微小RNA-17-5p通過靶向調(diào)控TP53INP1的表達對急性心肌梗死后心室重構(gòu)的影響

朵杰 白潔 韓瓊

急性心肌梗死（AMI）是由于冠狀動脈痙攣和閉塞，導(dǎo)致心肌組織缺氧、壞死的疾病[1]。經(jīng)有效治療后，AMI 患者1 個月內(nèi)生存率可達90%[2]，但仍有約40%的患者會出現(xiàn)心室不良重構(gòu)，從而導(dǎo)致心力衰竭（心衰）[3]。研究發(fā)現(xiàn)，高達20%的AMI患者5 年內(nèi)會發(fā)生心衰[4]。改善心室重構(gòu)對提高AMI 患者生存率，提升生活質(zhì)量具有重要意義。微小RNA（miRNA）是由18～25個核苷酸組成的非編碼小分子單鏈RNA，廣泛存在于真核細胞內(nèi)，具有調(diào)節(jié)基因表達等作用，在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-17-5p 可靶向腫瘤蛋白53 誘導(dǎo)性核蛋白1（TP53INP1）mRNA的3’UTR 并下調(diào)其在宮頸癌細胞中的表達，而宮頸癌細胞中miR-17-5p 的下調(diào)可導(dǎo)致TP53INP1 的高表達[6]。目前關(guān)于miR-17-5p 對TP53INP1 的調(diào)控在AMI 心室重構(gòu)中的作用還未見報道。本研究通過敲除miR-17-5p 和過表達miR-17-5p 小鼠，探討miR-17-5p 靶向TP53INP1 對小鼠AMI 后心室重構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

BX53 顯微鏡購自日本奧林巴斯公司，小動物超聲儀購自美國Thermo Fisher 公司，伯樂Mini-PRO 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀購自美國伯樂公司，LAS 4000 成像系統(tǒng)購自美國GE Healthcare公司。實時定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購自上海優(yōu)寧維生物有限公司，蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；TP53INP1、β-actin 抗體購自美國abcam 公司。

1.2 實驗動物

成 年miR-17-5p-/-、miR-17-5p＋/＋和正常型SPF級昆明種小鼠，體質(zhì)量22～25 g，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（渝）2018-0001，動物使用許可證號SYXK（渝）2018-0022，動物質(zhì)量合格證號00102458。試驗期間所有大鼠均飼養(yǎng)于清潔級動物房內(nèi)（室溫18～25℃，相對濕度60%～70%），動物自由取食、飲水，自動控制光照/黑暗交替（12 h/12 h）。本研究已獲得本院倫理委員會審查和批準(zhǔn)，符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)要求。

1.3 動物建模及分組

選取60 只昆明種小鼠，根據(jù)miR-17-5p 基因類型采用隨機數(shù)字表法分為6 組：假手術(shù)組、AMI組、miR-17-5p-/-假手術(shù)組、miR-17-5p-/-AMI 組、miR-17-5p＋/＋假手術(shù)組和miR-17-5p＋/＋AMI 組，每組10 只，雌雄各半。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后采用3%水合氯醛按1 mL/kg 腹腔注射麻醉，在無菌條件下切開小鼠胸腔，充分暴露小鼠心臟，找到冠狀動脈左前降支（LAD），采用無損傷絲線在左心耳下緣2 mm 處結(jié)扎，結(jié)扎后心肌發(fā)白，動物心電圖顯示Ⅱ?qū)?lián)ST 段抬高，即表示建模成功，縫合創(chuàng)口。所有假手術(shù)組小鼠暴露心臟后直接縫合胸腔，不做結(jié)扎處理[7]。小鼠AMI 模型建立后，每日正常飲食，持續(xù)2 周 。

1.4 超聲心動圖檢測心功能情況

建模成功后7 d 和14 d 分別采用小動物超聲儀檢測各組小鼠二維超聲心動圖，并根據(jù)雙平面Simpson 法[8]計算舒張末期容積指數(shù)（EDVI）、收縮末期容積指數(shù)（ESVI）和左室射血分數(shù)（LVEF）。

1.5 心肌梗死面積測定

術(shù)后2 周頸椎脫臼處死小鼠，取部分小鼠心臟組織，切片，厚度約為2 mm，放入含1%紅四氮唑（TTC）的PBS 溶液中，于37 ℃避光孵育20 min，切片梗死區(qū)域顯示為白色，非梗死區(qū)顯示深紅色。將染色后的心臟組織放入4%多聚甲醛中固定40 min，顯微鏡拍照后分析梗死面積占比。心肌梗死面積（%）=未著色心肌面積/心肌片總面積×100%。

1.6 實時定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)檢測心臟組織miR-17-5p和TP53INP1 mRNA表達水平

取0.1 g 小鼠心臟組織，根據(jù)RNA 提取試劑盒說明書提取小鼠心臟織中總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA。PCR 反應(yīng)體系：SYBR Green qPCR SuperMix 16.25 μL，特異性引物2.0 μL，模板cDNA 3.25 μL，DEPC 水補足至30 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃，10 min；95 ℃，10 s；60 ℃，30 s；70 ℃，30 s；共40 個循環(huán)。設(shè)置3 個復(fù)孔，2-ΔΔCT法計算目的mRNA 相對表達水平。

1.7 Western blot法檢測心臟組織TP53INP1蛋白表達水平

取0.1 g 小鼠心臟組織，研磨器充分研磨后采用RIPA 緩沖液提取蛋白，檢測蛋白濃度，使各組濃度為3 μg/mL。蛋白上樣量10 μL，蛋白經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后，轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上，將膜放在5%脫脂奶粉溶液中封閉2 h，然后加入抗TP53INP1 抗體和抗β-actin抗體，4 ℃孵育12 h，加入二抗，室溫孵育2 h，LAS 4000 成像系統(tǒng)上顯影，計算目的蛋白相對表達水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 23.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，定量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠超聲心動圖結(jié)果比較

與假手術(shù)組比較，建模后7 d 和14 d AMI 組EDVI、ESVI和LVEF顯著降低（P均＜0.05）；與AMI 組比較，建模后7 d 和14 d miR-17-5p-/-AMI組EDVI、ESVI和LVEF顯著降低，miR-17-5p＋/＋AMI 組EDVI、ESVI和LVEF顯著升高（P均＜0.05）；與miR-17-5p-/-AMI 組比較，建模后7 d 和14 d miR-17-5p＋/＋AMI 組EDVI、ESVI 和LVEF顯著升高（P均＜0.05）；各假手術(shù)組指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 各組小鼠超聲心動圖結(jié)果比較（n=10）

2.2 各組小鼠心肌梗死面積比較

與假手術(shù)組比較，AMI 組心肌梗死面積顯著增加（P＜0.05）；與AMI 組比較，miR-17-5p-/-AMI組心肌梗死面積顯著增加，miR-17-5p＋/＋AMI 組心肌梗死面積顯著降低（P均＜0.05）；與miR-17-5p-/-AMI 組比較，miR-17-5p＋/＋AMI 組心肌梗死面積顯著降低（P＜0.05）；各假手術(shù)組指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2、圖1。

表2 各組小鼠心肌梗死面積結(jié)果比較（n=10）

圖1 TTC染色示各組小鼠心肌梗死面積（×10）

2.3 各組小鼠miR-17-5p、TP53INP1 mRNA水平比較

與假手術(shù)組比較，AMI 組miR-17-5p 表達水平顯著降低，TP53INP1 mRNA 表達水平顯著升高（P均＜0.05）；miR-17-5p 敲除后，miR-17-5p表達水平顯著下降，TP53INP1 mRNA 表達水平顯著升高，miR-17-5p 過表達后，miR-17-5p 表達水平顯著升高，TP53INP1 mRNA 表達水平顯著降低（P均＜0.05）。見表3。

表3 各組miR-17-5p、TP53INP1 mRNA水平比較（n=10）

2.4 各組小鼠TP53INP1蛋白水平比較

與假手術(shù)組比較，AMI 組TP53INP1 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與AMI 組比較，miR-17-5p-/-AMI 組TP53INP1 蛋白表達水平顯著升高，miR-17-5p＋/＋AMI 組TP53INP1 蛋白表達水平顯著降低（P均＜0.05）；與miR-17-5p-/-AMI 組比較，miR-17-5p＋/＋AMI 組TP53INP1 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。見表4、圖2。

表4 各組TP53INP1蛋白水平比較（n=10）

圖2 各組小鼠TP53INP1蛋白表達情況

3 討論

多種因素可影響AMI 后心室不良重構(gòu)的發(fā)生，如血壓、機體免疫功能等[9]。miRNA 參與的表觀調(diào)控在AMI 的發(fā)病機制中起著重要作用，對心室不良重構(gòu)的發(fā)生也具有一定影響[10]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-29a 的表達，可促進血管生成，對受損心臟的功能恢復(fù)有一定作用，其機制是miR-29a 低表達降低了對促血管蛋白的抑制效應(yīng)，從而促進新生血管的形成[11]。在患者發(fā)生AMI 后，miR-93 可通過靶向其下游GATA 結(jié)合蛋白2（GATA2）和P21活化激酶4（PAK4）通路，抑制血管生成，起到減緩重構(gòu)的作用[12]。本研究建立小鼠AMI 模型，對比各組小鼠建模后的心功能情況，發(fā)現(xiàn)建模后AMI 組EDVI、ESVI和LVEF顯著降低，而EDVI、ESVI、LVEF 是心臟射血功能的重要指標(biāo)，可有效反映心室功能狀態(tài)[13]。本研究結(jié)果顯示超聲心動圖的指標(biāo)在一定程度上可以反映出AMI 的心室重構(gòu)情況，EDVI、ESVI、LVEF可能作為AMI后心室重構(gòu)情況的評價指標(biāo)。

miRNA 是基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，可參與調(diào)節(jié)大多數(shù)mRNA 介導(dǎo)的細胞增殖與分化[14]。miR-17-92簇由13號染色體上的7個miRNA（miR-17-5p、miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1 和miR-92a-1）組成，這些miRNA 被轉(zhuǎn)錄為單個多順反子單元，在哺乳動物發(fā)育中起著重要作用[15]。TP53INP1 可能在轉(zhuǎn)錄水平后受到miRNA 的調(diào)控。高表達miR-17-5p 可通過靶向抑制TP53INP1抑制胃癌起始細胞的生長[14]。目前關(guān)于miR-17-5p 的研究主要集中在腫瘤，在其他疾病中的研究鮮有報道。在多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)miR-17-5p 高表達可抑制腫瘤細胞的增殖，提示其高表達可能有利于機體維持正常的生理功能[16-17]，進而推測miR-17-5p 對于AMI 進展可能也存在一定抑制作用。本研究通過基因敲除miR-17-5p 和過表達miR-17-5p 小鼠探討miR-17-5p 對TP53INP1轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-17-5p敲除后，TP53INP1 表達上調(diào)；而miR-17-5p 過表達后，TP53INP1 表達下調(diào)，提示miR-17-5p 可靶向調(diào)節(jié)小鼠TP53INP1 的表達水平。各組超聲心動圖和蛋白印跡檢測結(jié)果提示過表達的miR-17-5p 可有效抑制TP53INP1 表達水平，改善因AMI 引起的心室不良重構(gòu)。為了進一步驗證過表達的miR-17-5p對AMI 后小鼠心肌的作用，本研究檢測各組小鼠心肌梗死面積，結(jié)果提示過表達miR-17-5p 通過抑制TP53INP1 表達，有效降低小鼠心肌梗死面積，有利于改善小鼠AMI 后心室重構(gòu)。本研究也存在一定局限性，后續(xù)可通過體外實驗進行機制研究。

綜上所述，miR-17-5p和TP53INP1異常表達與AMI后心室重構(gòu)密切相關(guān)，其機制可能是miR-17-5p 靶向抑制TP53INP1 的表達。聯(lián)合檢測miR-17-5p 和TP53INP1 表達有望預(yù)測AMI 后心室重構(gòu)。