huán)穴針刺對(duì)PCPA 模型大鼠海馬5-HT1AR、5-HT2AR 表達(dá)的影響*

李文康，羅本華，李玉秋

廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001

原發(fā)性失眠指慢性、反復(fù)發(fā)作的睡眠障礙[1］。長期失眠可導(dǎo)致免疫力下降，影響患者的生活質(zhì)量，但其發(fā)病機(jī)制尚不明確，中樞5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）是較為公認(rèn)的影響睡眠質(zhì)量的物質(zhì)之一。目前關(guān)于5-HT 受體表達(dá)及相關(guān)的遞質(zhì)含量的研究樣本較少。已有實(shí)驗(yàn)報(bào)告：腦內(nèi)5-HT1A受體在海馬區(qū)及中縫核區(qū)域呈高密度分布，激活該受體可同時(shí)增加深睡眠和淺睡眠，以此起到抗失眠的作用；5-HT2AR 與Gαq/11 偶聯(lián)，作用之一是使磷酯酶C 被激活；5-HT2A受體表達(dá)的增多則會(huì)抑制慢波睡眠、導(dǎo)致失眠不同程度的加重。失眠方合臍內(nèi)環(huán)針刺是近年新創(chuàng)的臨床有效治療失眠癥的針刺驗(yàn)方[2］，已取得臨床療效驗(yàn)證、神經(jīng)行為學(xué)支持及中樞5-HT 遞質(zhì)機(jī)制證據(jù)。本研究進(jìn)一步就5-HT 受體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，旨在探討失眠癥中5-HT1AR、5-HT2AR 在海馬區(qū)的表達(dá)機(jī)制?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇PF 級(jí)SD 雄性大鼠46 只，平均體質(zhì)量（250±15）g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。飼養(yǎng)條件：同等條件下分籠飼養(yǎng)，室溫20～26℃，相對(duì)濕度為40%～60%，白晝循環(huán)模式下自然光照，定時(shí)喂食，自由飲水，預(yù)養(yǎng)15天。

1.2 藥物及試劑對(duì)氯苯丙氨酸（para-chlorophenylalanine，PCPA，Thermo 賽默飛）；二甲苯（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：10023418）；無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：10009218）；3%H202（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：10011218）；封閉山羊血清（Solarbio，批號(hào)：SL038）；DAB顯色試劑盒（Solarbio，批號(hào)：DA1010）；蘇木素（G1140，批號(hào)：SL038）；中性樹膠（G8590，批號(hào)：SL038）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器DM1000型正置顯微鏡（徠卡顯微系統(tǒng)有限公司）；移液器（型號(hào)：P2、P10、P20、P100、P200、P1000，吉爾森P 型移液器公司）；DHG-9023A型恒溫烘箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；RM2235 型石蠟切片機(jī)（徠卡顯微系統(tǒng)有限公司）；TKD-TK 型攤片機(jī)（湖北康強(qiáng)醫(yī)療器械有限公司）；TB-718L 型生物組織包埋機(jī)-冷凍機(jī)（泰維科技）；TKD-TSB 型組織脫水機(jī)（湖北康強(qiáng)醫(yī)療器械有限公司）；TB-718D 型石蠟包埋機(jī)（湖北康強(qiáng)醫(yī)療器械有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組及造模 將50只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組10只、預(yù)用模型組40只。預(yù)用模型組采用腹腔注射PCPA 法造模。先用弱堿性生理鹽水（pH7-8）按45 mg/mL規(guī)格備用。于上午8∶30～9∶00將大鼠按l mL/100 g體質(zhì)量腹腔注射PCPA混懸液，每天1 次，連續(xù)注射2 天。在第2 次腹腔注射PCPA 28～30 h 后，觀察并記錄大鼠的行為學(xué)變化及神經(jīng)癥狀。造模成功表現(xiàn)：大鼠白天出現(xiàn)躁動(dòng)不安，夜間仍活動(dòng)不停，晝夜交替變化消失，對(duì)外界的聲、光等自然刺激反應(yīng)強(qiáng)烈，輕易不讓實(shí)驗(yàn)者抓摸，飲食與二便顯著增多，進(jìn)食快，飲水多，大小便明顯增多，亢奮不停，對(duì)同類及實(shí)驗(yàn)人員的攻擊欲望很強(qiáng)，大便色偏發(fā)白，整體與空白組差異明顯。造模成功大鼠選出30 只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、針刺組、非穴組3 組，每組各10 只。正常組腹腔注射相同體積的弱堿性生理鹽水，連續(xù)注射2日。

1.4.2 干預(yù)方法 于造模成功第2 天開始干預(yù)治療，每天1次，共6次。1）針刺組：予失眠穴方加臍內(nèi)環(huán)針刺治療，每穴留針30 s，單次治療時(shí)長7 min。具體方法如下：（1）臍內(nèi)環(huán)穴針刺：選臍內(nèi)環(huán)穴。以大鼠神闕穴[3］為中心，距離2.5 mm 做一圓，正上為心，右為肝，左為脾胃，左上、右上均為肺，共6個(gè)點(diǎn)。針刺方法：以毫針（0.25 mm×25 mm）傾斜15°刺入，深度2～4 mm，針后不行捻轉(zhuǎn)提插手法，每穴點(diǎn)留針30 s 出針，6 穴點(diǎn)均必須針刺，計(jì)3 min。（2）失眠穴方針刺：取雙側(cè)神門、支溝、足三里、三陰交穴。取穴標(biāo)準(zhǔn)依照實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)。干預(yù)方法：以毫針（0.25 mm×25 mm）刺入穴位相應(yīng)的深度，施80～160次/min的高頻小幅度捻轉(zhuǎn)手法，每穴留針25～30 s，單次治療時(shí)長4 min。2）正常組與模型組不做任何針刺，給予同針刺組相同時(shí)間的搔抓刺激，單次治療時(shí)長7 min。3）非穴組針刺大鼠兩肋下緣各兩個(gè)固定非穴點(diǎn)，其定位于乳正中線外開2.5 mm，肋弓下1 mm，針刺方向與肋弓平行，針尖向外斜刺3 mm；每穴行針90 s，繼續(xù)抓摸1 min，單次治療時(shí)長7 min。

1.5 組織處理

1.5.1 大鼠海馬組織取材方法 大鼠麻醉后，打開胸腔，尋找心臟，自左心室心尖部插入50 mL 針頭抵至主動(dòng)脈，在右心耳下角剪一小洞，使用針管灌注生理鹽水200 mL 直到臟器顏色發(fā)白發(fā)亮，隨后加用4%多聚甲醛，注入200 mL，待大鼠全身僵硬，迅速取出大腦，根據(jù)大鼠解剖學(xué)圖譜，取下將海馬組織包含在內(nèi)的冠狀斷面，每塊厚約2 mm，4%多聚甲醛固定液固定。

1.5.2 海馬組織處理及切片 取海馬組織在4%多聚甲醛溶液后固定過夜。在制片流程中，備用脫水最容易出錯(cuò)。梯度乙醇浸泡脫水，置于二甲苯中透明，再浸蠟，逐次經(jīng)石蠟Ⅰ（52℃～54℃）、石蠟Ⅱ（56℃～58℃）各2 h 后，依次序常規(guī)包埋、切片，切片厚度約5 μm，水浴展片，用防脫載玻片撈片后，自然干燥后放入60℃烤箱烤1.5～2 h。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 大鼠海馬5-HT1A、5-HT2A受體表達(dá) 烤片和脫蠟時(shí)，將玻片置于65℃恒溫烘箱中烤片1 h；先后置于二甲苯I、Ⅱ中浸泡15 min；切片入梯度乙醇（濃度依次為100%酒精I(xiàn)、100%酒精Ⅱ、95%酒精、85%酒精、75%酒精）分別浸泡5 min，自來水沖洗10 min 后完成水化；采用0.01M 檸檬酸鈉緩沖溶液中高壓（125℃·103kPa）抗原修復(fù)后，自然冷卻后，PBS 溶液洗滌3 min×3 次；于3%H2O2中，濕盒避光孵育10 min，通過阻斷以消除活性；使用10%山羊血清封閉；選擇1∶50比例滴加一抗，4℃孵育過夜，PBS溶液沖洗3 min×3次；將切片從4℃冰箱中取出，室溫復(fù)溫，PBS 溶液沖洗5 min×3 次，滴加maxvision 二抗，濕盒孵育1 h；經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺法病理染色（DAB），蘇木素復(fù)染細(xì)胞核3 min后，樣本經(jīng)梯度酒精分別浸泡5 min 完成脫水；再將玻片置于二甲苯中透明3 min×2 次，中性樹膠封片。顯微鏡下100、200 倍視野下拍照觀察，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.6.2 大鼠海馬5-HT1A、5-HT2A平均光密度 對(duì)組織切片進(jìn)行圖像采集，陽性細(xì)胞表達(dá)為棕黃色。每張切片海馬CA3區(qū)200倍視野下隨機(jī)選取拍照，拍照要求為背景光一致、組織充滿觀察視野；采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)選相同棕黃色為陽性表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)，得出每張圖像陽性的累積光密度值（IOD）和視野面積（AREA），統(tǒng)計(jì)出平均光密度值（AO 值），AO=IOD/AREA，數(shù)值越高提示陽性表達(dá)越強(qiáng)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量數(shù)據(jù)用±s來表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較，若方差齊時(shí)采用（LSD）法，若方差不齊則采用（Dunnett′s T3）法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠海馬5-HT1AR 及5-HT2AR 表達(dá)5-HT1AR經(jīng)DAB 染色法顯示：正常組大鼠海馬區(qū)5-HT1AR 棕黃色顆粒排列整齊，神經(jīng)元較為飽滿，形狀規(guī)則，顏色較深，無明顯病理改變。模型組大鼠5-HT1AR陽性表達(dá)數(shù)目減少，呈散在、疏松排列，部分神經(jīng)元結(jié)構(gòu)不清、正常形態(tài)消失。與模型組比較，針刺組5-HT1AR 陽性表達(dá)顆粒分布集中且較規(guī)則，病理損傷減輕，顏色加深，陽性數(shù)目明顯增加。非穴組陽性5-HT1AR 顆粒數(shù)略多于模型組，排列有一定形狀，集中表達(dá)區(qū)域較少。見圖1。

5-HT2AR 經(jīng)DAB 染色法顯示：正常組5-HT2AR 藍(lán)色顆粒數(shù)分布集中，排列規(guī)則，棕色細(xì)胞偶見散在，幾乎無病理改變；模型組5-HT2AR 陽性顆粒數(shù)目明顯增加，陽性表達(dá)區(qū)域集中，呈一定形狀排列；與模型組比較，針刺組5-HT2AR 棕色表達(dá)數(shù)明顯較少，陽性表達(dá)區(qū)域顏色較淺，條帶狀規(guī)則排列，組織病理損傷基本緩解；非穴組5-HT2AR 陽性表達(dá)區(qū)域略少于模型組，排列無序，部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞。見圖2。

2.2 大鼠海馬5-HT1AR、5-HT2AR平均光密度值模型組大鼠海馬5-HT1AR平均光密度值顯著低于正常組（P＜0.01），海馬5-HT2AR顯著高于正常組（P＜0.01），而與非穴組比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；針刺組5-HT1AR 平均光密度值顯著高于模型組（P＜0.01），5-HT2AR平均光密度值顯著低于模型組（P＜0.01），而與正常組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠海馬5-HT1AR及5-HT2AR平均光密度值比較（xˉ±s）

3 討論

長期失眠易導(dǎo)致焦慮不安，加重抑郁乃至恐懼心理，嚴(yán)重影響患者的身心健康[3-6］。失眠病機(jī)，多在水火失衡，在陰陽失交，在營衛(wèi)不和。人之精氣盛衰，可從臍部及腹部血?dú)膺\(yùn)行觀察，臍周血脈的運(yùn)行直接關(guān)系全身的氣血變化，針刺臍周影響全身臟腑氣血。壯醫(yī)針刺調(diào)氣之要，在于通暢龍路、火路、水道、氣道、谷道[7-8］。臍內(nèi)環(huán)穴在臍旁開0.5 寸，環(huán)線上皆是穴位。其為督脈所過、任脈所榮及沖脈所聯(lián)屬，能調(diào)節(jié)先天精氣與后天水谷精微。臍在人體三部劃分中屬于人部，是全身臟腑氣血、信息交匯處，借助行氣手法、針刺補(bǔ)瀉，能調(diào)五臟之氣、補(bǔ)養(yǎng)五臟之神[9］。故有培元固本之效，除用治失眠外，也常用治全身其他疾病。

失眠穴方是羅本華教授臨證多年治療失眠的驗(yàn)方，以神門、支溝、足三里、三陰交為主穴[10］，以溝通陰陽、瀉火補(bǔ)水。臍內(nèi)環(huán)結(jié)合失眠穴方之所以疊加效應(yīng)明顯，是因?yàn)槠溆行У匕l(fā)揮了臍內(nèi)環(huán)針在腹部聯(lián)絡(luò)臟腑經(jīng)絡(luò)的作用，又加強(qiáng)了失眠穴中經(jīng)穴的肢端及遠(yuǎn)治作用[11］，全面調(diào)節(jié)了失眠癥的臟腑經(jīng)絡(luò)、使水火陰陽趨于平衡。

5-HT 及其受體參與睡眠-覺醒機(jī)制的調(diào)節(jié)過程，覺醒時(shí)興奮性最高，被稱作大腦的“致眠因子”，通過降低神經(jīng)細(xì)胞外5-HT 濃度可加速睡眠[12］。因此PCPA 失眠模型在探究失眠癥機(jī)制研究中最被認(rèn)可[13］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：腹腔注射PCPA 能造成大鼠晝夜節(jié)律消失，模型組海馬5-HT1AR 陽性表達(dá)數(shù)量下降，分散在視野內(nèi)，排列疏松，部分神經(jīng)元結(jié)構(gòu)不清；5-HT2A受體棕黃色陽性數(shù)目明顯增加，陽性區(qū)域集中表達(dá)在視野中部，個(gè)別陽性顆粒排列較雜亂。因此得知模型組大鼠海馬中5-HT1AR 表達(dá)下降，而5-HT2AR 表達(dá)上升，表明5-HT 受體亞型信號(hào)失?？赡苁荘CPA 失眠的致病機(jī)制。而失眠穴方合臍內(nèi)環(huán)針刺明顯增加失眠大鼠5-HT1AR 海馬區(qū)域表達(dá)，陽性表達(dá)數(shù)目明顯增加，集中表達(dá)區(qū)域顏色加深，減少了PCPA 失眠大鼠海馬5-HT2A受體表達(dá)，陽性表達(dá)區(qū)域顏色變淡，棕色顆粒數(shù)減少較多。說明針法在對(duì)興奮與抑制的動(dòng)態(tài)平衡中對(duì)失眠大鼠起到了良性調(diào)節(jié)作用，提示針刺臍內(nèi)環(huán)穴合失眠穴方可調(diào)節(jié)中樞5-HT 受體及蛋白表達(dá)，這可能是其治療失眠癥、調(diào)節(jié)睡眠-覺醒周期的理論來源之一。

綜上所述，陰陽失調(diào)、水火失濟(jì)是失眠總病機(jī)。臍內(nèi)環(huán)學(xué)合失眠方正是基于該基本病機(jī)，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果從5-HT1AR、5-HT2AR 的調(diào)節(jié)作用正好提供陰陽平衡調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步支持其為失眠癥治療的優(yōu)選方法。