恩格列凈通過抑制iNOS 改善脂多糖誘導的高血糖和對心臟功能的影響

鈕燕，朱靜，嚴久瓊

海軍官兵尤其是艦艇部隊及登陸作戰(zhàn)官兵在發(fā)生開放性外傷的同時，往往面臨著傷口被海水浸泡的問題。目前開放性外傷治療上最大難題是感染，因為海水中存在多種致病菌，開放性外傷經(jīng)海水浸泡后細菌入侵和增殖，往往會加重感染的嚴重程度，甚至發(fā)生膿毒血癥［1］。膿毒血癥患者常伴隨著許多代謝改變，包括胰島素抵抗和高血糖等，這些代謝改變會加劇感染，延緩疾病的恢復等［2-3］。膿毒血癥作為一種重大疾病，應激誘導的高血糖很常見，并且與患者預后相關［4-5］。此外，應激誘導的高血糖通過氧化應激和炎癥反應等機制降低心臟功能，而采用胰島素治療降低應激性高血糖可以改善心臟功能，但是有研究報道重癥膿毒血癥患者采用胰島素強化降糖治療會增加患者低血糖等不良事件的風險［6］。因此，開發(fā)有效降低應激性高血糖但又不會引起低血糖的治療策略對膿毒血癥患者心臟功能保護具有重要的意義。

鈉葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白2 抑制劑（sodium glucose cotransporter 2 inhibitors，SGLT2i）是首個有效減少2 型糖尿病患者心力衰竭和心血管死亡的降糖化合物，SGLT2i 被明確用于抑制腎臟中的鈉葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白2（SGLT2）［7］。最近大量研究表明，SGLT2i——恩格列凈（empagliflozin, Empa）對各種類型的心臟細胞和心臟功能具有直接作用，Empa在心肌細胞和內(nèi)皮細胞缺氧/復氧后能夠維持細胞活力和腺苷三磷酸（ATP）含量，從而恢復高血糖和腫瘤壞死因子（TNF）-α 刺激的主動脈環(huán)和高血糖內(nèi)皮細胞的血管反應性［8-9］。在離體的小鼠心臟中，Empa 可以誘導血管舒張［10］。在離體心臟的缺血再灌注研究中，Empa 在缺血期間能夠延遲攣縮的發(fā)展，并在缺血后增加線粒體呼吸［11］。由此可見，Empa 對心臟具有廣泛的保護作用，但是Empa 通過何種機制改善細菌脂多糖（LPS）誘導的高血糖和心臟功能障礙尚未明確。

既往研究報道，心臟中不存在SGLT2 的表達，提示Empa 改善LPS 誘導的心臟功能障礙并非直接通過作用于SGLT2 而發(fā)揮效應［12-13］。LPS 是革蘭氏陰性菌血癥和膿毒血癥引起的許多宿主反應的關鍵介質(zhì)，可誘導許多參與免疫、炎癥和急性期反應的基因［14］。這些基因中，誘導型一氧化氮合酶（iNOS）與膿毒血癥和內(nèi)毒素血癥等有害宿主的反應有關。敲除iNOS 的小鼠對LPS 誘導的低血壓有抵抗力［15］。與iNOS 基因敲除小鼠的數(shù)據(jù)一致，iNOS 抑制劑氨基胍可降低野生型小鼠注射LPS 后的死亡率［16］。本研究旨在探討Empa 通過抑制iNOS 改善LPS 誘導的高血糖和心臟功能障礙。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重200～250 g，購自上海吉輝實驗動物飼養(yǎng)有限公司［許可證號：SCXK（滬）2017-0012］。SD 大鼠飼養(yǎng)在氣溫恒定為25°C 的動物房，并以12/12 h 的明暗循環(huán)照明。SD 大鼠可自由獲取標準嚙齒動物飼料以及隨意飲水。本研究方案得到海軍軍醫(yī)大學實驗動物管理委員會批準，有關動物實驗操作均接受了實驗動物管理委員會的評估和認證。

1.2 實驗動物模型和分組 20 只SD 大鼠隔夜禁食18 h 后，按數(shù)字表法隨機分為4 組，每組5 只，分別腹腔注射單純生理鹽水（NS）、Empa、LPS、LPS 聯(lián)合Empa（LPS+Empa）。LPS 溶液給藥劑量20 mg/kg，LPS 來源于055：B5 血清型大腸桿菌（Sigma，美國），0.25 g LPS 溶解于100 ml 生理鹽水中，根據(jù)大鼠體重，按照8 ml/kg 的LPS 溶液腹腔注射［17］；Empa（Sigma）給藥劑量5 mg/kg，0.062 5 g Empa 溶解于100 ml 生理鹽水中，根據(jù)大鼠體重，按照8 ml/kg 的Empa 溶液腹腔注射［18］。

1.3 血糖測量 大鼠分別于腹腔注射后0、60、120、180 和240 min 從尾靜脈獲取血樣，通過Elite血糖儀（Bayer，Elkhart，IN）測量血糖。

1.4 心臟功能 通過心室內(nèi)插管，測量SD 大鼠左心室舒張末期壓力（LVEDP）、壓力變化最大上升速率（+dP/dt）和最大下降速率（?dP/dt），由左心室壓力變化來評估心臟功能［19］。簡要步驟如下：SD 大鼠腹腔注射造模完成240 min 后，稱重，腹腔注射尿脂800 mg/kg 和α-氯醛糖40 mg/kg 的混合麻醉液，麻醉大鼠。固定動物，備皮，在頸部正中切口，逐層暴露頸部肌肉和氣管，鈍性分離氣管，插入氣管插管，固定氣管插管，保持大鼠氣道通暢。鈍性分離大鼠右側(cè)頸部肌肉，暴露頸動脈鞘，游離右側(cè)頸總動脈，插入PE 動脈插管，通過PowerLab 生物信號采集系統(tǒng)，記錄大鼠頸總動脈血壓。穩(wěn)定后，繼續(xù)插入動脈插管，深度為3.5～4.0 cm，當觀察到血壓波形脈壓差增大，表明動脈插管已經(jīng)進入左心室，等波形穩(wěn)定后，連續(xù)記錄左心室內(nèi)壓力10 min，計算LVEDP、+dP/dt 和?dP/dt，心功能指標記錄結束后，過量麻醉使大鼠安樂死，取出心臟，清除血液，液氮冷凍，轉(zhuǎn)移至?80 ℃冰箱，待用。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測心臟組織iNOS 蛋白表達 剪取心尖處100 mg 的心臟組織，液氮處理后研磨組織塊，按照說明書比例，加入RIPA 裂解液（P0013B，碧云天生物科技有限公司），提取大鼠心臟總蛋白，4 ℃靜置10 min 后，3 000 r/min 離心提取上清，離心半徑為5 cm，通過BCA 法測定上清液的蛋白濃度。按照終濃度為4 μg/μl 加入蛋白變性上樣緩沖液，變性10 min，備用。處理好的心臟蛋白樣本進行SDS-PAGE 電泳，通過轉(zhuǎn)膜、封閉和洗膜，加入iNOS 一抗（ab178945，英國Abcam 公司），一抗孵育濃度為1∶1 000，以GAPDH 作為內(nèi)參，4 ℃孵育一抗，過夜，洗膜后，室溫孵育二抗1.5 h，洗膜后，經(jīng)化學發(fā)光法顯示蛋白條帶，并采用Gel-Pro Analyzer 1 軟件對蛋白條帶灰度值進行分析。

1.6 Elisa 檢測心臟組織中一氧化氮（NO）水平如1.5 實驗中提取心臟組織，獲取組織上清液，通過BCA 試劑盒測定所有樣本上清液的蛋白質(zhì)水平。采用總NO 檢測試劑盒（碧云天公司，S0023），通過心臟組織中硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量來反映心臟樣本中NO 的水平。按照總NO 檢測試劑盒操作說明書，簡要步驟如下：配制NADPH、標準品等試劑待用。按說明書加樣順序往96 孔板中依次加入標準品、樣品以及實驗所需的試劑進行檢測，加樣結束后，通過酶標儀檢測540 nm 處吸光度，根據(jù)標準曲線，計算每個樣本硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量，最后用硝酸鹽和亞硝酸鹽含量與相應樣品蛋白濃度的比值來反映各心臟樣本的NO 水平。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism 6.0 軟件進行統(tǒng)計分析，呈現(xiàn)正態(tài)分布的計量資料以±s表示,組間比較采用t檢驗。各組大鼠處理后不同時間點血糖水平采用重復測量的方差分析進行數(shù)據(jù)分析，各組心功能、iNOS 蛋白表達和NO 水平的差異采用單因素方差分析進行檢驗，組間差異采用采用Tukey 檢驗進行多重比較。檢驗水準α 為0.05。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠腹腔注射后不同時間點血糖水平 尾靜脈取血進行血糖水平檢測結果顯示，與同時間點NS 組相比，LPS 組在腹腔注射后60、120 和180 min 血糖水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而與LPS 組比較，LPS+Empa 組在60 min 和120 min 血糖水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠腹腔注射后不同時間點尾靜脈血糖水平比較（mmol/L，± s，每組n=5）

表1 各組大鼠腹腔注射后不同時間點尾靜脈血糖水平比較（mmol/L，± s，每組n=5）

注：與NS 組比較aP＜0.05；與LPS 組比較bP＜0.05。NS 為生理鹽水，Empa 為恩格列凈，LPS 為脂多糖

LPS+Empa 組3.6±0.3 5.5±0.4b 5.1±0.3b 4.3±0.5 3.5±0.2時間0 min 60 min 120 min 180 min 240 min NS 組3.7±0.4 3.6±0.3 4.0±0.5 3.3±0.1 3.7±0.2 Empa 組3.6±0.2 3.4±0.2 3.7±0.3 3.4±0.3 4.3±0.3 LPS 組3.4±0.3 6.3±0.5a 6.9±0.3a 4.5±0.5a 3.5±0.4

2.2 大鼠心功能指標 心功能檢測指標顯示，與NS 組相比，LPS 組LVEDP 和?dP/dt 顯著升高，+dP/dt顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而與LPS 組比較，LPS+Empa 組LVEDP、+dP/dt 和?dP/dt顯著改善，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠心功能指標比較（± s，每組n=5）

表2 各組大鼠心功能指標比較（± s，每組n=5）

注：與NS 組比較aP＜0.05；與LPS 組比較bP＜0.05。+dP/dt 為心室壓力變化最大上升速率，?dP/dt 為心室壓力變化最大下降速率，LVEDP 為左心室舒張末期壓力，NS 為生理鹽水，Empa 為恩格列凈，LPS 為脂多糖

LPS+Empa 組6 519±442b?6 760±631b 10.8±1.6b項目+dP/dt（mmHg/s）?dP/dt（mmHg/s）LVEDP（mmHg）NS 組9 193±720?8 811±906 2.2±1.0 Empa 組8 390±232?8 802±1 003 4.0±0.7 LPS 組4 919±345a?4 942±629a 14.1±1.5a

2.3 大鼠心臟組織中iNOS 表達和NO 水平 與NS組相比，LPS 組心臟組織中iNOS 蛋白表達和NO 水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而與LPS組比較，LPS+Empa 組心臟組織中iNOS 蛋白表達和NO水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1 和表3。

表3 各組大鼠心臟組織中iNOS 表達和NO 水平比較（± s，每組n=5）

表3 各組大鼠心臟組織中iNOS 表達和NO 水平比較（± s，每組n=5）

注：與NS 組比較aP＜0.05；與LPS 組比較bP＜0.05。NS 為生理鹽水，Empa 為恩格列凈，LPS 為脂多糖，iNOS 為誘導型一氧化氮合酶，NO 為一氧化氮

LPS+Empa 組1.35 ± 0.14b 3.92 ± 0.34b項目iNOS 蛋白NO（μmol/g）NS 組1.00 ± 0.21 1.79 ± 0.30 Empa 組0.89 ± 0.12 1.90 ± 0.51 LPS 組1.76 ± 0.14a 5.48 ± 0.75a

圖1 各組大鼠心臟組織中iNOS 蛋白表達條帶

3 討論

膿毒血癥是宿主對感染或損傷的全身性有害反應，是導致經(jīng)海水浸泡外傷的海軍官兵感染和死亡的主要原因。盡管發(fā)展為膿毒血癥的患者的住院死亡率在膿毒癥生存運動指南推出后的2 年內(nèi)從37%下降至30.8%，但死亡率仍然很高［20］。2012 年，一項關于膿毒血癥負擔的全球研究估計，嚴重膿毒血癥患者的死亡率接近50%［21］。心血管功能異常在膿毒血癥的發(fā)病機制中起重要作用。大量研究表明，心臟功能障礙是膿毒血癥患者常見的臨床表現(xiàn)，其中大約50%的膿毒血癥患者具有心臟功能障礙的跡象［22-23］。然而，膿毒血癥誘導的心臟功能障礙的確切機制仍未明確。本研究以LPS 誘導膿毒血癥為模型，發(fā)現(xiàn)SGLT2i——Empa 可顯著改善LPS 誘導的心臟收縮和舒張功能，并伴隨心臟組織中iNOS 表達和NO 產(chǎn)生的改善，從而發(fā)揮心血管保護作用。

基于動物研究，關于膿毒血癥誘導的心臟功能異常的病理機制的可能假設是冠狀動脈血流量不足導致的整體心肌缺血［24-25］。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，伴有心肌功能障礙的感染性休克患者冠狀動脈血流量正?；蛟黾樱?6］，反駁了上述假設。此外，一些研究表明，由于冠狀動脈血流分布明顯不均、內(nèi)皮損傷、血管內(nèi)纖維蛋白沉積和中性粒細胞浸潤，膿毒血癥期間伴有心臟微循環(huán)障礙，可能導致局灶性心肌缺血和心功能下降，但沒有心肌缺氧的證據(jù)［27-29］。這些研究結果表明冠狀動脈循環(huán)改變在膿毒血癥誘導的心臟功能異常的病理生理學機制中不太重要。本研究發(fā)現(xiàn)LPS 誘導膿毒血癥過程中伴隨著高血糖，而采用Empa 可以改善LPS 誘導的高血糖，顯著改善心臟組織中iNOS 表達和NO 產(chǎn)生，這些結果提示Empa 可以較好地控制LPS 誘導的應激性高血糖并改善心臟功能。

在膿毒血癥期間，各種病原體相關分子模式（PAMP），如LPS 以及內(nèi)源性損傷相關分子模式（DAMP），包括高遷移率族框1（HMGB1）和細胞外組蛋白；其與免疫細胞和其他細胞上的Toll 樣受體（TLR）相互作用，除TLR3 外，所有TLR 均通過骨髓分化因子88（MyD88）依賴性途徑發(fā)出信號并激活c-Jun N 末端激酶（JNK）、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）、p38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和轉(zhuǎn)錄因子核因子（NF）-κB 信號通路，進而誘導多種促炎細胞因子的產(chǎn)生，包括白細胞介素（IL）-1、IL-6 和TNF-α［30-31］。這些物質(zhì)被認為是心肌抑制因子，包括TNF-α、IL-1、IL-6、補體過敏毒素（C5a）和LPS 等，最終參與了膿毒血癥誘導的心臟功能異常。有研究表明，激活心肌細胞α1-腎上腺素能受體可抑制LPS 誘導的心肌細胞TNF-α 的表達，改善膿毒血癥期間的心功能不全［32］。此外，另一項研究發(fā)現(xiàn)阻斷α2-腎上腺素能受體可以抑制膿毒血癥動物的心肌TNF-α、iNOS 表達以及心肌細胞凋亡和心功能不全［33］。在炎癥反應中，iNOS 表達可誘導產(chǎn)生大量NO，因此，本研究檢測心臟組織中iNOS 表達和NO水平，并發(fā)現(xiàn)LPS 誘導的膿毒血癥大鼠心臟組織中iNOS 表達和NO 水平顯著升高，而Empa 可以改善LPS 誘導的這些改變，并伴隨著心臟功能的改善。但是，本研究存在不足之處是在評估大鼠心功能時采用了有創(chuàng)的心內(nèi)導管記錄心室內(nèi)壓力的變化，并未進一步開展無創(chuàng)大鼠心臟超聲檢查以及心肌組織病理學形態(tài)評估。

膿毒血癥作為一種重大疾病，應激誘導的高血糖很常見，并且與患者預后相關。本研究采用腹腔注射LPS 誘導膿毒血癥，發(fā)現(xiàn)LPS 可顯著誘導血糖升高，而Empa 可以降低LPS 誘導的高血糖，提示應激性高血糖可能與膿毒血癥誘導的心臟功能異常相關。目前研究認為心臟組織中并不存在Empa 直接作用的SGLT2，而大量研究報道Empa可以改善心衰和糖尿病患者心臟功能［34］，這些結果表明Empa 可以不直接通過作用于SGLT2 而發(fā)揮心臟保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)Empa 可以改善LPS 誘導的iNOS 表達和NO 水平，提示Empa 可能通過iNOS 參與改善膿毒血癥誘導的心臟功能異常。

綜上所述，Empa 可以改善LPS 誘導的心臟功能異常，其機制可能通過與改善高血糖，降低心臟組織中iNOS 表達和NO 水平有關。