腫瘤骨轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成機(jī)制研究進(jìn)展

唐亮 康輝 呂成偉 郭振海

(1 聯(lián)勤保障部隊(duì)第989醫(yī)院骨科,河南 洛陽 471100； 2 河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科)

腫瘤轉(zhuǎn)移前的微環(huán)境是指繼發(fā)轉(zhuǎn)移部位的組織或器官提前發(fā)生的局部細(xì)胞與分子的改變，為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)定植提供了環(huán)境支持，促進(jìn)了腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。腫瘤患者的病死率與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，骨骼為較常見的腫瘤轉(zhuǎn)移部位。腫瘤骨轉(zhuǎn)移后會出現(xiàn)病理性骨折、中樞及周圍神經(jīng)壓迫等一系列嚴(yán)重并發(fā)癥。在CTCs進(jìn)入轉(zhuǎn)移部位時，局部的微環(huán)境決定了腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的進(jìn)程。因此，轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的建立，是啟動腫瘤轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制。

1 腫瘤微環(huán)境中原發(fā)腫瘤來源成分

原發(fā)腫瘤分泌的可溶性分子是腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中的重要組成部分，主要包括腫瘤源性分泌因子(TDSFs)、細(xì)胞外囊泡(EVs)、細(xì)胞因子以及趨化因子等。

1.1 TDSFs

TDSFs可通過動員和招募骨髓細(xì)胞，促進(jìn)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成。如缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)通過激活乳腺癌細(xì)胞的碳酸酐酶Ⅸ-NF-κB-粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)通路，增加G-CSF的產(chǎn)生，從而動員骨髓來源抑制性細(xì)胞(MDSCs)，促進(jìn)MDSCs到達(dá)轉(zhuǎn)移部位而形成轉(zhuǎn)移前微環(huán)境[1]。TDSFs不僅可以動員和招募骨髓來源的細(xì)胞(BMDCs)，還可促使BMDSs定植于腫瘤繼發(fā)轉(zhuǎn)移的組織或器官。

1.2 EVs

根據(jù)EVs直徑大小可分為3類：直徑≥30 nm而<100 nm被稱為外泌體，直徑≥100 nm而<1 000 nm的被稱為微囊泡，直徑1～10 μm的被稱為癌小體[2]。外泌體包含有蛋白、mRNA、miRNA及DNA的片段，通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞與周圍組織的相互作用，促進(jìn)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成。原發(fā)腫瘤來源的外泌體所表達(dá)的整合素，可通過與相關(guān)細(xì)胞融合，激活Src蛋白磷酸化及增加促炎性因子S100的表達(dá)，而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成[3]。前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移率比較高，其來源的外泌體包含有多種microRNA(miR100-5p、miR21-5p、miR139-5p)，這些microRNA協(xié)同性地促進(jìn)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成[4]。外泌體中含有的DNA片段，還可有助于判斷原發(fā)腫瘤的突變程度，在臨床上可作為診斷和判斷預(yù)后的生物標(biāo)記物[5]。原發(fā)腫瘤來源的微囊泡能通過對腫瘤細(xì)胞與機(jī)體之間進(jìn)行調(diào)節(jié)而促進(jìn)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成，微囊泡中的骨調(diào)素(OPN)可以動員BMDSs，還可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的定植；另外該微囊泡還能通過磷酸化內(nèi)皮細(xì)胞的絲氨酸/蘇氨酸，進(jìn)而促進(jìn)新生血管在微環(huán)境中的生成，不僅促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的侵襲，同時也對化療藥物具有一定的抵抗作用[6]。癌小體包含有金屬蛋白酶、RNA、微囊蛋白等成分，其中微囊蛋白可以促使前列腺癌細(xì)胞向癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)miR-1227，促進(jìn)CAFs向轉(zhuǎn)移部位遷移而逐步形成轉(zhuǎn)移前微環(huán)境。因此，有轉(zhuǎn)移傾向的腫瘤細(xì)胞可通過癌小體改造繼發(fā)轉(zhuǎn)移組織或器官的微環(huán)境，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[7]。

1.3 細(xì)胞因子與趨化因子

腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，在轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成中也起著重要作用。如趨化因子CCL2可以招募腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞(TAMs)以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)在轉(zhuǎn)移部位形成與免疫相關(guān)的轉(zhuǎn)移前微環(huán)境[8]。在乳腺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的過程中，乳腺癌細(xì)胞釋放的核苷酸(ATP/UTP)，可通過調(diào)節(jié)賴氨酰氧化酶以及單核細(xì)胞的招募，進(jìn)一步激活嘌呤受體(P2Y2)而促進(jìn)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成[9]。

2 腫瘤動員的骨髓細(xì)胞

在轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的建立中，腫瘤動員的骨髓細(xì)胞發(fā)揮了重要作用。其可通過分泌炎性因子、生長因子以及促血管生成因子等成分，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的定植、增殖以及轉(zhuǎn)移[10]。如腫瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和胎盤生長因子(PIGF)，可動員和招募骨髓中表達(dá)VEGF受體1(VEGFR-1)的造血前體細(xì)胞，到達(dá)繼發(fā)轉(zhuǎn)移的組織或器官，從而形成轉(zhuǎn)移前微環(huán)境[11]。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的趨化因子以及細(xì)胞因子，可以動員MDSCs、TAMs、Treg以及腫瘤相關(guān)的中性粒細(xì)胞等骨髓細(xì)胞，進(jìn)入繼發(fā)的組織或器官，而形成轉(zhuǎn)移前微環(huán)境[12]。由TAMs分泌的趨化因子CCL22以及由調(diào)節(jié)性B淋巴細(xì)胞(Breg)分泌的TGF-β，可以招募Treg至轉(zhuǎn)移前微環(huán)境[13]。在乳腺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的機(jī)制中，通過趨化因子CXCL12/CXCR4通路調(diào)控了Treg的聚集和增殖[14]。相關(guān)研究還表明，由IL-1β誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17和中性粒細(xì)胞共同形成的微環(huán)境，也是促進(jìn)乳腺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一[15]。

3 骨基質(zhì)微環(huán)境

骨基質(zhì)微環(huán)境主要包括成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血管等成分，在組織間連接和維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用。腫瘤細(xì)胞可以通過改造骨基質(zhì)，建立有利于其定植并形成轉(zhuǎn)移灶的微環(huán)境。成纖維細(xì)胞在轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中可以產(chǎn)生炎性因子和生長因子，招募和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的定植，如基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(SDF1)、TGF-β、鈣結(jié)合蛋白A4(S100A4)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)以及纖維連接蛋白[16]。內(nèi)皮細(xì)胞則產(chǎn)生了促炎因子S100A8和S100A9，其可招募Mac-1+的髓樣細(xì)胞到達(dá)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境[17]。在腫瘤骨轉(zhuǎn)移過程中，動員和招募的破骨細(xì)胞起著重要作用，腫瘤分泌的可溶性細(xì)胞內(nèi)黏附分子1(slCAM1)，可促進(jìn)破骨細(xì)胞mircoRNA(miR-16、miR-378)的產(chǎn)生和破骨細(xì)胞的生成[18]。細(xì)胞外基質(zhì)的改造與重塑中產(chǎn)生的纖維連接蛋白、MMP、骨膜蛋白等成分，也對腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成起著重要作用[19]。

4 轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成過程

轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成的具體過程包括免疫抑制過程、炎性反應(yīng)階段、血管形成以及通透性增加、淋巴管的形成、器官傾向性的產(chǎn)生等。

4.1 免疫抑制過程

機(jī)體內(nèi)的免疫細(xì)胞，如CD8+T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK)、單核細(xì)胞等，具有殺傷腫瘤細(xì)胞及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的功能[20]。腫瘤細(xì)胞為躲避免疫系統(tǒng)的攻擊，建立了能抑制免疫清除的微環(huán)境。如MDSCs、TAMs、Treg等細(xì)胞，均在轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和免疫抑制作用[21]。MDSCs聚集在轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中通過精氨酸酶1(ARG1)和活性氧(ROS)發(fā)揮抑制T細(xì)胞的作用，另外在原發(fā)腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的Breg促進(jìn)作用下，MDSCs還可以產(chǎn)生更多的ROS以及一氧化氮，進(jìn)一步發(fā)揮免疫抑制作用[22]。在發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的腫瘤中，可以觀察到骨髓中聚集有大量的Treg，抑制免疫系統(tǒng)，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤骨轉(zhuǎn)移[23]。因此，腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中，免疫抑制過程主要是通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，尤其是抑制殺傷性T細(xì)胞對腫瘤的消滅作用，而起到促進(jìn)腫瘤向骨組織轉(zhuǎn)移的作用。

4.2 炎癥反應(yīng)

慢性炎癥是腫瘤發(fā)展以及轉(zhuǎn)移的一個重要因素，許多分子成分和信號通路參與其中，如異常激活Toll樣受體4(TLR4)以及其他在免疫細(xì)胞上固有的感受器，均對腫瘤的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用[24]。S100A4可通過激活TLR4和NF-κB通路而誘導(dǎo)免疫細(xì)胞表達(dá)血清淀粉樣蛋白(SA)A1與SAA3，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成[12]。因此，在繼發(fā)轉(zhuǎn)移的組織或器官中建立的炎性環(huán)境，可以有助于腫瘤細(xì)胞的定植和存活，最后形成轉(zhuǎn)移病灶。

4.3 血管形成與通透性增加

轉(zhuǎn)移前微環(huán)境可以促進(jìn)血管的形成與通透性的增加，以促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。在轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中，招募促血管生成素受體TIE2+的單核細(xì)胞以及內(nèi)皮前體細(xì)胞，形成了具有血管內(nèi)皮生長因子(VEGFs)和其他血管生成因子較高含量的微環(huán)境，可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[25]。目前研究發(fā)現(xiàn)黑色素瘤來源的外泌體可增加血管的通透性，還具有促進(jìn)骨髓來源的前體細(xì)胞向促血管生成方向分化的作用，是黑色素瘤轉(zhuǎn)移的兩個促進(jìn)因素[26]。在轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中，乳腺癌細(xì)胞所分泌的miR-105可抑制細(xì)胞緊密連接蛋白1的合成，從而破壞血管內(nèi)皮屏障，增加血管的通透性[27]。

4.4 淋巴管的形成

淋巴管因其中的淋巴液流速較慢，且具有一定的通透性，在轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中也具有重要作用。淋巴管的形成和腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并且淋巴管是腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的最初路徑。腫瘤來源的VEGF-A以及VEGF-D在局部淋巴結(jié)中誘導(dǎo)淋巴管形成，并且與較高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率發(fā)生密切相關(guān)[28]。轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中淋巴管形成后，通過淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的因子，和招募未成熟的樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞，對于腫瘤的遷移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和免疫抑制發(fā)揮著重要作用[29]。在轉(zhuǎn)移前淋巴結(jié)中，黑色素瘤來源的外泌體與被膜下淋巴竇中CD169+的巨噬細(xì)胞發(fā)生融合，從而逃離了免疫攻擊，進(jìn)而進(jìn)入淋巴結(jié)內(nèi)，并與其中的B淋巴細(xì)胞共同形成促腫瘤的微環(huán)境[30]。

5 器官傾向性

器官傾向性是轉(zhuǎn)移前微環(huán)境所固有的一種特性，不同類型的腫瘤有特異性的轉(zhuǎn)移傾向，原發(fā)腫瘤對于選定的轉(zhuǎn)移部位，通過TDSFs改造轉(zhuǎn)移部位微環(huán)境，使CTCs更容易定植及發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶。如在骨形成的轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中發(fā)現(xiàn)有異常黏附成分，可促進(jìn)乳腺癌早期的播散并進(jìn)一步發(fā)生骨轉(zhuǎn)移[31]。前列腺癌細(xì)胞所表達(dá)的NF-κB受體激活因子通過活化RANK/RANKL通路，可以特異性地在骨組織中建立轉(zhuǎn)移前微環(huán)境[32]。通過腫瘤細(xì)胞表達(dá)的CD146通過CXCL12/CXCR4通路，調(diào)控骨組織脈管系統(tǒng)周圍的間充質(zhì)干細(xì)胞，使得黑色素瘤具有骨轉(zhuǎn)移的傾向[33]。因此，在不同腫瘤的轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中含有不同的分子成分，對于腫瘤轉(zhuǎn)移的器官傾向性起著重要作用。

6 重組過程

代謝的重組、基質(zhì)的重組以及表觀遺傳的重組均參與了腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成[34]。腫瘤細(xì)胞可以招募并且重組基質(zhì)細(xì)胞，以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的播散和轉(zhuǎn)移。在乳腺癌中，基質(zhì)細(xì)胞的重組主要是通過熱休克因子1，致使CAFs轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化。腫瘤細(xì)胞還可以激活TGF-β和SDF-1通路促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[34]。腫瘤細(xì)胞來源的外泌體，還可以在轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中改造基質(zhì)細(xì)胞代謝。如乳腺癌細(xì)胞來源的囊泡中富含miR-122，其可以通過降低糖代謝相關(guān)酶的活性抑制微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞對糖的攝取[35]，因此miR-122也可以作為預(yù)示乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)記物。

7 轉(zhuǎn)移前微環(huán)境參與腫瘤轉(zhuǎn)移的過程

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個時空順序的病理事件，大致可分為以下幾個階段。

7.1 初始階段

在此過程中原發(fā)腫瘤處于一個過度增殖期，同時其周圍環(huán)境處于一種炎癥伴缺氧狀態(tài)，使得原發(fā)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生大量的TDSFs及EVs等多種成分，這些成分可以動員BMDCs及多種免疫抑制細(xì)胞到達(dá)轉(zhuǎn)移的組織或器官，以利于腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。此過程是轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成的初始階段，尚不完全具備接受CTCs定植的條件。

7.2 進(jìn)展階段

此階段轉(zhuǎn)移前微環(huán)境較為成熟，原發(fā)腫瘤的轉(zhuǎn)移過程逐步開始，此時仍不斷有原發(fā)腫瘤動員來到微環(huán)境的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞、TDSFs、EVs以及受其調(diào)節(jié)的BMDCs等成分。此階段對于轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的改造，無論在持續(xù)作用時間還是作用強(qiáng)度方面，均已具備接收CTCs定植的條件。如誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的重塑、激活的整合素以及趨化因子已經(jīng)將繼發(fā)轉(zhuǎn)移的組織或器官改造為適合腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生的環(huán)境。在細(xì)胞外基質(zhì)的改造過程中，IL-1β及MDSCs可以使腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，增加腫瘤細(xì)胞侵入轉(zhuǎn)移部位的能力[36]。

7.3 轉(zhuǎn)移啟動階段

經(jīng)歷了原發(fā)腫瘤細(xì)胞對微環(huán)境的影響，成熟的轉(zhuǎn)移前微環(huán)境已經(jīng)建立，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移逐步開始發(fā)生，此時CTCs離開血管、淋巴管，定植于轉(zhuǎn)移微環(huán)境。在轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中大量存在的HIF-1可通過VEGF以及血小板來源生長因子(PDGF)增加對腫瘤細(xì)胞的招募作用[37]。如果患者接受了化療、手術(shù)以及其他抗腫瘤治療，進(jìn)入微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞大多處于休眠狀態(tài)，待條件成熟后再繼續(xù)增長形成轉(zhuǎn)移灶。相關(guān)研究表明，在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生過程中，外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)的miR-23b可以通過抑制靶基因MARCKS，而使腫瘤細(xì)胞進(jìn)入休眠狀態(tài)[38]。一些促進(jìn)轉(zhuǎn)移的因素，如免疫抑制以及細(xì)胞外基質(zhì)的重塑，可以協(xié)助腫瘤細(xì)胞逃脫機(jī)體的攻擊，而進(jìn)入休眠狀態(tài)[39]。因此，已經(jīng)建立的轉(zhuǎn)移前微環(huán)境，對于腫瘤細(xì)胞的定植、增殖、存活以及逐步發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶提供了必要的支持。

7.4 轉(zhuǎn)移灶形成

此過程中腫瘤細(xì)胞離開原發(fā)部位定植于微環(huán)境中的數(shù)量逐漸增多，微環(huán)境中的各種細(xì)胞因子可以直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，因此，腫瘤的轉(zhuǎn)移灶逐漸形成。如在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移過程中，骨組織微環(huán)境中異常表達(dá)的血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1(VCAM-1)可促使乳腺癌細(xì)胞在骨組織中增長，最終導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)移病灶的形成[40]。同時原發(fā)腫瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的分泌蛋白等成分，也會進(jìn)一步促進(jìn)轉(zhuǎn)移灶的形成。某些蛋白的表達(dá)水平可以為腫瘤骨轉(zhuǎn)移提供一定的參考，如患者血清中升高的slCAM1及miR-16/miR-378，與骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生關(guān)系密切[18]。

骨組織是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的高發(fā)部位，腫瘤在發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的過程中，骨微環(huán)境的變化起到了關(guān)鍵作用。因此，了解腫瘤骨轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成的機(jī)制，對骨微環(huán)境進(jìn)行監(jiān)測和干預(yù)，可為在腫瘤未出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移病灶時，提供早期預(yù)警，為預(yù)防腫瘤的骨轉(zhuǎn)移發(fā)生。在治療腫瘤骨轉(zhuǎn)移的過程中，針對骨微環(huán)境的關(guān)鍵蛋白進(jìn)行干預(yù)，有望與其他治療產(chǎn)生協(xié)同作用，提高治療效果。