紅小米黃酒發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)與細(xì)菌菌群分析

王春艷，于海彥，喬志航，許彬，羅建成

（南陽(yáng)理工學(xué)院 河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽(yáng) 473004）

黃酒是世界三大發(fā)酵酒之一，擁有悠久的歷史文化，因其獨(dú)特的口感風(fēng)味、低酒精含量、豐富的營(yíng)養(yǎng)，深受人們的喜愛(ài)[1-2]。黃酒的品質(zhì)主要取決于釀造風(fēng)味，酒體中的醇、醛、酯、酚等揮發(fā)性物質(zhì)相互作用、交匯融合使其具有一系列香氣特征，賦予黃酒獨(dú)特的口感[3]。在眾多種類的揮發(fā)性物質(zhì)中，含3個(gè)碳原子以上的醇類被稱為高級(jí)醇，高級(jí)醇是黃酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)，適量的高級(jí)醇給人一種醇香宜人的感受，但高級(jí)醇過(guò)量則容易引起異雜味和致醉性[4-5]。因此，對(duì)黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)以及高級(jí)醇的檢測(cè)分析十分重要。

黃酒由多菌種混合發(fā)酵而成，屬于半開(kāi)放型，在發(fā)酵過(guò)程中，微生物利用酒醪原料進(jìn)行代謝生成多種風(fēng)味物質(zhì)，而代謝產(chǎn)物又會(huì)正向或反向地影響著微生物的生長(zhǎng)和新陳代謝，進(jìn)而改變黃酒發(fā)酵過(guò)程及最終黃酒的風(fēng)味和口感[6-7]。黃酒釀造過(guò)程中的微生物與風(fēng)味物質(zhì)關(guān)系復(fù)雜，尋找與風(fēng)味物質(zhì)密切相關(guān)的功能性微生物研究有利于提高和控制黃酒品質(zhì)。

目前，南方黃酒大多以糯米為原料，北方大多以黍米為原料[8]，也有學(xué)者以燕麥[9]、玉米[10]、苦蕎[11]等為原料釀造黃酒，促進(jìn)了黃酒的多元化發(fā)展。紅小米為南陽(yáng)盆地特產(chǎn)，因谷殼呈紅色，本地俗稱紅谷。與糯米、黍米等農(nóng)作物相比，紅小米淀粉含量較低，蛋白質(zhì)、脂肪和維生素含量較高，且富含人體必需的8種氨基酸，比例協(xié)調(diào)，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[12]。目前尚未有學(xué)者對(duì)南陽(yáng)紅小米黃酒釀造過(guò)程中的微生物群落、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及其相關(guān)性進(jìn)行研究。

本文以南陽(yáng)紅小米為原料，采用攤飯法進(jìn)行黃酒釀造，對(duì)釀造過(guò)程中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)、微生物群落進(jìn)行解析，并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)原理對(duì)兩者之間的相關(guān)性進(jìn)行預(yù)測(cè)。本研究將揭示南陽(yáng)紅小米黃酒獨(dú)特口感的微生物機(jī)制，為更好的品質(zhì)控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紅小米：南陽(yáng)市（世界美酒特色產(chǎn)區(qū)）鎮(zhèn)平縣；紹酒風(fēng)味T3釀酒曲（根霉菌、酶活20 000 U/g的α-淀粉酶、酶活100 000 U/g的葡萄糖淀粉酶、釀酒酵母）：安琪酵母股份有限公司；麥曲：山東梁山徐曙生物工程有限公司；3-辛醇（色譜純）：美國(guó)Sigma公司；DP328糞便基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；QIAquick膠回收試劑盒（28706）：德國(guó)QIAGEN公司。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

立氏壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50FB）：上海申安醫(yī)療器械廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9082）：上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；電子分析天平（BSA224S-CW）：德國(guó)賽多利斯集團(tuán)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Centrifuge 5430R）：Eppendorf德國(guó)艾本德股份公司；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（7890A-5975C）、HP-INNOWAX色譜柱（60m×250μm×0.5 μm）：美國(guó)安捷倫科技有限公司；T100TM梯度PCR儀：美國(guó)Bio-RAD公司；Miseq高通量測(cè)序儀：美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 紅小米黃酒釀造與取樣

采用攤飯法釀造紅小米黃酒。取0.25 kg紅小米淘洗干凈，置于潔凈的1 L燒杯內(nèi)，加自來(lái)水浸泡，水面超過(guò)米層3cm左右，燒杯口用兩層無(wú)菌紗布覆蓋，早晚各換1次水，室溫（18℃～21℃）下浸泡24 h后瀝干水分，置于不銹鋼鍋內(nèi)水煮直至出現(xiàn)糊香味，攤涼冷卻至35℃。麥曲接種量為10.0%，釀酒曲接種量為0.45%，均勻攪拌后，裝入5 L黃酒發(fā)酵罐中，依次用封口膜（扎孔）和紗布進(jìn)行封罐。黃酒罐室溫（18℃～21℃）內(nèi)持續(xù)發(fā)酵24 d，發(fā)酵前期對(duì)其進(jìn)行攪拌，使其充分發(fā)酵。

分別取第 0（投料當(dāng)天）、2、4、6、9、12、18、24 天的發(fā)酵樣品10 g，4 000 r/min離心10 min，取上清液用于測(cè)定揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，剩余樣品轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管中，-20℃保存，用于提取微生物總DNA。樣本分別命名為HJB0、HJB2、HJB4、HJB6、HJB9、HJB12、HJB18、HJB24。

1.3.2 紅小米黃酒風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

采用頂空進(jìn)樣氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，對(duì)紅小米黃酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性確定和定量分析。取8 mL已離心的紅小米黃酒發(fā)酵液加入到20 mL頂空瓶中，再加入 1.5 g NaCl和 25 μL內(nèi)標(biāo)物（3-辛醇，質(zhì)量濃度為300 mg/L）。采用頂空進(jìn)樣器處理樣品，樣品處理溫度60℃，定量環(huán)/閥溫度100℃，傳輸線溫度110℃，樣品處理時(shí)間45 min，壓力平衡時(shí)間0.25 min，進(jìn)樣時(shí)間1 min。

氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spec trometry，GC-MS）條件：進(jìn)樣口溫度240℃；升溫程序?yàn)?0℃保持2 min，以3℃/min升溫至80℃，再以5℃/min升溫至230℃，保持10min；載氣流速1mL/min；電離方式電子電離（electron ionization，EI）；電子能量70 eV；離子源溫度230℃；傳輸線溫度250℃；質(zhì)量掃描范圍m/z為29～350，通過(guò)美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）譜庫(kù)對(duì)比風(fēng)味物質(zhì)。

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的半定量分析，將GC-MS檢測(cè)的高級(jí)醇和內(nèi)標(biāo)物（3-辛醇）的吸收峰面積代入下面公式，計(jì)算紅小米黃酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量。

式中：Cx為紅小米黃酒中某種風(fēng)味物質(zhì)的濃度，μg/L；Cs為內(nèi)標(biāo)物的濃度，μg/L；Ax為紅小米黃酒中待測(cè)風(fēng)味物質(zhì)的峰面積；As為內(nèi)標(biāo)物的峰面積。

1.3.3 紅小米黃酒微生物群落結(jié)構(gòu)測(cè)定

使用（DP328）糞便基因組DNA提取試劑盒提取黃酒發(fā)酵物微生物總DNA。擴(kuò)增16S V3-V4區(qū)，采用的引物為 B341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和B785R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共計(jì)25個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物切膠純化后進(jìn)行精準(zhǔn)定量，送第三方公司進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測(cè)序。

為得到高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)，以提高后續(xù)生物信息分析準(zhǔn)確性，使用Vsearch以及Cutadapt軟件對(duì)原始下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、質(zhì)控和過(guò)濾，得到有效數(shù)據(jù)。97%相似性水平下對(duì)非重復(fù)序列（不含單序列）進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類分析，同時(shí)采用Denovo模塊去除嵌合體序列。選取OTU代表序列與Silva數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，使用Mothur軟件找出與OTU序列相似度最高且可信度達(dá)80%以上的物種信息用于OTU注釋，從而完成不同水平下的每個(gè)樣品的群落結(jié)構(gòu)分析。

1.3.4 紅小米黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與微生物相關(guān)性分析

利用RStudio中的psych軟件包計(jì)算微生物與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)之間的Spearman相關(guān)系數(shù)（r），以r＞0.5且p＜0.05為閾值找出可視化對(duì)象，選用Gephi 0.92對(duì)微生物和代謝物之間的相關(guān)性進(jìn)行可視化，以表征微生物對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的貢獻(xiàn)[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性物質(zhì)在紅小米黃酒發(fā)酵過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化

紅小米黃酒風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 紅小米黃酒發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性物質(zhì)變化Fig.1 Changes in volatile compounds during red millet rice wine fermentation

通過(guò)GC-MS對(duì)紅小米黃酒發(fā)酵過(guò)程中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行鑒定，共得到70種揮發(fā)性物質(zhì)成分，包括高級(jí)醇類15種、酯類24種、烷類10種、醛酮類17種、其他類（如環(huán)辛四烯）4種，酯類與高級(jí)醇類占揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總含量的90%以上。由圖1可知，投料當(dāng)天（0 d），揮發(fā)性組分處于較低水平；0～2d高級(jí)醇類迅速增加，酯類與醛酮類化合物也隨之上升，發(fā)酵第18天，酯類物質(zhì)含量超過(guò)高級(jí)醇類成為含量最高的物質(zhì)，發(fā)酵第24天，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量達(dá)到峰值，為44 362.59 μg/L。

黃酒發(fā)酵過(guò)程中，酯類物質(zhì)含量為161 μg/L～24 736 μg/L，其中乙酸乙酯、乙酸異戊酯、丙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、葵酸乙酯是主要的酯類化合物。與其它已研究的麥曲黃酒[14]、清爽型黃酒[15]、紹興機(jī)械化黃酒[16]的揮發(fā)性物質(zhì)相比，紅小米黃酒揮發(fā)性物質(zhì)種類較多，但酯類相對(duì)較少，高級(jí)醇類、醛酮類較多。

2.2 高級(jí)醇在紅小米黃酒發(fā)酵過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化

高級(jí)醇在紅小米黃酒發(fā)酵周期中的種類及含量見(jiàn)表1。

表1 高級(jí)醇在紅小米黃酒發(fā)酵過(guò)程中的變化Table 1 Changes of higher alcohols during fermentation of red millet rice wine μg/L

續(xù)表1 高級(jí)醇在紅小米黃酒發(fā)酵過(guò)程中的變化Continue table 1 Changes of higher alcohols during fermentation of red millet rice wine μg/L

由表1可知，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中共檢測(cè)出包括異丁醇在內(nèi)的15種高級(jí)醇。投料當(dāng)天（0 d）檢測(cè)出4種高級(jí)醇，其含量處于較低水平，0～2 d時(shí)，高級(jí)醇含量迅速升高，隨后緩慢增長(zhǎng)，第18天達(dá)到最大值，為13 828.9 μg/L。

投料當(dāng)天（0 d），檢測(cè)出4種高級(jí)醇，分別為異丁醇、異戊醇、正己醇和糠醇。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，穩(wěn)定存在的高級(jí)醇（檢出次數(shù)＞4）包括β-苯乙醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇、正戊醇、糠醇和2，3-丁二醇，其中正戊醇含量較低（2.28 μg/L～4.06 μg/L），正丁醇、異丁醇、異戊醇、糠醇和2，3-丁二醇含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上升并趨于穩(wěn)定。所有時(shí)間段均檢測(cè)出的高級(jí)醇為異丁醇和異戊醇，其含量分別占高級(jí)醇總含量的12.58%～18.26%和72.89%～80.29%，是本次黃酒發(fā)酵檢測(cè)到的豐度最高的兩種揮發(fā)性物質(zhì)。檢出次數(shù)≤4的高級(jí)醇包括仲丁醇、正己醇、正庚醇、3-甲基-1-戊醇、六甘醇、3-甲硫基丙醇和丙烯醇。僅在發(fā)酵前期（0～6 d）檢測(cè)到正己醇，發(fā)酵后期（9 d～24 d）高級(jí)醇種類顯著增加，如仲丁醇、丙烯醇、正庚醇等均有檢出。

將已有研究的不同類型的黃酒在其發(fā)酵過(guò)程中的高級(jí)醇種類、主要高級(jí)醇平均含量（去除投料當(dāng)天）進(jìn)行對(duì)比分析，分析結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同類型黃酒發(fā)酵過(guò)程中的高級(jí)醇對(duì)比分析Table 2 Comparison of higher alcohols during fermentation of different types of rice wine

由表2可知，所研究的幾種類型的黃酒主要檢測(cè)到的高級(jí)醇為異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇3種，清爽型黃酒和紹興機(jī)械化黃酒主要高級(jí)醇的平均含量是其他類型黃酒的10倍～100倍，紅小米黃酒的高級(jí)醇種類居中，β-苯乙醇含量很低，異丁醇、異戊醇的平均含量高于麥曲黃酒和燕麥黃酒。由此可見(jiàn)，不同釀造工藝，不同風(fēng)味的黃酒高級(jí)醇含量差別明顯。

2.3 高通量測(cè)序結(jié)果及Alpha多樣性分析

利用Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)得到樣品HJB0、HJB2、HJB4、HJB6、HJB9、HJB12、HJB18、HJB24 的原始測(cè)序數(shù)據(jù)分別為 21 522、22 141、28 199、26 455、20 729、22 153、23 897、20 961條，經(jīng)過(guò)質(zhì)控得到有效數(shù)據(jù)，并對(duì)其Alpha多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 紅小米黃酒樣品細(xì)菌群落豐度和多樣性參數(shù)Table 3 Bacterial community richness and diversity indices of red millet rice wine samples

由表3可知，8個(gè)樣品的覆蓋率均＞99.0%，表明試驗(yàn)測(cè)序深度合理，測(cè)序結(jié)果可以反映真實(shí)的樣本情況。4個(gè)指數(shù)中，香農(nóng)指數(shù)越大，群落物種的多樣性越高，辛普森指數(shù)越大，說(shuō)明群落多樣性越低，而豐富度指數(shù)或ACE指數(shù)越大，則表明群落物種豐富度越高。樣本HJB4的香農(nóng)指數(shù)（1.63）最高，辛普森指數(shù)（0.33）最低，豐富度指數(shù)及ACE指數(shù)均較高，表明紅小米黃酒發(fā)酵至第4天細(xì)菌微生物群落多樣性達(dá)到峰值，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，微生物多樣性和豐富度下降較為明顯，發(fā)酵末期又有所回升。

根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果所獲取的信息，在門(mén)水平上進(jìn)行細(xì)菌微生物群落分析，共得到5個(gè)門(mén)，其中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)有2個(gè)，分別為厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和變形菌門(mén)（Proteobacteria），這與多數(shù)黃酒釀造微生物的相關(guān)研究相一致[14-18]。門(mén)水平紅小米黃酒微生物群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果見(jiàn)圖2，屬水平紅小米黃酒微生物群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 門(mén)水平紅小米黃酒微生物群落結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Analysis of bacterial community structure in red millet rice wine based on phyla levels

圖3 屬水平紅小米黃酒微生物群落結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Analysis of bacterial community structure in red millet rice wine based on genus levels

由圖2可知，變形菌門(mén)在發(fā)酵前4 d占據(jù)優(yōu)勢(shì)，相對(duì)豐度為94.49%～57.54%。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，厚壁菌門(mén)逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，發(fā)酵第9天至結(jié)束，厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度均超過(guò)98%。

由圖3可知，對(duì)OTU注釋，共得到了55個(gè)屬，其中相對(duì)豐度＞1%的優(yōu)勢(shì)菌屬共有7種，分別是腸球菌屬（Enterococcus）、克魯沃菌屬（Kluyvera）、乳酸桿菌屬（Lacticaseibacillus）、大洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）和Lentilactobacillus，非優(yōu)勢(shì)菌屬及未分類的OTU歸為其它。

本研究的紅小米黃酒發(fā)酵過(guò)程中Lacticaseibacillus是相對(duì)豐度最高的細(xì)菌，由圖3可知，從第2天的6.61%迅速增加，第9天達(dá)到最高值95.79%，隨后緩慢降低，最終豐度值為48.6%。黃酒發(fā)酵前后期呈現(xiàn)出顯著不同的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，發(fā)酵前期（2 d～6 d）菌群豐富，優(yōu)勢(shì)菌 Oceanobacillus、Weissella、Kluyvera、Enterococcus和Kroppenstedtia均出現(xiàn)豐度最高值；發(fā)酵后期（9 d～24 d）上述5種細(xì)菌基本無(wú)檢出，Lentilactobacillus增長(zhǎng)明顯，最終豐度為41.88%，成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌。分析原因可能是由于黃酒發(fā)酵后期呈現(xiàn)的高酒精、高酸、缺氧的環(huán)境抑制了某些微生物的生長(zhǎng)，給耐受細(xì)菌提供了更多的生態(tài)位[19-20]。

2.4 紅小米黃酒核心微生物與揮發(fā)性物質(zhì)的相關(guān)性

選取豐度前20的細(xì)菌屬和70種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)作相關(guān)性分析，計(jì)算他們之間spearman相關(guān)系數(shù)（r），選取r>0.5且p<0.05作為有效的網(wǎng)絡(luò)連接并繪圖，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 揮發(fā)性物質(zhì)與主要微生物的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析Fig.4 Correlation network between volatile compounds and microbial genera

如圖4所示，共有45個(gè)有效節(jié)點(diǎn)，81項(xiàng)關(guān)聯(lián)。其中 ，Bacillus、Lentilactobacillus、Companilactobacillus 是連接最大的 3個(gè)屬（21、18、18），相關(guān)化合物主要是對(duì)黃酒風(fēng)味的產(chǎn)生具有重要作用的醇類和酯類。Lacticaseibacillus與甲基環(huán)戊烷（B3）以及4種醇類、4種醛酮類有關(guān)聯(lián)。正己醇（V8）與 Kluyvera、Kroppenstedtia、Enterococcus、Oceanobacillus、Weissella、Lentibacillus 均具有相關(guān)性。三氯甲烷（B4）和十七烷（B7）與O－ceanobacillus產(chǎn)生了相關(guān)性，乙酸乙酯（A2）只與Bacillus相關(guān)，庚酸乙酯（A11）只與Lentibacillus相關(guān)。以上結(jié)果表明，在本次紅小米黃酒發(fā)酵過(guò)程中，對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的主要貢獻(xiàn)細(xì)菌群為 Bacillus、Lentilactobacillus、Companilactobacillus和Lacticaseibacillus。紅小米黃酒發(fā)酵過(guò)程中與風(fēng)味物質(zhì)形成有關(guān)的細(xì)菌主要集中在芽孢桿菌屬與乳桿菌屬，并未見(jiàn)其他報(bào)道中的糖多孢菌屬和泛菌屬[21-22]，推測(cè)主要是與發(fā)酵原料的不同有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究以南陽(yáng)特色紅小米為主要原料進(jìn)行黃酒釀造，從微生物組和代謝組的角度，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析揭示黃酒發(fā)酵過(guò)程中微生物與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性。本次黃酒發(fā)酵試驗(yàn)共檢測(cè)到70種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，酯類與高級(jí)醇含量占總含量的90%以上，其中高級(jí)醇15種，異戊醇、異丁醇豐度較高。高通量測(cè)序結(jié)果揭示黃酒發(fā)酵至第4天，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性達(dá)到最高。門(mén)水平上，豐度最高的是厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和變形菌門(mén)（Proteobacteria）；屬水平上，優(yōu)勢(shì)屬共有7個(gè)。相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的主要貢獻(xiàn)細(xì)菌群為 Bacillus、Lentilactobacillus、Companilactobacillus和Lacticaseibacillus。本研究結(jié)果可以為實(shí)現(xiàn)合成微生物組生產(chǎn)黃酒及其品質(zhì)的定向調(diào)控奠定理論基礎(chǔ)。