CENPK基因過表達對乳腺癌細胞增殖及遷移能力的影響

楊曉玲，何大保，陳 塵，匡文斌，張勇剛

(1.深圳市寶安區(qū)松崗人民醫(yī)院 檢驗科，廣東 深圳 518105；2.深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗科)

乳腺癌在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率極高，也是導(dǎo)致女性癌癥死亡的重要原因[1]。與多數(shù)國家相似，乳腺癌在國內(nèi)的發(fā)病率居于女性惡性腫瘤的首位，中國乳腺癌病例數(shù)量占所有新診斷的惡性腫瘤的12.2%，死亡率占世界總死亡率的9.6%[2]。乳腺癌多發(fā)于40歲以上的女性，僅對4%-6%的40歲以下的年輕女性有影響[3]。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是涉及到多種細胞類型的多步驟過程，目前而言，加強早期篩查是預(yù)防乳腺癌發(fā)生的最佳手段。有研究指出，對于發(fā)達地區(qū)而言，早期預(yù)防得當?shù)娜橄侔┗颊呶迥晟媛矢哌_80%[4]。而對于中晚期的患者而言，臨床多采用手術(shù)治療、放射治療、化療治療、內(nèi)分泌治療以及免疫靶向治療的手段進行。大量的研究指出，多種細胞因子、miRNAs、LncRNAs以及信號通路均是乳腺癌治療的潛在靶點[5]。著絲粒是真核生物的染色體位點，在有絲分裂和減數(shù)分裂過程中使動粒形成并附著在紡錘體微管上，參與調(diào)控染色體分離[6]。著絲粒蛋白基因K(CENPK)是著絲粒家族的一員，位于5q12.3染色體上，由269個核苷酸構(gòu)成。最新的研究也發(fā)現(xiàn)，CENPK在卵巢癌、肝細胞癌以及肺腺癌等多種惡性腫瘤中異常表達，并與患者的不良預(yù)后有關(guān)[7]。本次實驗探究過表達CENPK基因?qū)θ橄侔┘毎礛CF-7細胞體外增殖和侵襲的影響，并探究其調(diào)控機制，具體內(nèi)容如下。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人乳腺癌細胞系MCF-7細胞、人正常乳腺上皮細胞系MCF-10A細胞均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫(Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences，Shanghai，China)。將MCF-7、MCF-10細胞分別放置于含有10%胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(Thermo Fisher Scientific，MA，USA)和1%青霉素/鏈霉素(Invitrogen，CA，USA)的培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2條件下3天換液1次。0.25%的胰蛋白酶(Thermo Fisher HyClone，Utah，USA)消化傳代，取對數(shù)生長期的MCF-7細胞，以5×106個/孔種植于6孔板中，取穩(wěn)定生長的細胞按FuGENE○RHD Transfection Reagent(Roche,Shanghai，China)的說明書將CENPK過表達質(zhì)粒及空白對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MCF-7細胞中，再將轉(zhuǎn)染后的細胞繼續(xù)37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，取穩(wěn)定生長的細胞進行后續(xù)實驗。

1.2 CCK8法(Cell Counting Kit-8，CCK8)檢測細胞增殖能力

取經(jīng)上述方法轉(zhuǎn)染了CENPK過表達質(zhì)粒及空白對照質(zhì)粒的MCF-7細胞，用胰蛋白酶消化后調(diào)整細胞密度為2×103，接種于96孔板中。加入200 μl的DMEM(Thermo Fisher Scientific，Inc.)培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞生長至50%融合時，更換成無血清培養(yǎng)基，24 h后加入血清。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，向每孔中加入10 μl的CCK8溶液(Beyotime Biotechnology，Shanghai，China)，按CCK8說明書測量不同時間(24 h、48 h、72 h)下MCF-7細胞在波長為450 nm的吸光度值。

1.3 qRT-PCR實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)

采用TRIzol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)和用PrimeScript-RT Kit(Madison，WI，USA)將MCF-7細胞內(nèi)總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用SYBR GreenPCR試劑(MedChemExpress，NJ,USA)和ABI7500FAST Real-Time PCR儀(Applied Biosystems,SanFrancisco，CA，United States)以2-ΔΔCt方法[8]評估用GAPDH作為標準化內(nèi)參后CENPK基因的mRNA表達。具體引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 Transwell檢測細胞遷移

取對數(shù)生長期的經(jīng)不同處理的MCF-7細胞，按2×104個/孔加入Transwell上室，下室中加600 μl的含20%FBS的培養(yǎng)液，37℃條件下培養(yǎng)。12 h后去除上室細胞，用4%多聚甲醛固定下室細胞，0.1%的結(jié)晶紫染色，晾干后拍照并計數(shù)。

1.5 Western Blot檢測AKT/MDM2/TP53信號通路的蛋白表達

取2×106個經(jīng)不同轉(zhuǎn)染處理的MCF-7細胞，冷PBS洗滌3次后，加入裂解液(RIPA)裂解各組細胞，BCA法測定上清液中的蛋白濃度。取50 g總蛋白凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。再用5%的脫脂奶粉封閉2 h后，用0.05%的緩沖液(TBST)洗細胞3次。與購自Abcam、MA、USA，濃度為1∶1 000的AKT(ab8805)、p-AKT(ab38449)、MDM2(ab16895)、p-MDM2(ab170880)、TP53(ab26)、p-TP53(ab33889)、β-actin(ab115777)一抗在4℃下孵育過夜，TBST洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的濃度為1∶3 000的抗兔二抗孵育1 h。TBST再次洗膜3次后用Western blot專用試劑(Invitrogen公司)顯色成像，Image J分析灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CENPK基因在乳腺癌細胞及組織中高表達

如圖1所示，通過查閱癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫，對比1 085例腫瘤組織標本和291例正常組織中CENPK基因的表達，發(fā)現(xiàn)CENPK在乳腺癌組織中的表達顯著高于正常組織(P<0.05)。圖2的結(jié)果顯示，乳腺癌MCF-7細胞內(nèi)的CENPK基因的表達明顯高于正常乳腺上皮細胞系MCF-10A細胞(P<0.05)。

圖1 CENPK基因在乳腺癌組織及癌旁正常組織中的表達*P<0.05(與癌旁正常組織相比)

圖2 CENPK基因在乳腺癌細胞及正常乳腺上皮細胞中的表達*P<0.05(與正常乳腺上皮細胞系MCF-10細胞相比)

2.2 轉(zhuǎn)染CENPK過表達質(zhì)粒對MCF-7細胞內(nèi)CENPK基因表達的影響

向MCF-7細胞中轉(zhuǎn)染CENPK過表達質(zhì)粒，qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)染效率，如圖3所示，與空白對照組(vector)相比，轉(zhuǎn)染了CENPK過表達質(zhì)粒的CENPK組的CENPK基因表達顯著上調(diào)(P<0.05)。

圖3 CENPK基因在MCF-10細胞中的表達*P<0.05(與空白對照組vector相比)

2.3 過表達CENPK對乳腺癌細胞增殖的影響

采用CCK8法檢測不同時間下(0、24 h、48 h、72 h)經(jīng)不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MCF-7細胞在波長為450 nm的吸光度值，如圖4所示，與空白對照組vector相比，過表達CENPK顯著誘導(dǎo)了乳腺癌MCF-7細胞的增殖(P<0.05)。

圖4 CENPK基因?qū)CF-7細胞增殖的影響**P<0.01(與空白對照組vector相比)

2.4 過表達CENPK對乳腺癌細胞遷移的影響

為了探究過表達CENPK對乳腺癌細胞遷移的影響，采用Transwell法檢測經(jīng)不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MCF-7細胞的遷移能力，結(jié)果如圖5、圖6所示，與空白對照組vector相比，過表達CENPK顯著促進乳腺癌MCF-7細胞的遷移(P<0.05)。

圖5 CENPK基因MCF-7細胞遷移的影響

圖6 CENPK基因MCF-7細胞遷移的影響***P<0.001(與空白對照組vector相比)

2.5 過表達CENPK激活A(yù)KT、MDM2，抑制TP53

為了進一步探究CENPK過表達促進細胞增殖和遷移的潛在機制，采用Western Blot檢測MCF-7細胞內(nèi)AKT/MDM2/TP53信號通路及其磷酸化的蛋白表達，結(jié)果如圖7所示，與vector組相比，過表達CENPK激活了AKT和MDM2的磷酸化，抑制了TP53的磷酸化。

圖7 過表達CENPK對AKT/MDM2/TP53通路的影響

3 討論

乳腺癌是全球范圍內(nèi)常見的癌癥之一，也是女性癌癥的第二大死亡因素[9]。作為一種復(fù)雜的異質(zhì)性疾病，乳腺癌是由多種危險因素造成的，包括女性患者的年齡、種族、初潮史、乳房特征、生殖模式、激素使用情況、吸煙飲酒史、體力勞動以及生活習(xí)慣等[10]。對于已經(jīng)確診為乳腺癌患者，臨床治療的目的在于延長患者的生存周期，提高患者的生活質(zhì)量。先前的研究證實，處方藥洛巴鉑(Loubo)和培美曲塞治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的療效尚可[11]，但不良反應(yīng)也較為明顯，且治療成本相對較高。最新的研究表明，乳腺癌的進展與包括BRCA 1以及p53等腫瘤易感基因在內(nèi)的多種分子活性的失調(diào)有關(guān)[12]，靶向分子療法通過糾正與乳腺癌進展有關(guān)的分子畸形，顯著抑制乳腺癌的疾病進展，抑制腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲能力[13]。本次實驗探究CENPK基因?qū)θ橄侔┘毎w外增殖及遷移和影響，并深入探索其調(diào)控機制，希望為乳腺癌的臨床治療提供新的思路。

CENPK是著絲粒蛋白家族中的一員，在真核生物的染色體分離過程中扮演重要角色[14]。一些學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)了CENPK在多種惡性腫瘤中高表達，且促進了腫瘤進展。Wang等[15]指出，CENPK基因在肝細胞癌組織中的表達明顯較癌旁正常組織偏高，過表達CENPK促進了肝癌細胞的增殖、遷移、侵襲以及上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，下調(diào)CENPK基因的表達且能逆轉(zhuǎn)肝癌的惡性進展。本次研究通過查閱TCGA數(shù)據(jù)庫，對比1085例腫瘤組織標本和291例正常組織中CENPK基因的表達，發(fā)現(xiàn)CENPK在乳腺癌組織中的表達顯著高于正常組織(P<0.05)。此外，qRT-PCR實驗的結(jié)果也表明，乳腺癌MCF-7細胞內(nèi)的CENPK基因的表達明顯高于正常乳腺上皮細胞系MCF-10A細胞(P<0.05)，提示CENPK基因在乳腺癌中作為原癌基因存在，與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展高度相關(guān)。CCK8實驗和Transwell實驗的結(jié)果表明，過表達CENPK顯著誘導(dǎo)了乳腺癌細胞系MCF-7細胞的增殖和遷移，這也與Komatsu等人[16]的實驗結(jié)果相符。眾所周知，染色體畸變是惡性腫瘤的重要特征，可有效識別與惡性腫瘤相關(guān)的DNA擴增或染色體缺失導(dǎo)致的癌變[17]。CENPK基因的上調(diào)使得染色體有絲分裂和減數(shù)分裂過程異常，過表達CENPK導(dǎo)致著絲粒異染色質(zhì)沿著色體臂擴散，造成微管動粒錨定缺陷[18]，最終引起基因組失衡，體外誘導(dǎo)乳腺癌細胞系MCF-7細胞增殖和遷移，加速腫瘤進展。

為了進一步探究CENPK過表達促進細胞增殖和遷移的潛在分子調(diào)控機制，本次實驗采用Western Blot檢測MCF-7細胞內(nèi)AKT/MDM2/TP53信號通路及其磷酸化的蛋白表達，發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染了空白質(zhì)粒的vector組相比，過表達CENPK激活了AKT和MDM2的磷酸化，抑制TP53的磷酸化。Chibaya等人[19]通過研究發(fā)現(xiàn)，Mdm2絲氨酸殘基183的DNA損傷效應(yīng)激酶AKT磷酸化增加了核MDM2基因的穩(wěn)定性，并下調(diào)了TP53的磷酸化水平，AKT/MDM2/TP53信號通路通過調(diào)控氧化應(yīng)激應(yīng)答促進腫瘤細胞增殖和疾病進展。作為細胞增殖和腫瘤生長的重要調(diào)控機制，探究CENPK基因?qū)KT/MDM2/TP53信號通路的影響可進一步證實該基因在對乳腺癌細胞體外增殖和遷移的促進效應(yīng)。本次研究中，過表達CENPK激活A(yù)KT/MDM2的磷酸化，抑制TP53的磷酸化水平，證實了CENPK通過調(diào)控AKT/MDM2/TP53信號通路促進腫瘤細胞增殖和遷移，介導(dǎo)乳腺癌惡性進展，這也與Wang等人[20]實驗結(jié)論相似。

綜上所述，本次研究揭示了CENPK基因在乳腺癌中作為原癌基因存在，在乳腺癌組織和細胞中高表達，過表達CENPK顯著促進了乳腺癌細胞的體外增殖和遷移，相關(guān)的機制實驗表明，CENPK在乳腺癌中的促癌作用是通過調(diào)控AKT/MDM2/TP53信號通路的磷酸化水平來發(fā)揮效應(yīng)。本次實驗提示CENPK基因或許是乳腺癌治療的潛在靶點，為后續(xù)的研究和臨床治療提供的新的分子靶點和理論依據(jù)。然而，本次研究也存在一定的不足之處，比如未經(jīng)動物實驗及臨床病理研究驗證CENPK基因在活體中的作用效果是否與體外實驗相似，后續(xù)會進一步探究。