密碼子優(yōu)化人PD-L1基因在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)與鑒定

戰(zhàn)映璇 王環(huán) 湯潛 玄超 于建立 張霞 王清

(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部，山東 青島 266071； 2 青島大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科；3 中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所； 4 深圳市國創(chuàng)納米抗體技術(shù)有限公司)

程序性死亡配體-1(PD-L1)廣泛存在于多種細(xì)胞細(xì)胞表面[1]，與程序性死亡受體-1(PD-1)相互作用可以抑制T細(xì)胞活性與增殖，誘導(dǎo)免疫耐受[2]。這一過程在感染、腫瘤、自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要的調(diào)控作用[3-6]，PD-L1也是預(yù)測腫瘤免疫治療的潛在生物標(biāo)志物[7-11]。目前，實驗室使用的商品化PD-L1蛋白主要來源于哺乳動物細(xì)胞系，也有使用大腸桿菌表達(dá)PD-L1的報道。然而，哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)條件苛刻，使商品化的PD-L1價格高昂；大腸桿菌作為原核細(xì)胞，無法對蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后加工修飾，并且表達(dá)的PD-L1以無活性的包涵體形式存在于細(xì)胞內(nèi)，純化難度高[12]。巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris，P.pastoris)為真核生物，其含有的細(xì)胞器可以幫助蛋白質(zhì)折疊和糖基化修飾。另外，P.pastoris營養(yǎng)要求低，能夠?qū)崿F(xiàn)高密度發(fā)酵，蛋白表達(dá)后可分泌至培養(yǎng)基上清液中，提取純化方便[13]。本研究擬通過基因工程手段，構(gòu)建并篩選能穩(wěn)定表達(dá)人PD-L1蛋白的重組P.pastoris，為開展PD-L1的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

P.pastorisGS115(武漢普因特生物工程有限公司)；含有pPIC9K-PDL1質(zhì)粒的XL10-Gold大腸桿菌(上海生工生物工程股份有限公司構(gòu)建質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化)；質(zhì)粒大提試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；卡那霉素(北京索萊寶科技有限公司)；G418(美國Inalco公司)；SacⅠ-HF(美國New England Biolabs有限公司)；抗PD-L1單克隆抗體28-8(英國Abcam公司)；電穿孔儀(美國Bio-Rad公司)，胰蛋白胨、酵母提取物(美國Thermo Fisher Scientific公司)。本研究涉及的BMGY、BMMY、LB、YPD培養(yǎng)基，均按照巴斯德畢赤酵母表達(dá)手冊(美國Invitrogen公司)配制。

1.2 方法

1.2.1目的基因的優(yōu)化及重組質(zhì)粒的構(gòu)建 登錄NCBI官網(wǎng)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，查詢到PD-L1基因的cDNA序列(PD-L1 transcript variation1，NM_014143.3)，按照P.pastoris的密碼子使用偏好優(yōu)化基因序列，將序列中不常用的稀有密碼子替換為常用的最優(yōu)密碼子，以提高密碼子適應(yīng)指數(shù)(CAI)，剔除可能會限制mRNA的翻譯、加速mRNA降解的不良序列。將優(yōu)化后的基因序列人工合成，然后插入pPIC9K質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-PDL1。將pPIC9K-PDL1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌XL10-Gold中，參照質(zhì)粒大提試劑盒說明書從大腸桿菌中提取質(zhì)粒。使用PCR鑒定提取到的質(zhì)粒是否含有PD-L1基因，PCR引物為alpha-Factor：5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′，AOX1：5′-GGCAAATGGCATTCTGACATCCT-3′。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后以72 ℃延伸5 min。質(zhì)粒鑒定無誤后使用SacⅠ-HF將質(zhì)粒線性化，線性化的質(zhì)粒使用乙醇沉淀后回收，用于后續(xù)P.pastoris的轉(zhuǎn)化。

1.2.2重組P.pastoris菌株的構(gòu)建與鑒定 將線性化的質(zhì)粒與感受態(tài)P.pastoris菌液混合，設(shè)置電轉(zhuǎn)化參數(shù)：電壓1.5 kV，電容25 μF，電阻200 Ω，電擊時間4～10 ms，進(jìn)行電擊。電擊后的菌液接種至無組氨酸的MD平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d。為了高效篩選高拷貝的重組P.pastoris菌株，將MD平板上的菌落刮下，重懸于無菌水中，稀釋后接種于G418濃度分別為0.5、1.0、2.0、3.0 g/L的YPD平板上，30 ℃培養(yǎng)72～96 h，在G418濃度大于0.5 g/L的平板上挑選菌株進(jìn)行PCR鑒定，以質(zhì)粒pPIC9K-PDL1的PCR產(chǎn)物作為對照。PCR引物和反應(yīng)程序同步驟1.2.1。PCR結(jié)果陽性的菌株送至擎科生物科技有限公司測序，測序結(jié)果與優(yōu)化后的PD-L1基因一致即為重組P.pastoris菌株。

1.2.3重組P.pastoris菌株的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組P.pastoris菌株接種于5 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃下?lián)u床200 r/min培養(yǎng)24 h。然后再將菌株轉(zhuǎn)接至30 mL BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃下?lián)u床200 r/min培養(yǎng)至培養(yǎng)基A600 nm達(dá)到2～6。離心收集菌體，將菌體重懸置于50 mL含有體積分?jǐn)?shù)為0.005甲醇的BMMY培養(yǎng)基，使菌液A600 nm=1，開始誘導(dǎo)表達(dá)。分別于第24、48、72、96、120小時各留取1 mL誘導(dǎo)表達(dá)的培養(yǎng)基上清液備用，并補(bǔ)充甲醇至體積分?jǐn)?shù)為0.005。

1.2.4表達(dá)產(chǎn)物的免疫印跡分析 使用三氯乙酸-丙酮法提取上清液中的蛋白，進(jìn)行蛋白電泳。將電泳后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，先用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05的牛血清白蛋白封閉，使用抗PD-L1單克隆抗體28-8作為一抗，4 ℃孵育過夜。然后使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG作為二抗，室溫孵育1 h，使用化學(xué)發(fā)光底物對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行顯影。使用Image J軟件分析免疫印跡檢測結(jié)果中PD-L1蛋白條帶的灰度值，對蛋白含量進(jìn)行相對定量，尋找上清液中PD-L1含量最高的時間點(diǎn)作為最佳收獲時間。使用Quantity one軟件，建立蛋白marker中各條帶的相對分子質(zhì)量與條帶遷移距離的點(diǎn)對點(diǎn)半對數(shù)曲線，得到蛋白的相對分子質(zhì)量。利用肽和蛋白質(zhì)分子量計算器(https://www.aatbio.com/tools/calculate-peptide-and-protein-mo-lecular-weight-mw)，根據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸序列計算未經(jīng)修飾的PD-L1蛋白的相對分子質(zhì)量。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因的優(yōu)化及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

PD-L1基因優(yōu)化后，基因序列的CAI從0.71升高到0.96，優(yōu)化過程中剔除了53～58位核苷酸的“ATTTA”和528～534位核苷酸的“GGTAAG”序列。優(yōu)化前后的基因序列變化及密碼子使用頻率改變情況見圖1，圖中密碼子的顏色表示該密碼子在P.pastoris中的相對使用頻率。使用頻率低的稀有密碼子用藍(lán)色表示，使用頻率高的最優(yōu)密碼子用紅色表示。與優(yōu)化前的基因序列相比，優(yōu)化后的基因序列中稀有密碼子(藍(lán)色)大部分被最優(yōu)密碼子(紅色)所取代。

重組質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果如圖2A所示，泳道內(nèi)僅出現(xiàn)單一條帶，大小約1 300 bp，與目的基因預(yù)計擴(kuò)增片段的分子量相符，說明目的基因已整合到質(zhì)粒中，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 重組P.pastoris的構(gòu)建與鑒定

挑選了7株菌株，其PCR鑒定結(jié)果如圖2B所示，各菌株的PCR產(chǎn)物在泳道1～2、4～8皆在約1 300 bp處產(chǎn)生單一條帶，條帶大小與泳道9陽性對照(質(zhì)粒pPIC9K-PDL1的PCR產(chǎn)物)相同，初步證明該菌株為重組P.pastoris。菌株的基因測序結(jié)果如圖3所示，箭頭標(biāo)注范圍與優(yōu)化后的PD-L1基因序列一致，確定為重組P.pastoris。

圖中密碼子的顏色表示該密碼子在P.pastoris中的相對使用頻率，顏色越偏向藍(lán)色代表該密碼子在P.pastoris中的使用頻率越低，越偏向紅色則代表使用頻率越高

A：重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果，M為DL2000 marker，1為質(zhì)粒pPIC9K-PDL1的PCR產(chǎn)物；B：重組P.pastoris的PCR鑒定結(jié)果，M為DL2000 plus marker，1～2與4～8為7株重組P.pastoris的PCR產(chǎn)物，3為陰性對照，9為陽性對照(質(zhì)粒pPIC9K-PDL1的PCR產(chǎn)物)

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的免疫印跡分析

選取表達(dá)量相對較高的1株重組P.pastoris菌株，對其培養(yǎng)基上清液進(jìn)行免疫印跡檢測，結(jié)果如圖4，重組PD-L1可以與抗PD-L1抗體特異性結(jié)合。其中，誘導(dǎo)第24小時的培養(yǎng)基上清液中未檢測到PD-L1蛋白。第72小時培養(yǎng)基上清液中蛋白含量達(dá)到高峰，在第96小時蛋白含量下降。第72、96、120小時的表達(dá)量分別是第48小時的2.14、0.39、0.23倍。經(jīng)Quantity one軟件計算，重組PD-L1蛋白的相對分子質(zhì)量約為44 700。經(jīng)肽和蛋白質(zhì)分子量計算器計算，PD-L1蛋白未經(jīng)修飾狀態(tài)下的相對分子質(zhì)量為33 275。

箭頭標(biāo)注范圍內(nèi)的序列與優(yōu)化后的PD-L1基因序列一致，說明菌株為攜帶PD-L1基因的重組P.pastoris

M為marker，1～5為誘導(dǎo)表達(dá)第24、48、72、96、120小時的培養(yǎng)液上清液中PD-L1蛋白的表達(dá)

3 討 論

PD-L1是由290個氨基酸組成的Ⅰ型跨膜蛋白，其結(jié)構(gòu)包括胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域[8]。PD-1、抗PD-L1單抗結(jié)合于PD-L1胞外結(jié)構(gòu)域中的IgV結(jié)構(gòu)域[8]。由于以往的研究大多關(guān)注PD-L1與PD-1、抗PD-L1胞外結(jié)構(gòu)域抗體的結(jié)合，所以目前商品化的PD-L1主要為PD-L1蛋白的第19～238位氨基酸，即去掉N末端肽的胞外結(jié)構(gòu)域，有關(guān)PD-L1蛋白表達(dá)的研究也多集中于此結(jié)構(gòu)域。而最近的研究顯示，PD-L1的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)可降低干擾素對腫瘤細(xì)胞的毒性，而此過程不依賴于PD-L1胞外結(jié)構(gòu)域與PD-1間的結(jié)合[14]；在免疫組織化學(xué)(IHC)檢測中，檢測PD-L1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域或胞外結(jié)構(gòu)域都可以反映病人預(yù)后，兩者的結(jié)果具有一致性[15]。故本研究表達(dá)的PD-L1蛋白具有胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和胞外結(jié)構(gòu)域，比起僅具有胞外結(jié)構(gòu)域的PD-L1蛋白，其可以更廣泛地應(yīng)用于科研領(lǐng)域。

現(xiàn)有商品化PD-L1蛋白主要來源于人胚腎細(xì)胞HEK 293細(xì)胞系，作為哺乳動物細(xì)胞系，HEK 293表達(dá)的人源蛋白與天然蛋白更接近，但是由于培養(yǎng)條件苛刻，使用HEK 293細(xì)胞系表達(dá)人PD-L1蛋白需要承擔(dān)高昂的生產(chǎn)成本。截至目前，已有凝血因子ⅩⅢa、干擾素α2b、人免疫球蛋白G的CH2結(jié)構(gòu)域等多個人源蛋白在P.pastoris中成功表達(dá)并經(jīng)驗證具有生物活性[16-18]，并且P.pastoris的營養(yǎng)要求低，可以利用甲醇誘導(dǎo)實現(xiàn)高密度發(fā)酵，相比哺乳動物細(xì)胞，可大大減少蛋白的生產(chǎn)成本。有學(xué)者曾探索使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得人PD-L1蛋白[12]，由于大腸桿菌缺乏支持蛋白折疊的細(xì)胞器，其表達(dá)的PD-L1以包涵體形式存在于細(xì)胞內(nèi)，需要通過多步的復(fù)性才能得到有活性的PD-L1。天然的PD-L1具有N35、N192、N200和N219四個N糖基化位點(diǎn)。這些糖基化位點(diǎn)位于IgC和IgV樣結(jié)構(gòu)域位置[8]，對于PD-1和PD-L1的相互作用至關(guān)重要[19]；IgC和IgV還是PD-L1 IHC抗體22C3和28-8的結(jié)合部位，去除N糖基化的PD-L1與抗PD-L1間的親和性下降[20]，所以，使用大腸桿菌來源的重組PD-L1免疫動物后，得到的抗體與人源PD-L1親和性不高[19,21]。而P.pastoris作為真核生物，含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，可以對蛋白進(jìn)行折疊和翻譯后的修飾。本研究表達(dá)的人PD-L1全長蛋白的相對分子質(zhì)量約為44 700，與45 000的腫瘤細(xì)胞來源的PD-L1[19]相對分子質(zhì)量相似。而通過氨基酸序列計算得出的人PD-L1蛋白的相對分子質(zhì)量為33 275，因此認(rèn)為兩者的相對分子質(zhì)量差異來源于蛋白質(zhì)翻譯后的加工修飾。關(guān)于PD-L1蛋白免疫原性的探討，我們計劃在后續(xù)的研究中使用PD-L1蛋白免疫羊駝，驗證蛋白的免疫原性，進(jìn)一步篩選抗PD-L1納米抗體。

優(yōu)化編碼目的蛋白基因是提高外源蛋白表達(dá)量的策略之一[22-23]。CAI可以反映目的基因密碼子與表達(dá)系統(tǒng)偏好的密碼子相對使用頻率的符合程度[24]，本研究按照P.pastoris表達(dá)系統(tǒng)的偏好，在保證重組蛋白氨基酸序列不變的情況下，對目的基因進(jìn)行優(yōu)化，使CAI從0.71提高到0.96。本研究還在優(yōu)化的過程當(dāng)中剔除了可能導(dǎo)致mRNA降解的“ATTTA”序列[25]，和可能導(dǎo)致mRNA降解和基因沉默的“GGTAAG”序列[26-27]，以保證目的基因轉(zhuǎn)錄和目的蛋白翻譯效率。

誘導(dǎo)表達(dá)不同時間點(diǎn)的目的蛋白的相對含量分析顯示，重組P.pastoris菌株誘導(dǎo)表達(dá)的72 h內(nèi)，上清液中蛋白含量呈上升趨勢，第96小時則檢測到蛋白含量下降。后續(xù)可在誘導(dǎo)表達(dá)的第72小時收集培養(yǎng)基上清液，以實現(xiàn)蛋白產(chǎn)量的最大化。誘導(dǎo)后期上清液中蛋白含量下降，可能是由于發(fā)酵過程中細(xì)胞密度過高，部分細(xì)胞裂解，胞內(nèi)蛋白水解酶釋放而導(dǎo)致PD-L1的降解。針對這一問題，在后續(xù)的研究中可向培養(yǎng)基中添加合適的蛋白酶抑制劑和蛋白酶水解底物，以減少蛋白的降解。另外，可將菌株接種于發(fā)酵罐，優(yōu)化pH、溫度等發(fā)酵條件[28-29]，為菌株提供更穩(wěn)定、更適宜的生長環(huán)境，以進(jìn)一步提高蛋白的表達(dá)量。