不同因子對白腐真菌生長的影響研究

王 敏

（阜陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 阜陽 236031）

我國是農(nóng)業(yè)大國，大豆秸稈、玉米秸稈和油菜秸稈在我國產(chǎn)量大，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的殘留物。阜陽是重要的農(nóng)副產(chǎn)品生產(chǎn)基地，秸稈資源豐富。大豆、玉米和油菜等農(nóng)作物秸稈含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，但其化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不易被降解。因此，僅有少量用于生產(chǎn)紙張和飼料等行業(yè)，秸稈被隨意拋棄、放火焚燒秸稈現(xiàn)象依然很嚴(yán)重，影響人民的身體健康。這就會造成資源的浪費，增大環(huán)境污染治理難度。隨著科學(xué)研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)可以采用物理和化學(xué)方法處理降解部分秸稈，但由于實際生產(chǎn)成本、操作和環(huán)境污染等原因，推廣使用范圍較小。后來研究發(fā)現(xiàn)，秸稈中木質(zhì)素也可以利用微生物進行轉(zhuǎn)化。木質(zhì)素是一種大分子芳香族化合物。在木質(zhì)素降解方面，白腐菌被公認是降解能力很強的微生物。胞外氧化酶的產(chǎn)生是降解木質(zhì)素的能力的基礎(chǔ)。木質(zhì)素降解酶系統(tǒng)主要有過氧化物酶和漆酶構(gòu)成，其酶活性影響秸稈的降解程度。白腐真菌作為能降解木質(zhì)素的微生物，受到了人們的廣泛關(guān)注。

張芳芳研究表明，玉米秸稈可以通過白腐真菌被降解，同時白腐真菌還能用于對污染水體的生物修復(fù)。我們只有了解白腐真菌的生長習(xí)性，才能充分發(fā)揮其作用，為環(huán)境的改善做出一定的作用。

白腐菌對秸稈的降解能力在很大程度上要依賴于培養(yǎng)條件。培養(yǎng)發(fā)酵的條件不同，降解秸稈能力也可能出現(xiàn)差異。內(nèi)外環(huán)境因素影響白腐真菌的生長。培養(yǎng)基中碳氮源和金屬離子影響真菌代謝活動，進而影響真菌菌絲生長及降解酶的分泌量。篩選出適合的培養(yǎng)基有利于提高酶活性，這是白腐真菌降解秸稈和污染物的基礎(chǔ)。香菇、杏鮑菇、平菇屬白腐真菌，本文通過培養(yǎng)基的優(yōu)化，觀測不同因子對白腐真菌的生長及漆酶分泌的影響，對白腐真菌降解秸稈和污染水體的修復(fù)具有一定的意義。

1.材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種：平菇、香菇、杏鮑菇（學(xué)院選育）。

1.1.2 秸稈：玉米秸稈、大豆秸稈、油菜秸稈。

1.1.3 設(shè)備儀器：移液槍；高壓蒸汽滅菌器；高速離心機；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱；超凈工作臺；電熱恒溫水浴箱；分光光度計；粉碎機；電子天平。

1.1.4 活化和發(fā)酵培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基：用于菌種保存和活化。

液體種子基礎(chǔ)培養(yǎng)基：刨皮馬鈴薯100g，切成2cm左右方塊置于鍋中，加熱煮沸15min，用紗布將汁濾于大燒杯中，濾液補水到1L。在馬鈴薯濾汁中再分別加人20g葡萄糖、蛋白胨2g、NaH2PO41.5g、MgSO40.75g、酵母粉1.5g，混勻全部溶解后補水至1L，分裝于250mL 錐形瓶中，0.15MPa、121℃高壓滅菌25min。

秸稈發(fā)酵培養(yǎng)基：大豆秸稈粉、玉米秸稈粉和油菜秸稈粉用以下1-6 種培養(yǎng)基進行試驗，添加秸稈粉量如下表1 所示。每種秸稈固體培養(yǎng)基中按表1 配方各加入20 克瓊脂。

表1 秸稈粉液體培養(yǎng)基配方

1.2 實驗方法

1.2.1 基質(zhì)處理。秸稈取自阜陽潁州區(qū)周邊農(nóng)家，選擇自然風(fēng)干的無霉變秸稈粉碎成0.5mm 顆粒，滅菌處理，備用。

1.2.2 菌種制備及深層培養(yǎng)方法。從斜面試管中將菌種接種在滅菌平板培養(yǎng)基上，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)定溫度為28℃，培養(yǎng)時間為8 天。待平板培養(yǎng)基菌絲占據(jù)1/2 平板后，用打孔器將直徑5mm 的接種物放入秸稈發(fā)酵培養(yǎng)基1-6 中進行試驗，觀察各平板上菌絲生長的均勻性。以菌絲體日平均生長量和生長勢為指標(biāo)，選擇了一種較好的液體深層培養(yǎng)基配方。

液體深層培養(yǎng)：菌絲體在平板上生長后，取直徑5mm 的接種物，將五個接種塊放入添加大豆秸稈和油菜秸稈的培養(yǎng)基、碳源培養(yǎng)基和氮源培養(yǎng)基中，在無菌條件下，將五個接種塊放入每100ml 液體培養(yǎng)基中，并在28℃下以150r/min 的速度搖床12 天。每個實驗重復(fù)3 次。

1.2.3 菌絲體生物量的測定。發(fā)酵8 天后，用蒸餾水清洗真菌球上未過濾的秸稈粉，以每分鐘3000 轉(zhuǎn)的速度離心15 分鐘，然后置于65℃烘箱中干燥。用天平稱量其菌絲干重，把3 次平均值記作每種培養(yǎng)基的菌絲體干重量。通過菌絲體干重與培養(yǎng)基體積之比，計算出菌絲體生物量。

1.2.4 粗酶液的制備。在無菌條件下，每48 小時移取發(fā)酵液體。發(fā)酵液經(jīng)單層濾紙過濾后，以每分鐘4000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘，上清液為粗酶液。每個樣品分別取樣3 次。

1.2.5 漆酶(Lac)活性檢測。以3，3’-二甲基聯(lián)苯胺為底物，在比色皿中加入0.01mol L-1·的pH 值為4.0 醋酸鹽緩沖液3.4ml 和0.5ml 一定濃度的3，3-二甲基聯(lián)苯胺，混勻后加入0.1ml 稀釋酶溶液，檢測在25℃恒溫水箱反應(yīng)5min 時600nm 處吸光值。將樣品在沸水中煮15min 后酶液為對照，將單位時間內(nèi)吸光值的變化表示酶活變化。單位時間內(nèi)每毫升OD 值改變0.01，作為一個酶活單位。

2.結(jié)果與分析

2.1 不同配方對白腐真菌生長的影響

表2 顯示了在液體培養(yǎng)基中添加不同量的秸稈粉培養(yǎng)條件下，對白腐真菌菌絲體均勻度和菌絲體生物量的影響。

表2 白腐真菌在不同培養(yǎng)液條件下的培養(yǎng)結(jié)果

本次研究中，主要抽選了大豆秸稈、油菜秸稈、玉米秸稈作為白腐真菌培養(yǎng)的基質(zhì)。通過表2 可知，試驗所選的3 種秸稈粉添加量均有利于白腐真菌菌絲生長，尤其是當(dāng)添加20g/L 大豆秸稈和20g/L 油菜秸稈培養(yǎng)基時，菌絲生物量是對照組的三倍。處理5 的菌絲生物量最大，培養(yǎng)后菌絲球大小均勻。處理5 的菌絲生物量與其他處理顯著不同。綜合分析表明，處理5 更適合三種白腐菌的液體培養(yǎng)。后期液體發(fā)酵培養(yǎng)基選用處理5 配方。

由上述實驗表明，在白腐真菌生長培養(yǎng)時加入一定量的秸稈粉，能為其生長提供所需的養(yǎng)分，對白腐真菌的生長具有一定的促進作用，從而使白腐真菌能夠更加快速的生長。白腐真菌在不同秸稈中生長狀況的差異，可能是由于不同的秸稈中所含的營養(yǎng)成分不同。

2.2 碳源對白腐真菌分泌漆酶的影響

碳源是真菌的碳骨架和能量來源。限制碳源不利于微生物的生長。碳源在真菌的生長中起著非常重要的作用。

本實驗研究了不同碳源對白腐菌生長的影響。以尿素為氮源，用5 個2%的碳源代替基本培養(yǎng)基中的葡萄糖。以蔗糖、可溶性淀粉、麩皮、纖維素和玉米粉為碳源，置于28℃培養(yǎng)，并于第12 天取樣測定漆酶活性。

結(jié)果表明，在選擇的碳源中，麩皮為碳源時漆酶活性最高，其次為纖維素和葡萄糖。麥麩中含有豐富的纖維素、木質(zhì)素、維生素等物質(zhì)，在平菇、香菇、杏鮑菇培養(yǎng)基中添加一定量的麩皮，能促進漆酶的分泌。這可能是由于木質(zhì)素能作為漆酶的誘導(dǎo)劑，在一定程度上促進了漆酶的產(chǎn)生。因此，在培養(yǎng)過程中可以看到添加麩皮的培養(yǎng)基中漆酶活性較高。從實驗結(jié)果看，麥麩是平菇、香菇、杏鮑菇產(chǎn)生漆酶的較好碳源。

2.3 氮源對白腐真菌分泌漆酶的影響

本次實驗以尿素、硫酸銨、硝酸銨、酒石酸銨、酵母浸膏為不同氮源，觀測香菇、平菇、杏鮑菇在不同氮源作用下的生長情況。三種白腐真菌在各種氮源培養(yǎng)基中生長到12 天時進行漆酶活性測定。氮源培養(yǎng)基以麩皮為碳源。

圖2 中顯示，在試驗選定的幾種氮源中，當(dāng)酵母抽提物為氮源時，香菇、平菇、杏鮑菇漆酶活力都達到較高值，若選NH4NO3為氮源時漆酶活力較差，這表明酵母抽提物可以作為最適合酶生產(chǎn)的氮源，酒石酸銨和蛋白胨也是較好的氮源，產(chǎn)生的酶活性與酵母抽提物差距不明顯。氮源的消耗直接影響木質(zhì)素降解酶的產(chǎn)生，木質(zhì)素降解酶是一種次生代謝酶。在自然狀態(tài)下，通常在氮源耗盡時產(chǎn)生。

2.4 銅離子對白腐真菌分泌漆酶的影響

漆酶的活性中心是由四個銅離子組成。銅作為漆酶蛋白的重要結(jié)構(gòu)成分，不僅影響漆酶的活性和穩(wěn)定性，而且是誘導(dǎo)漆酶產(chǎn)生的重要因素。

如圖3 所示，銅離子添加一定量，能提高漆酶活性，濃度增至50mg/L 以上時，會轉(zhuǎn)變?yōu)橐种破崦负铣?。?dāng)Cu2+在20～40mg/L 濃度范圍時，酶活性與對照相差不明顯。這可能是因為低濃度時Cu2+只與酶表層附近的基團有結(jié)合作用，幾乎對漆酶的結(jié)構(gòu)沒什么影響，對漆酶內(nèi)部呼吸鏈傳遞影響不大，使得激活效果不明顯。

當(dāng)Cu2+在50mg/L 時，香菇、平菇、杏鮑菇的漆酶活性相對較高。當(dāng)Cu2+濃度超過50mg/L 時，這三種菌株漆酶活性反而降低了。這可能是由于酶的活性中心結(jié)合點被飽和，高濃度的Cu2+與酶的活性中心外的結(jié)合點增多，過多的結(jié)合點也會改變酶的結(jié)構(gòu)，影響電子傳遞，出現(xiàn)漆酶從高活性狀態(tài)激活變?yōu)榈突钚?，隨著底物消耗，酶活性出現(xiàn)抑制現(xiàn)象。銅缺乏和銅限制不利于漆酶的合成。Cu2+可能通過與漆酶中的酸性氨基酸殘基相互作用或通過影響漆酶的電荷平衡來影響漆酶活性。這可能是由于漆酶基因的轉(zhuǎn)錄需要銅離子來合成蛋白質(zhì)。

3.討論

本實驗研究中分別選擇6 種不同的碳源和氮源，考察對漆酶活性影響。試驗表明，同一種酶在不同營養(yǎng)條件下其活性不同。在不同培養(yǎng)條件下，香菇、平菇、杏鮑菇分泌的漆酶活性也有差異，一方面可能是由于不同菌株具有生理上差異，另一方面可能是不同的培養(yǎng)體系對不同菌株木質(zhì)素降解酶的分泌影響不同。因此，合理的物質(zhì)配比對白腐菌的生長和木質(zhì)素降解酶的分泌有著決定性的影響。

不同的因子影響著白腐真菌的不同方面，其中較為重要的就是培養(yǎng)基。培養(yǎng)基是白腐真菌得以生存發(fā)展的基礎(chǔ)，培養(yǎng)基質(zhì)、碳源、氮源、金屬離子等都對白腐真菌的生長有一定的影響，只有研究好白腐真菌的影響因素，才能更好的培育白腐真菌，使之運用到更加廣泛、更需要的環(huán)境之中。木屑、腐爛的樹枝、農(nóng)業(yè)廢棄物等都可以作為白腐真菌培養(yǎng)的原料，我們可以充分利用白腐真菌培養(yǎng)的容易性，對白腐真菌進行培養(yǎng)，使白腐真菌能更多的為保護環(huán)境而做出努力。