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    胎羊體外循環(huán)術(shù)后心臟和胎盤的代謝組學(xué)變化

    2022-06-24 08:50:08吳文濤黃冰鑫李慧麗譚劍鋒李曉紅周成斌
    中國體外循環(huán)雜志 2022年3期
    關(guān)鍵詞:代謝物組學(xué)胎盤

    吳文濤,滕 云,田 苗,黃冰鑫,李慧麗,譚劍鋒,李曉紅,周成斌

    復(fù)雜先天性心臟病是我國新生兒和嬰幼兒死亡的主要原因之一。一些復(fù)雜先天性心臟病是由相對簡單的原發(fā)病變發(fā)展而來,若能在胎兒期進(jìn)行手術(shù)干預(yù),則可阻止其向復(fù)雜畸形轉(zhuǎn)變,心臟也能在宮內(nèi)得到再次發(fā)育的機(jī)會。實(shí)施胎兒心臟手術(shù)需要安全可靠的體外循環(huán)(extracorporeal circulation,ECC)技術(shù),既往動物研究也已證實(shí)胎兒ECC的可行性[1-3]。然而,胎兒ECC術(shù)后胎盤功能障礙[2]和心功能不全[3]仍是實(shí)驗(yàn)性胎兒心臟手術(shù)的致命缺陷。近年來,隨著組學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展,代謝組學(xué)已被用于研究ECC術(shù)后缺血再灌注損傷[4]、急性腎損傷[5]和腦缺血保護(hù)[6]。本研究構(gòu)建胎羊ECC模型,并對轉(zhuǎn)流后胎羊的心臟和胎盤組織進(jìn)行基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)的非靶代謝組學(xué)測序,目標(biāo)是闡明胎羊ECC后心臟和胎盤的代謝特征,并討論這些代謝改變是否與胎羊ECC術(shù)后器官功能不全有關(guān)。

    1 材料與方法

    1.1 動物實(shí)驗(yàn)動物由山東鄆城縣大鵬農(nóng)牧科技有限公司提供。實(shí)驗(yàn)動物倫理由廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(倫理批號:No.GDREC2019516A),動物實(shí)驗(yàn)過程遵守廣東省人民醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)規(guī)章制度。10只懷孕的小尾寒羊(孕90~120 d,總孕期148 d)隨機(jī)分為對照組(n=5)和轉(zhuǎn)流組(n=5)。轉(zhuǎn)流組開胸建立ECC,轉(zhuǎn)流1 h;對照組僅行胸骨切開,不進(jìn)行ECC,觀察1 h。

    1.2 動物手術(shù)孕羊肌肉注射速眠新0.1 mg/kg行基礎(chǔ)麻醉,靜脈泵注丙泊酚4~6 mg/(kg·h)維持全身麻醉。然后進(jìn)行氣管插管和呼吸機(jī)輔助通氣,孕羊動脈氧飽和度維持100%,動脈二氧化碳分壓35 mmHg。監(jiān)測孕羊血壓和心率。

    超聲探查胎羊數(shù)量及方位,中線剖腹手術(shù)暴露子宮。觸診判斷胎羊頭部和胸部相對位置,在胸骨附近切開孕羊子宮,暴露胎羊一側(cè)上肢,行腋動脈穿刺置管,監(jiān)測動脈血壓和心率。胎羊行正中胸骨切開術(shù),打開心包暴露心臟。插管前靜脈注射肝素鈉3~5 mg(根據(jù)胎羊大小估計(jì))。以7-0 Prolene(愛惜康)在主肺動脈縫制荷包,插入動脈插管(美敦力6 Fr動脈插管),右心耳以7-0 prolene線縫制帶心包扣的荷包,而后插入靜脈插管(美敦力12 Fr直頭引流管)。ECC采用離心泵(Revolution 5;索林)作為動力系統(tǒng),人工膜肺(HIITE 800LT;米道斯)和胎盤共同作為氧合器,預(yù)充液由150 ml羊血、50 ml乳酸林格液和10 mg肝素組成。轉(zhuǎn)流過程中維持胎羊ECC流量在150 ml/(kg·min)以上,轉(zhuǎn)流時間為1 h。

    1.3 超聲評估和血液檢測在轉(zhuǎn)流開始前(T0)、轉(zhuǎn)流30 min(T1)和轉(zhuǎn)流結(jié)束時(T2)對胎羊進(jìn)行超聲心動圖檢查。記錄超聲心動圖參數(shù),包括左室(left ventricle,LV)-等容收縮時間(isovolemic contraction time,IVCT)、LV-等容舒張時間(isovolemic relaxation time,IVRT)、右室(right ventricle,RV)-IVCT、RV-IVRT、主動脈瓣內(nèi)徑(aortic valve diameter,AVD)、左室流出道(LV outflow tract,LVOT)-速度時間積分(velocity time integral,VTI)、肺動脈瓣內(nèi)徑(pulmonary valve diameter,PVD)、RVOT-VTI、臍動脈搏動指數(shù)(Umbilical artery pulsatility index,Ua-PI)、臍動脈阻力指數(shù)(Ua resistance index,Ua-RI)。采用公式[Tei指數(shù)=(IVCT-IVRT)/IVRT]計(jì)算左、右心室Tei指數(shù)。左室每搏輸出量(stroke volume-LV,SV-LV)由公式[SV-LV=LVOT-VTI×π×(AVD/2)2]得出,SV-RV由公式[SV-RV=RVOTVTI×π×(PVD/2)2]得出。

    于T0、T1、T2采集靜脈血,進(jìn)行心肌酶檢測,包括肌紅蛋白(myoglobin,Myo)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme,CKMB)等;血?dú)夥治觯╬H、氧分壓、二氧化碳分壓、乳酸等。心肌酶檢測使用m16磁敏免疫分析儀(深圳理邦)進(jìn)行,血?dú)夥治鍪褂胕15血?dú)馍治鰞x(深圳理邦)進(jìn)行。

    1.4 組織收集轉(zhuǎn)流結(jié)束后,對胎羊?qū)嵤┌矘匪?,迅速留取胎羊心臟和胎盤的組織標(biāo)本,液氮速凍后儲存在-80℃冰箱直至代謝物提取。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,將母羊復(fù)蘇并送回農(nóng)場。

    1.5 代謝物提取和UHPLC-MS/MS分析對凍存的組織樣本進(jìn)行代謝物提取和UHPLC-MS/MS分析,具體操作流程按文獻(xiàn)中描述的方法進(jìn)行[7-8]。

    1.6 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理與分析UHPLC-MS/MS生成的原始數(shù)據(jù)文件使用Compound Discoverer 3.1(CD3.1,賽默飛)進(jìn)行峰對齊、峰提取和代謝物定量。之后,將峰強(qiáng)度歸一化為總光譜強(qiáng)度,用歸一化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行分子式預(yù)測。然后用mzCloud(https://www.mzcloud.org/)、mzVault和MassList數(shù)據(jù)庫對峰進(jìn)行匹配,得到定性和相對定量結(jié)果。使用統(tǒng)計(jì)軟件R(R version R-3.4.3)、Python(Python 2.7.6 version)和CentOS(CentOS release 6.6)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,當(dāng)數(shù)據(jù)不是正態(tài)分布時,使用面積歸一化方法進(jìn)行正態(tài)轉(zhuǎn)換。使用京都基因與基因組百科全書(KEGG數(shù) 據(jù) 庫)(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)、人類代謝(HMDB)數(shù)據(jù)庫(https://hmdb.ca/metabolite)和脂質(zhì)圖結(jié)構(gòu)(LMSD)數(shù)據(jù)庫(http://www.lipidmaps.org/)對鑒定到的代謝物進(jìn)行注釋。多元統(tǒng)計(jì)分析部分,使用代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理軟件metaX將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后行主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)和偏最小二乘法判別分析(Partial Least Squares Discriminant Analysis,PLS-DA),進(jìn)而得每個代謝物的變量投影重要度(Variable importantce in projection,VIP)值。單變量分析部分,基于t檢驗(yàn)來計(jì)算各代謝物在兩組間統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P值),并計(jì)算代謝物在兩組間的差異倍數(shù)(fold change,F(xiàn)C)值?;鹕綀D用R包ggplot2繪制。差異代謝物篩選的默認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)為VIP>1,P值<0.05且FC≥1.5或FC≤0.667。篩選完成后,采用MBRole 2.0(http://csbg.cnb.csic.es/mbrole2/)[9]對鑒定到的差異代謝物進(jìn)行富集分析,以尋求顯著變化的代謝通路,P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有分析均采用IBM SPSS Statistics 26.0進(jìn)行,正態(tài)分布資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)描述,非正態(tài)資料用中位數(shù)和四分位數(shù)描述。組間比較采用重復(fù)測量方差分析,組內(nèi)不同時間點(diǎn)的比較采用配對t檢驗(yàn),非正態(tài)分布資料的比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

    2 結(jié) 果

    2.1 動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)流組和對照組的胎羊體重?zé)o明顯差異[(2.10±0.59)kg vs.(1.49±0.86)kg,P=0.232],胎齡無明顯差異[(97.00±9.75)d vs.(98.00±13.04)d,P=0.894]。與對照組相比,轉(zhuǎn)流組左右心室的Tei指數(shù)明顯增加(P<0.05),并且轉(zhuǎn)流結(jié)束時Tei指數(shù)明顯高于轉(zhuǎn)流前(P<0.05),提示胎羊心功能受損。轉(zhuǎn)流組SV-RV在轉(zhuǎn)流過程中逐漸下降,與對照組有顯著差異(P=0.004)。轉(zhuǎn)流組心率逐漸減慢,與對照組差別明顯(P=0.005),轉(zhuǎn)流30 min的心率明顯慢于轉(zhuǎn)流前(P=0.027)。轉(zhuǎn)流組在T1和T2的pH值明顯高于T0(P<0.05),與對照組無明顯差異(表1)。對照組在T2的PCO2顯著高于T0(P=0.013),轉(zhuǎn)流組在T1和T2的PCO2顯著低于T0,兩組的PCO2變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.0004)(表1)。轉(zhuǎn)流組乳酸值在轉(zhuǎn)流過程中明顯增加,與對照組比較有顯著差異(P=0.004)。轉(zhuǎn)流組的Ua-PI、Ua-RI和心肌酶無明顯改變,與對照組比較無明顯差異(表2)。

    表1 胎羊血流動力學(xué)參數(shù)和轉(zhuǎn)流中的血?dú)庵底兓╪=5,±s)

    表1 胎羊血流動力學(xué)參數(shù)和轉(zhuǎn)流中的血?dú)庵底兓╪=5,±s)

    注:Ua-PI:臍動脈壓力指數(shù);Ua-RI:臍動脈阻力指數(shù);PO2:氧分壓;PCO2:二氧化碳分壓;Lac:乳酸;*P<0.05與同組T0相比

    對照組轉(zhuǎn)流組項(xiàng)目P值T0 T1 T2 T0 T1 T2左室Tei指數(shù) 0.37±0.09 0.45±0.19 0.52±0.12 0.35±0.06 0.83±0.46 1.68±0.54* 0.049右室Tei指數(shù) 0.32±0.02 0.39±0.06 0.43±0.07 0.56±0.13 0.84±0.37 1.41±0.17* 0.003左室每搏量(ml/min) 2.49±0.65 2.38±0.40 2.44±0.38 2.68±0.57 1.91±0.79 1.34±0.72* 0.344右室每搏量(ml/min) 3.03±0.23 2.93±0.19 2.97±0.40 2.53±0.44 1.64±0.22 0.99±0.47 0.004 Ua-PI 1.35±0.46 1.32±0.38 1.36±0.43 1.07±0.39 1.23±0.22 1.25±0.31 0.598 Ua-RI 0.77±0.18 0.75±0.24 0.79±0.23 0.65±0.14 0.70±0.11 0.72±0.11 0.575心率(次/min) 148.67±15.28 133.67±14.84 134.67±10.02 138.50±21.33 88.00±11.17* 74.25±30.50 0.005 pH 7.24±0.06 7.32±0.10 7.27±0.09 7.20±0.06 7.34±0.07* 7.32±0.06* 0.796 PO2(mmHg) 23.00±3.61 25.33±1.15 20.33±1.15 20.00±2.55 24.60±8.44 32.60±16.16 0.576 PCO2(mmHg) 67.43±3.06 75.50±15.00 86.73±6.92* 75.38±12.95 36.60±10.74* 28.88±10.05* 0.0004 Lac(mmol/L) 1.98±0.61 1.56±0.80 1.89±0.59 2.19±0.76 6.53±1.72* 7.58±3.10* 0.004

    表2 胎羊血液心肌酶的變化(n=5,±s)

    表2 胎羊血液心肌酶的變化(n=5,±s)

    注:Myo:肌紅蛋白;CKMB:肌酸激酶同工酶

    對照組轉(zhuǎn)流組項(xiàng)目P值T0 T1 T2 T0 T1 T2 Myo(μg/L) <5.0 <5.0 <5.0 <5.0 <5.0 <5.0 -CKMB(μg/L) <2.0 <2.0 <2.0 <2.0 <2.0 <2.0 -

    2.2 代謝組學(xué)結(jié)果

    2.2.1 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)穩(wěn)定性 為確保色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)過程中的穩(wěn)定性和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性,在檢測目標(biāo)樣本的同時,隨機(jī)注入三個質(zhì)控(quality control,QC)樣本(QC樣本由目標(biāo)樣本混合而來)。QC樣本各色譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度和保留時間基本相同,說明色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)在整個實(shí)驗(yàn)過程中穩(wěn)定性良好。然后,利用峰面積計(jì)算三個QC樣本之間的Pearson相關(guān)系數(shù)。結(jié)果顯示(圖1),各QC樣本間相關(guān)系數(shù)均大于0.99,說明各QC樣本高度相關(guān),代謝組結(jié)果穩(wěn)定且可重復(fù)。

    圖1 QC樣本間的Pearson相關(guān)系數(shù)

    2.2.2 多元統(tǒng)計(jì)分析 多元統(tǒng)計(jì)分析采用PCA和PLS-DA。轉(zhuǎn)流組和對照組的心臟代謝譜基本分離,其95%置信區(qū)間僅部分重疊,提示ECC對胎羊的心臟代謝有顯著影響(圖2A)。轉(zhuǎn)流組和對照組的胎盤代謝存在明顯重疊,提示ECC對胎盤代謝的影響較?。▓D2B)。此外,QC樣品集中在目標(biāo)樣品的中間區(qū)域,說明QC樣品具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。 PLS-DA是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計(jì)方法,可以進(jìn)一步區(qū)分組間的代謝差異,但存在一定的過擬合風(fēng)險(xiǎn),需要進(jìn)行排序驗(yàn)證。轉(zhuǎn)流組和對照組的心臟代謝譜在PLS-DA得分圖中明顯分離(圖3A),模型的評價(jià)參數(shù)R2Y和Q2Y均明顯大于0.5,提示模型有良好的穩(wěn)定性和較高的可預(yù)測性,轉(zhuǎn)流組和對照組的心臟代謝有明顯差異,在排序檢驗(yàn)圖中,R2>0>Q2,提示該模型未過擬合。轉(zhuǎn)流組和對照組的胎盤代謝譜在PLS-DA得分圖中同樣明顯分離,但其評價(jià)參數(shù)Q2Y均明顯<0.5,在正極性模式下Q2Y甚至<0(圖3B),提示模型的可預(yù)測性和穩(wěn)定性較差,且存在一定的過擬合,轉(zhuǎn)流組和對照組的胎盤代謝用PLS-DA也不能明顯區(qū)分,差異較小。

    圖2 心臟和胎盤在兩種極性模式下的主成分分析圖

    圖3 心臟和胎盤在兩種極性模式下的偏最小二乘法判別分析圖和排序驗(yàn)證圖

    2.2.3 差異代謝物分析 結(jié)合單變量分析和多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果,以VIP>1,P<0.05,且FC≥1.5或FC≤0.667作為閾值,進(jìn)行差異代謝物篩選。轉(zhuǎn)流組心臟相對于對照組,共鑒定出225種差異代謝物,其中負(fù)極性模式下123種(47種上調(diào),76種下調(diào)),正極性模式下102種(47種上調(diào),55種下調(diào))。轉(zhuǎn)流組胎盤相對于對照組,共鑒定出122種差異代謝物,其中負(fù)極性模式下66種(14種上調(diào),52種下調(diào)),正極性模式下56種(32種上調(diào),2種下調(diào))(圖4)。

    圖4 心臟和胎盤在兩種極性模式下的火山圖

    2.2.4 差異代謝通路分析 利用MBroles 2.0對差異代謝物進(jìn)行富集分析,顯示富集到的差異代謝通路有:糖代謝(三羧酸循環(huán),磷酸戊糖途徑)、脂肪酸代謝(丁酸代謝、不飽和脂肪酸代謝)和氨基酸代謝(丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝,組氨酸代謝,賴氨酸代謝)是ECC胎羊心臟的主要差異代謝途徑(圖5)。轉(zhuǎn)流組心臟組織中,神經(jīng)酸、二十二碳三烯酸、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)等脂肪酸含量減少,?;鈮A增加,產(chǎn)物乙酰輔酶A增加,這表明脂肪酸利用明顯增加。生糖氨基酸(甲硫氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸等)的含量減少,糖代謝的能量底物(果糖、6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖等)含量增加,三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物(琥珀酸、α-酮戊二酸、烏頭酸等)增加,表明能量代謝增加,糖異生增多。磷酸戊糖途徑中間產(chǎn)物(5-磷酸木酮糖、6-磷酸葡萄糖酸等)減少,合成代謝受阻。

    轉(zhuǎn)流組胎盤的差異代謝通路主要包括不飽和脂肪酸代謝、花生四烯酸(arachidonate,ARA)代謝、谷胱甘肽代謝等(圖5B)。能量代謝方面,胎盤同樣表現(xiàn)為糖代謝底物(6-磷酸葡萄糖、1-磷酸葡萄糖)的增加以及多種生糖氨基酸和不飽和脂肪酸的減少,說明胎盤能量需求增加,募集的葡萄糖增多。ARA代謝和谷胱甘肽代謝則分別與炎癥和氧化應(yīng)激有關(guān)。

    圖5 心臟和胎盤的通路富集氣泡圖

    3 討 論

    3.1 心功能和胎盤功能本研究選用孕90~120 d的羊構(gòu)建胎羊ECC模型,平均孕97.5 d,相當(dāng)于人孕25周,能夠較好地模擬人胎兒ECC手術(shù)的真實(shí)情況。既往動物研究表明,胎兒ECC可導(dǎo)致心功能不全[3]。在本研究中,發(fā)現(xiàn)胎羊ECC導(dǎo)致左右心室的Tei指數(shù)明顯增加,SV和心率顯著下降。Tei指數(shù)是心室等容時間(包括IVCT和IVRT)與射血時間的比值,在胎兒心功能檢測方面不受心室?guī)缀涡螒B(tài)、心率和胎齡的影響,具有良好的可靠性和重復(fù)性[10]。心功能低下時Tei指數(shù)顯著增高。胎兒心肌收縮成分少,心肌舒張依賴細(xì)胞膜上的鈉鈣交換,因而胎兒心肌收縮和舒張功能比成熟心肌低下。胎兒心肌細(xì)胞處于最長肌節(jié)狀態(tài),根據(jù)Frank-Starling定律,增加心臟容量,胎兒心臟每搏量的增加非常有限。因此,胎兒通過增加心率和雙心室做功來保持高循環(huán)動力狀態(tài)。在本研究中,轉(zhuǎn)流組胎羊的心率和SV均明顯下降,心輸出量顯著減少。Myo和CKMB是心肌損傷的標(biāo)志物之一,Myo通常在心肌損傷后1~4 h內(nèi)升高,在6~9 h達(dá)到峰值,CKMB在心肌損傷3~8 h開始升高,在12~24 h達(dá)到峰值。由于本研究觀察時間僅1 h,因此未觀察到Myo和CKMB的顯著變化。

    胎盤功能障礙是胎兒ECC最常見的術(shù)后并發(fā)癥,具體表現(xiàn)為胎盤血管阻力升高、高碳酸血癥和不可逆酸中毒。在本研究中,Ua-PI和Ua-RI無明顯改變,并且PCO2逐漸降低,pH明顯改善。這可能是因?yàn)槿斯つし魏吞ケP共同作為氧合器,在轉(zhuǎn)流過程中提高了氣體交換能力,減輕了胎盤負(fù)荷。此外,胎羊ECC導(dǎo)致的胎盤功能惡化通常發(fā)生在術(shù)后數(shù)小時,本研究為獲取組織標(biāo)本,觀察時間較短,所以胎盤功能未見明顯惡化,但顯示血乳酸值在轉(zhuǎn)流過程中顯著增加,這表明胎兒的內(nèi)環(huán)境紊亂正在發(fā)生。

    3.2 心臟代謝與心功能心臟是一種“雜食性”器官,具有很強(qiáng)的底物利用和環(huán)境適應(yīng)能力。在胎兒出生前,心臟以乳酸和葡萄糖作為主要的能量底物,在胎兒出生后,則迅速轉(zhuǎn)化為以脂肪酸代謝為主。這種代謝模式的轉(zhuǎn)變主要是由于出生前胎兒宮內(nèi)環(huán)境的相對缺氧和出生后新生兒能量需求的迅速增加[11]。在本研究觀察到轉(zhuǎn)流組胎羊的心臟發(fā)生了類似出生后的代謝模式轉(zhuǎn)換:多種脂肪酸含量減少,脂代謝明顯增加,三羧酸循環(huán)增強(qiáng)。這可能是因?yàn)镋CC作為一種應(yīng)激狀態(tài),導(dǎo)致轉(zhuǎn)流組胎羊的能量需求增加,脂代謝激活。與糖酵解相比,脂代謝表現(xiàn)出更高的ATP產(chǎn)量,但生產(chǎn)1分子ATP所消耗的氧氣更多,這意味著轉(zhuǎn)流組胎羊心肌氧耗增加,負(fù)擔(dān)加重。此外,胎兒心肌細(xì)胞的線粒體處于未成熟狀態(tài)[11],對氧化損傷的防御機(jī)制尚未完善,脂肪酸氧化增加會導(dǎo)致活性氧生成增多,線粒體損傷加重。因此,對于胎兒而言,這種能量代謝模式的轉(zhuǎn)變可能是胎羊ECC術(shù)后心功能不全的機(jī)制之一。

    增加的脂代謝不僅會導(dǎo)致能量代謝紊亂,還會導(dǎo)致生長發(fā)育受阻。變化的脂質(zhì)代謝物多為長鏈多不飽和脂肪酸(long chain polyunsaturated fatty acid,LCPUFA),包括:DHA、二十二碳五烯酸(docosapentaenoic acid,DPA)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)等。Kajimoto等[12]用新生仔豬模型研究體外膜氧合(extracorporeal membrane oxygenation,ECMO)對未成熟心臟代謝的影響,發(fā)現(xiàn)ECMO促進(jìn)未成熟心臟的長鏈脂肪酸氧化。在本研究中也觀察到胎羊ECC促進(jìn)LCPUFAs的氧化。多不飽和脂肪酸對于胎兒的生長發(fā)育是必不可少的。它們不僅是細(xì)胞膜的關(guān)鍵組成部分,還是一些代謝物的前體,對炎癥和神經(jīng)元生長有重要作用[13-14]。DHA和ARA缺乏會影響神經(jīng)元干細(xì)胞的增殖和分化,導(dǎo)致胎兒和新生兒神經(jīng)元細(xì)胞的遷移延遲,增加神經(jīng)發(fā)育障礙的風(fēng)險(xiǎn)[15]。EPA、DHA和ARA還可被代謝為類二十烷酸或類二十二烷酸(統(tǒng)稱為氧脂素),對維持自穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[16]。本研究中,胎羊ECC導(dǎo)致多不飽和脂肪酸的下降,不僅會降低胎羊維持氧化還原平衡和炎癥穩(wěn)態(tài)的能力,還有可能對胎羊的神經(jīng)發(fā)育造成不良影響。

    氨基酸在胎兒體內(nèi)的主要功能是為生長發(fā)育提供物質(zhì)基礎(chǔ)以及參與氧化反應(yīng),當(dāng)營養(yǎng)缺乏和營養(yǎng)不良時,胎兒體內(nèi)的氨基酸代謝就會相應(yīng)增強(qiáng)。轉(zhuǎn)流組心臟存在氨基酸代謝的顯著改變,主要表現(xiàn)為生糖氨基酸的含量下降,包括天冬氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺等。轉(zhuǎn)流組胎羊能量需求明顯增加,并能較早利用氨基酸進(jìn)行糖異生,但這種消耗是以合成代謝下降為代價(jià)的,長時間應(yīng)激可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解增加和嚴(yán)重的負(fù)氮平衡,對胎羊的生長發(fā)育造成嚴(yán)重不良影響。

    3.3 胎盤代謝與胎盤功能既往動物研究表明,胎兒ECC會導(dǎo)致胎盤功能障礙,可能的機(jī)制包括:炎性介質(zhì)沉積、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、一氧化氮(nitric oxide,NO)含量下降、氧化應(yīng)激等[2-3,17]。本研究采用人工膜肺和胎盤共同作為氧合器,一定程度上減輕了胎盤負(fù)荷,并且停機(jī)后的觀察時間較短,因此未觀察到胎盤功能的明顯下降。同樣,在代謝層面,轉(zhuǎn)流組胎羊的代謝改變不明顯。雖然未能將轉(zhuǎn)流組和對照組的胎盤代謝完全區(qū)分,但轉(zhuǎn)流組胎盤的一些代謝變化可能預(yù)示了即將到來的胎盤損傷。

    NO是以精氨酸為底物,以還原型輔酶Ⅱ作為電子供體,由一氧化氮合酶催化生成。精氨酸減少是胎盤功能不良的標(biāo)志[18]。轉(zhuǎn)流組胎盤的精氨酸(P=0.034)和同型精氨酸(P=0.033)明顯減少,NO合成的底物不足,這可能是轉(zhuǎn)流術(shù)后胎盤內(nèi)皮細(xì)胞NO合成障礙的新機(jī)制。與心臟相同,轉(zhuǎn)流組胎盤同樣存在脂肪酸氧化的增加,氧負(fù)擔(dān)加重。本研究采用人工膜肺和胎盤共同作為氧合器,在轉(zhuǎn)流期間對胎盤的氣體交換有一定輔助作用,但轉(zhuǎn)流結(jié)束后胎盤將面臨更重的氣體交換負(fù)擔(dān),這可能是ECC術(shù)后胎盤功能惡化的原因之一。此外,脂肪酸氧化增加還會導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷加重。作為主要的營養(yǎng)運(yùn)輸通道和調(diào)節(jié)器官,胎盤具有較強(qiáng)的對抗氧化應(yīng)激損傷的能力。棕櫚酸抗壞血酸酯、甜菜堿、還原性谷胱甘肽等具有抗氧化防御能力的代謝物在轉(zhuǎn)流組胎羊的胎盤中均明顯增加[19],表明轉(zhuǎn)流組胎盤雖然面臨著氧化應(yīng)激損傷,但仍在代償范圍內(nèi)。隨著觀察時間的延長,這種氧化與抗氧化的平衡可能會被打破,嚴(yán)重的氧化應(yīng)激可能會進(jìn)一步損傷胎盤功能。

    3.4 不足與展望本研究也存在一些不足。首先,本研究以胎羊?yàn)槟P吞接懱篍CC對器官組織代謝的影響,其結(jié)果不完全適用于人類胎兒。其次,本研究的動物數(shù)量較少,觀察時間較短,并且非靶向代謝組學(xué)只能進(jìn)行相對定量,結(jié)果可能存在一定誤差。應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量,延長觀察時間,并采用靶向代謝組學(xué)對結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。此外,每個器官內(nèi)部都有不同的細(xì)胞類型和功能區(qū)域。對于特定的代謝改變,器官可能具有區(qū)域特異性。在本研究中,只使用了器官樣本的一小部分,不能完全代表整個器官的代謝??臻g代謝組學(xué)整合質(zhì)譜成像和代謝組學(xué)技術(shù),對動/植物組織和細(xì)胞中內(nèi)/外源性代謝物的種類、含量和差異性空間分布進(jìn)行精準(zhǔn)測定[20],其應(yīng)用將更有助于器官代謝的研究。

    4 結(jié) 論

    綜上所述,本研究構(gòu)建了胎羊ECC模型1 h,研究顯示胎兒ECC影響心臟和胎盤組織代謝。轉(zhuǎn)流過程中心臟功能明顯下降,代謝改變主要變現(xiàn)為脂肪酸氧化和氨基酸分解增強(qiáng);胎盤功能暫無明顯下降,代謝改變不顯著,但一些代謝物的變化提示胎盤功能在轉(zhuǎn)流結(jié)束后可能將逐漸惡化。本研究首次從代謝的角度對胎羊ECC術(shù)后心功能不全和胎盤功能障礙的機(jī)制進(jìn)行了初步探討,為胎兒ECC研究提供了新方向。

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