基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討氣血雙補(bǔ)方抗慢性心力衰竭的作用機(jī)制*

林 鑫，劉 陽(yáng)，陳林偉，薛一濤△

1 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,山東 濟(jì)南 250014；2 南京中醫(yī)藥大學(xué)泰州附屬醫(yī)院

氣血雙補(bǔ)方是著名中醫(yī)學(xué)家孟景春教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方[1-5］，該方由人參、炙黃芪、酒當(dāng)歸、酒炒白芍、陳皮、玉竹、酒黃精、制首烏、枸杞子等9 味中藥組成，具有補(bǔ)益氣血、通陽(yáng)散結(jié)、活血通絡(luò)、復(fù)脈固脫等功效，主要用于治療慢性心力衰竭疾病[6］。但是對(duì)氣血雙補(bǔ)方的研究仍然存在以下問(wèn)題：氣血雙補(bǔ)方抗慢性心力衰竭作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)理尚未闡明，預(yù)測(cè)氣血雙補(bǔ)方的相關(guān)作用機(jī)制依然十分困難。而組學(xué)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法為解決這一難題提供了新的研究思路[7-9］。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究思路對(duì)氣血雙補(bǔ)方抗慢性心力衰竭的作用機(jī)制進(jìn)行研究，構(gòu)建“單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，為深入探討其作用機(jī)制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源本研究采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP），以人參、黃芪、當(dāng)歸、白芍、陳皮、玉竹、黃精、何首烏、枸杞子為關(guān)鍵詞，搜索氣血雙補(bǔ)方中9味中藥的全部化學(xué)成分。

1.2 活性化合物篩選本研究以化合物口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 作為活性化合物的篩選條件，篩選出TCMSP中具有較高活性的化合物。

1.3 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建通過(guò)TCMSP 平臺(tái)尋找與候選化合物相關(guān)的潛在靶點(diǎn)，將候選化合物與其潛在的靶點(diǎn)蛋白上傳至CytoSpace 3.7.0軟件（http：//www.cytoscape.org）生成體現(xiàn)藥物-靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，以探討氣血雙補(bǔ)方的藥理學(xué)作用機(jī)制。

1.4 疾病靶點(diǎn)的確定搜索TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//db.idrblab.org/ttd/）、STRING 數(shù) 據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）以及UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/），共搜索到與慢性心力衰竭相關(guān)的靶點(diǎn)302個(gè)。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建為了說(shuō)明靶點(diǎn)蛋白在系統(tǒng)水平上的作用，利用CytoSpace 3.7.0軟件中的Bisogenet插件，分別構(gòu)建成分靶點(diǎn)PPI和疾病靶點(diǎn)PPI，對(duì)二者進(jìn)行拓?fù)浞治霾⒑Y選核心靶點(diǎn)。

1.6 基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析本研究利用CytoSpace 3.7.0軟件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選出的核心靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO功能富集分析。

1.7 基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析利用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的蛋白進(jìn)行KEGG通路富集分析，說(shuō)明中藥化合物的靶點(diǎn)蛋白在信號(hào)通路中的作用，得到氣血雙補(bǔ)方抗慢性心力衰竭中的主要作用通路，并通過(guò)Omicshare軟件（http：//www.omicshare.com/）對(duì)富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的篩選通過(guò)TCMSP 共收集到氣血雙補(bǔ)方中化合物共850個(gè)，其中來(lái)自人參190個(gè)，黃芪87個(gè)，當(dāng)歸125個(gè)，白芍85個(gè)，陳皮63個(gè)，玉竹62 個(gè)，黃精38 個(gè)，何首烏12 個(gè)，來(lái)自枸杞子188 個(gè)。以O(shè)B≥30%和DL≥0.18 為篩選條件，化合物分子中有128 個(gè)符合條件，經(jīng)去除重復(fù)值得到107個(gè)化合物，將其作為候選化合物。

2.2 氣血雙補(bǔ)方化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)利用CytoSpace 3.7.0 軟件將107 個(gè)化合物與靶點(diǎn)構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)總共包括284 個(gè)節(jié)點(diǎn)（104 個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)和177 個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)），1532 條邊。107 個(gè)化合物中有3 個(gè)化合物在數(shù)據(jù)庫(kù)中未找到相關(guān)靶點(diǎn)，未參與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。在網(wǎng)絡(luò)中，一個(gè)節(jié)點(diǎn)的度（Degree）表示網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點(diǎn)相連接的路線條數(shù)。在該網(wǎng)絡(luò)中，每個(gè)化合物的平均靶點(diǎn)數(shù)目為14.7個(gè)，每個(gè)靶點(diǎn)平均與8.66個(gè)化合物相互作用。在化合物方面，有32 個(gè)化合物的作用靶點(diǎn)≥20個(gè)，其中靶點(diǎn)≥35個(gè)的化合物有9 個(gè)。度排名前三的是Mol000098（quercetin）、Mol000422（kaempferol）、Mol000378（7-O-methylisomucronulatol）。在177個(gè)潛在靶點(diǎn)中，有114個(gè)靶點(diǎn)與3 個(gè)以上化合物連接，說(shuō)明大多數(shù)蛋白質(zhì)都與其他蛋白享有共同的配體。這體現(xiàn)了氣血雙補(bǔ)方多成分與多靶點(diǎn)之間共同作用的機(jī)制，符合中藥復(fù)方的特點(diǎn)。見圖1。

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析利用CytoSpace 3.7.0 軟件中的Bisogenet 插件，分別構(gòu)建化合物潛在靶點(diǎn)PPI（727個(gè)節(jié)點(diǎn)13328條邊）和慢性心力衰竭靶點(diǎn)PPI（644個(gè)節(jié)點(diǎn)10053條邊）。將這兩個(gè)PPI 網(wǎng)絡(luò)相交得到一個(gè)由495 個(gè)節(jié)點(diǎn)6118 條邊組成的網(wǎng)絡(luò)圖。利用Bisogenet 插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)中所有點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)（通過(guò)度、介度中心度和接近中心度）進(jìn)行分析，選擇靶點(diǎn)中每個(gè)靶點(diǎn)的度拓?fù)鋮?shù)值大于中位數(shù)作為篩選核心靶點(diǎn)的條件，得到109 個(gè)節(jié)點(diǎn)，1385 條邊組成的氣血雙補(bǔ)方與慢性心力衰竭靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。見圖2。

2.4 GO功能富集分析利用DAVID平臺(tái)對(duì)氣血雙補(bǔ)方PPI網(wǎng)絡(luò)中涉及的109個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析。根據(jù)發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05，進(jìn)一步確認(rèn)了256 個(gè)GO 條目，其中生物過(guò)程相關(guān)的條目181 個(gè)，主要涉及血小板活化、RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)節(jié)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始等方面；分子功能相關(guān)的條目49 個(gè)，主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性、酶結(jié)合等方面；細(xì)胞組成相關(guān)的條目26個(gè)，主要涉及蛋白質(zhì)復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)、大分子復(fù)合物等方面。FDR前20個(gè)核心靶點(diǎn)見附表1。

2.5 KEGG 通路富集分析利用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選出的核心靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行KEGG 通路富集分析，對(duì)氣血雙補(bǔ)方PPI 網(wǎng)絡(luò)中涉及的109 個(gè)蛋白子信號(hào)通路中的作用進(jìn)行了富集分析，分析了55.3%，得到了105 條通路。以P＜0.01，F(xiàn)DR＜0.05 進(jìn)行篩選，其中前20條通路包括癌癥中的微小RNA、甲狀腺激素信號(hào)通路、乙型肝炎通路、南美錐蟲病、癌癥的途徑、非小細(xì)胞肺癌通路、丙型肝炎通路、FOXO 信號(hào)通路、膽堿能突觸、甲狀腺癌通路、催乳素信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、急性髓性白血病通路、長(zhǎng)期抑郁癥通路、結(jié)直腸癌通路、前列腺癌通路、B 細(xì)胞受體信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路。研究表明，氣血雙補(bǔ)方的有效成分可能通過(guò)作用于這些信號(hào)通路來(lái)起到調(diào)控心力衰竭，從而治療疾病的目的，運(yùn)用omicShare（http：//www.omicshare.com/tools/）對(duì)富集結(jié)果進(jìn)行可視化處理，見圖3。

別類molecular function cellular component molecular function molecular function molecular function biological process biological process cellular component biological process molecular function molecular function biological process cellular component biological process biological process biological process molecular function molecular function molecular function molecular function率誤錯(cuò)現(xiàn)發(fā)3.61e-21 6.36e-17 2.76e-15 5.02e-14 7.09e-14 1.32e-13 1.54e-13 2.64e-13 6.57e-13 6.64e-13 9.68e-13 9.90e-13 1.49e-12 3.71e-12 3.82e-12 9.27e-12 1.14e-11 1.14e-11 2.01e-11 2.96e-11量數(shù)因8059252738303361252520665739363232142513基目GO條的中絡(luò)1 PPI網(wǎng)表附稱名protein binding nucleoplasm transcription factor binding transcription factor activity，transcription factor binding enzyme binding transcription from rna polymerase ii promoter positive regulation of transcription from rna polymerase ii promoter nuclear part cellular response to hormone stimulus transcription cofactor activity transcription coactivator activity signal transduction nuclear lumen positive regulation of gene expression positive regulation of transcription，dna-templated negative regulation of transcription，dna-templated receptor binding hormone receptor binding transcription regulatory region dna binding nuclear hormone receptor binding號(hào)體本因基go.0005515 go.0005654 go.0008134 go.0000989 go.0019899 go.0006366 go.0045944 go.0044428 go.0032870 go.0003712 go.0003713 go.0007165 go.0031981 go.0010628 go.0045893 go.0045892 go.0005102 go.0051427 go.0044212 go.0035257

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，對(duì)生物系統(tǒng)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，選取特定信號(hào)節(jié)點(diǎn)（specific signal nodes，SSNS）進(jìn)行多靶點(diǎn)藥物分子設(shè)計(jì)的新學(xué)科。將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與傳統(tǒng)中醫(yī)藥有機(jī)結(jié)合，其整體性、系統(tǒng)性、動(dòng)態(tài)性的特點(diǎn)與中醫(yī)整體觀念、辨證論治的理論相一致。本研究系統(tǒng)分析了氣血雙補(bǔ)方9 味中藥的有效成分，構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，分析化合物與靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系。其中化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成分是槲皮素、山奈酚、7-O-methylisomucronulatol 等。槲皮素是黃芪、枸杞子的有效成分，山奈酚是白芍的有效成分，7-0-methylisomucronulatol 是黃芪的有效成分。在化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中polr2a 有著最多的相互作用配體，CTCF 次之，RAB21 再次之。對(duì)氣血雙補(bǔ)方的靶點(diǎn)進(jìn)行PPI 映射并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，對(duì)網(wǎng)絡(luò)分析后發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與多種復(fù)雜疾病緊密相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)，如ADRA1D、ADRB1、SLC6A2、XDH、ADRA2C、CHRM2、PPARA、MMP3 等。為了說(shuō)明作用靶點(diǎn)在基因功能和信號(hào)通路中的作用，本研究進(jìn)行了GO 功能富集和KEGG 通路富集分析，研究發(fā)現(xiàn)氣血雙補(bǔ)方具有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)復(fù)合物、RNA 調(diào)控、酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、受體結(jié)合、基因表達(dá)的正調(diào)節(jié)、細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)等方面的功能。大多數(shù)基因富集到與癌癥有直接關(guān)系的通路上，包括胰腺癌通路、腎細(xì)胞癌通路、小細(xì)胞肺癌通路、甲狀腺癌通路、癌癥通路等；另一部分負(fù)責(zé)調(diào)控信號(hào)通路，包括PI3k-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路、ErbB 信號(hào)通路、PPAR 信號(hào)通路、Fc-RI 信號(hào)通路等，另外根據(jù)分析結(jié)果推測(cè)氣血雙補(bǔ)方中的活性成分如何參與癌癥直接相關(guān)的通路。本研究通過(guò)借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段，預(yù)測(cè)了氣血雙補(bǔ)方抗慢性心力衰竭的主要作用機(jī)制，為其活性成分研究和實(shí)驗(yàn)研究提供了科學(xué)的理論依據(jù)。