經(jīng)典名方保陰煎HPLC指紋圖譜的建立及多成分含量測定方法研究

張曼，李秋晗，謝靜，王佳慧，吳修紅，閆廣利，李丹，王喜軍*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 教育部經(jīng)典名方有效性評價(jià)及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150040；2.京津冀聯(lián)創(chuàng)藥物研究(北京)有限公司，北京 100025)

保陰煎源于明代張景岳著《景岳全書》，由生地黃、熟地黃、白芍、黃柏、黃芩、川續(xù)斷、山藥和甘草組成，具有滋陰清熱、固沖止血的功效，現(xiàn)代臨床用于治療月經(jīng)病[1-4]、妊娠病[5-7]、產(chǎn)后病[8-9]、婦科雜癥[10-12]等,療效確切。保陰煎現(xiàn)收錄于國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《古代經(jīng)典名方目錄(第一批)》，可按照現(xiàn)行中藥注冊3.1類新藥要求通過簡化注冊程序研發(fā)古代經(jīng)典名方保陰煎復(fù)方制劑。

按照古代經(jīng)典名方復(fù)方制劑的研發(fā)要求，首先需研究制定經(jīng)典名方基準(zhǔn)樣品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，作為參照標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)化確定制劑生產(chǎn)工藝和制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保障與傳統(tǒng)湯劑安全性和臨床療效的一致性。經(jīng)典名方基準(zhǔn)樣品的質(zhì)量評價(jià)，需要綜合考慮藥材-飲片-基準(zhǔn)樣品-制劑的相關(guān)性以及與臨床療效的相關(guān)性，采用指紋圖譜或特征圖譜、多成分含量測定等整體控制方式。本研究前期利用中醫(yī)方證代謝組學(xué)技術(shù)篩選了保陰煎治療功能性子宮出血的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)5-羥甲基糠醛、小檗堿、黃芩苷、芍藥苷與功能性子宮出血生物標(biāo)志物高度關(guān)聯(lián)，是保陰煎表達(dá)臨床療效的潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[13]。5-羥甲基糠醛來源于君藥地黃，具有抗氧化[14]、降低雌二醇及孕酮含量和抑制排卵[15]等藥理作用；芍藥苷來源于臣藥白芍，具有鎮(zhèn)痛[16]、抗炎[17]、抗抑郁[18]等藥理作用；小檗堿來源于臣藥黃柏，具有抗菌抗炎、降血壓[19]等藥理作用；黃芩苷來源于佐藥黃芩，具有抗炎、抗氧化、抗抑郁、抗腫瘤等[20]藥理活性。因此，本研究利用高效液相色譜法建立保陰煎基準(zhǔn)樣品的指紋圖譜，并參照中藥質(zhì)量標(biāo)志物屬性[21]，選擇5-羥甲基糠醛、小檗堿、黃芩苷、芍藥苷4個與療效相關(guān)且體現(xiàn)配伍的指標(biāo)成分建立同時含量測定方法，為經(jīng)典名方保陰煎基準(zhǔn)樣品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀-光電二極管陣列檢測器(e2695-2998，美國Waters公司)；十萬分之一電子分析天平(CP-225D，德國SARTORIUS公司)。

1.2 試藥

5-羥甲基糠醛對照品(批號：111626-201912，含量以99.2%計(jì))、芍藥苷對照品(批號：110736-202044，含量以96.8%計(jì))、鹽酸小檗堿對照品(批號：110713-202015，含量以85.9%計(jì))、黃芩苷對照品(批號：110715-201720，含量以93.5%計(jì))、沒食子酸對照品(批號：110831-201605，含量以98.5%計(jì))、甘草苷對照品(批號：111610-201607，含量以96.8%計(jì))、綠原酸對照品(批號：110753-201817，含量以96.8%計(jì))、鹽酸黃柏堿對照品(批號：111895-201805，含量以94.9%計(jì))、黃芩素對照品(批號：111595-201808，含量以97.9%計(jì))等，均購于中國食品藥品檢定研究院；色譜級乙腈、甲醇，美國DIKMA公司；水為超純水。

保陰煎基準(zhǔn)樣品：取日劑量保陰煎處方飲片，按古籍記載方法制備煎液，煎液冷凍干燥，即得。保陰煎處方飲片所用藥材分別采購自3產(chǎn)地，每個產(chǎn)地5批次，具體藥材來源見表1。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜研究

2.1.1 色譜條件

色譜柱為DIKMA Spursil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)- 0.1%磷酸水(B)，線性梯度洗脫程序：0～10 min，2%～10%乙腈；10～40 min，10%～14%乙腈；40～55 min，14%～18%乙腈；55～75 min，18%～30%乙腈；75～85 min，30%～60%乙腈；85～95 min，60%～90%乙腈；95～100 min，90%～95%乙腈。流速為1.0 mL/min，檢測波長為230 nm，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣體積5 μL。

2.1.2 供試品溶液的制備

取基準(zhǔn)樣品約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇和無水乙醇(1∶1)混合溶劑20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用溶劑補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 方法學(xué)考察

2.1.3.1 精密度試驗(yàn)

取基準(zhǔn)樣品，按2.1.2項(xiàng)下方法制備保陰煎供試品溶液，連續(xù)測定6次，采集指紋圖譜，選擇芍藥苷作為參比峰，各峰的相對保留時間及相對峰面積RSD均<3.0%，結(jié)果表明，該儀器的精密度良好，符合指紋圖譜要求。

2.1.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取基準(zhǔn)樣品，按2.1.2項(xiàng)下方法制備保陰煎供試品溶液，分別于制備后0、3、6、9、12、18、24 h進(jìn)樣采集HPLC色譜圖，選擇芍藥苷作為參照峰，計(jì)算共有峰的相對保留時間及相對峰面積，計(jì)算RSD。指紋圖譜共有峰在24 h內(nèi)的相對保留時間RSD值<1.2%、相對峰面積RSD值<3.0 %，表明24 h內(nèi)供試品溶液具備良好的穩(wěn)定性。

2.1.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取基準(zhǔn)樣品，按照2.1.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，測定HPLC色譜圖，選擇芍藥苷作為參照峰，記錄共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果指紋圖譜中的相對保留時間RSD值均<1.0%，共有峰相對峰面積RSD值均<3.0%，說明該方法具備良好的重復(fù)性。

2.1.4 保陰煎指紋圖譜的建立

2.1.4.1 指紋圖譜相似度計(jì)算

取15批保陰煎基準(zhǔn)樣品，按照2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1.1項(xiàng)下方法測定HPLC色譜圖，見圖1。將得到的各批次基準(zhǔn)樣品指紋圖譜輸入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2012.130723版)”，進(jìn)行多點(diǎn)校正和匹配，得出保陰煎基準(zhǔn)樣品對照指紋圖譜，見圖2。確定20個共有峰并記錄峰面積，計(jì)算相似度，結(jié)果見表2。15 批保陰煎基準(zhǔn)樣品指紋圖譜與其生成的對照指紋圖譜的相似度均>0.9，說明15批飲片制備的基準(zhǔn)樣品質(zhì)量基本一致。為保障基準(zhǔn)樣品質(zhì)量，暫定保陰煎基準(zhǔn)樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度應(yīng)>0.9。

表2 15批保陰煎基準(zhǔn)樣品指紋圖譜的相似度評價(jià)結(jié)果

圖1 15批保陰煎基準(zhǔn)樣品HPLC指紋圖譜

圖2 保陰煎基準(zhǔn)樣品HPLC對照指紋圖譜

2.1.4.2 指紋圖譜共有峰的歸屬

取保陰煎基準(zhǔn)樣品、各單味飲片及各缺味方飲片的水煎液凍干粉，按照2.1.2項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件采集HPLC色譜圖，見圖3。將保陰煎基準(zhǔn)樣品HPLC指紋圖譜中各峰與飲片、缺味方的指紋圖譜進(jìn)行比對，確定保陰煎基準(zhǔn)樣品HPLC指紋圖譜中各峰的歸屬。結(jié)果顯示，在保陰煎基準(zhǔn)樣品 HPLC指紋圖譜中1、6、8號峰來源于白芍，2號峰來源于生地黃和熟地黃，4、5、7、9、16號峰來源于黃柏，10、12、15、17、18、19、20號來源于黃芩，3、4、13、14號峰來源于續(xù)斷，4、11、14號來源于甘草。

圖3 保陰煎供試品溶液及各單味藥材、缺味方供試品溶液的HPLC色譜圖

2.1.4.3 指紋圖譜共有峰的指認(rèn)

制備中藥化學(xué)對照品溶液，按照保陰煎基準(zhǔn)樣品指紋圖譜測定方法測定HPLC色譜圖，比較保留時間和紫外吸收光譜圖，對保陰煎基準(zhǔn)樣品20個共有峰中的12個色譜峰進(jìn)行了指認(rèn)，其中1號色譜峰為沒食子酸，2號色譜峰為5-羥甲基糠醛，4號色譜峰為綠原酸，5號色譜峰為黃柏堿，7號峰為木蘭堿，8號色譜峰為芍藥苷，11號色譜峰為甘草苷，15號色譜峰為黃芩苷，16號色譜峰為小檗堿，18號色譜峰為含漢黃芩苷，19號色譜峰為黃芩素，20號色譜峰為漢黃芩素，見圖4。

注:1.沒食子酸；2.5-羥甲基糠醛； 4.綠原酸；5.黃柏堿；7.木蘭堿；8.芍藥苷；11.甘草苷；15.黃芩苷；16.小檗堿；18.漢黃芩苷； 19.黃芩素； 20.漢黃芩素。圖4 保陰煎基準(zhǔn)樣品HPLC指紋圖譜共有峰的指認(rèn)

2.2 含量測定研究

2.2.1 色譜條件

色譜柱為Waters Symmetry?C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.1%磷酸水，線性梯度洗脫程序：0～7 min，16%乙腈；7～8 min，16%～20%乙腈；8～10 min，20%～25%乙腈；10～20 min，25%～30%乙腈。芍藥苷、小檗堿、黃芩苷及5-羥甲基糠醛的檢測波長分別為231 nm、264 nm、277 nm、284 nm，柱溫40 ℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣體積10 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備

取芍藥苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷及5-羥甲基糠醛對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL含0.90 mg、1.21 mg、1.03 mg、0.07 mg的對照品儲備液。分別精密量取上述對照品儲備液適量，置于同一容量瓶中，加甲醇定容，配制成濃度為每1 mL分別含芍藥苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷和5-羥甲基糠醛46.99 μg、24.22 μg、171.20 μg、2.90 μg的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

稱取保陰煎基準(zhǔn)樣品約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用75%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性溶液的制備

按照保陰煎基準(zhǔn)樣品的制備工藝分別制備缺地黃、缺黃柏、缺白芍、缺黃芩的保陰煎基準(zhǔn)樣品的陰性樣品，再按2.2.3項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.2.5 方法學(xué)考察

2.2.5.1 專屬性試驗(yàn)

按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定芍藥苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、5-羥甲基糠醛對照品溶液、保陰煎基準(zhǔn)樣品供試品溶液和缺白芍、缺黃柏、缺黃芩及缺地黃的陰性樣品溶液，所得HPLC色譜圖見圖5。結(jié)果顯示陰性樣品溶液在對照品峰相應(yīng)位置處無干擾，各成分峰分離度良好。

注：a.對照品溶液；b.陰性對照溶液；c.保陰煎基準(zhǔn)樣品供試品溶液;1.芍藥苷；2.鹽酸小檗堿；3.黃芩苷；4.5-羥甲基糠醛。圖5 保陰煎基準(zhǔn)樣品多成分含量測定專屬性考察HPLC色譜圖

2.2.5.2 線性關(guān)系

取2.2.2項(xiàng)下制備的芍藥苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷和5-羥甲基糠醛對照品儲備液，精密量取適量，加甲醇稀釋制成每1 mL含芍藥苷186.70 μg、鹽酸小檗堿84.60 μg、黃芩苷632.40 μg、5-羥甲基糠醛10.97 μg的混合對照品溶液，再逐級稀釋，共制得6個濃度的混合對照品溶液；取上述對照品溶液各10 μL，按照2.2.1項(xiàng)下的色譜條件測定其峰面積。以對照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)(x)，峰面積為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表3。

表3 各成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍

芍藥苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(r)均>0.999，分別在5.83～186.70 μg/mL、2.64～84.60 μg/mL、19.76～632.40 μg/mL、0.34～10.97 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5.3 精密度試驗(yàn)

取保陰煎基準(zhǔn)樣品，按照2.2.3制成供試品溶液，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測定6次，記錄峰面積并計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)差值。結(jié)果顯示芍藥苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、5-羥甲基糠醛峰面積的RSD值分別為1.18%、0.93%、0.93%、0.89%，表明儀器精密度良好。

2.2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取保陰煎基準(zhǔn)樣品，按照2.2.3項(xiàng)下制備方法制成6份供試品溶液，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積并計(jì)算各成分含量及相對標(biāo)準(zhǔn)差值。結(jié)果顯示芍藥苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、5-羥甲基糠醛平均含量的RSD值分別為0.58%、0.20%、0.23%、0.77%，表明供試品溶液制備方法重復(fù)性良好。

2.2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照2.2.3項(xiàng)下方法制備保陰煎基準(zhǔn)樣品供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，分別在制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣，計(jì)算芍藥苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、5-羥甲基糠醛峰面積的RSD值分別為0.78%、0.42%、0.39%、1.40%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5.6 加樣回收率試驗(yàn)

取保陰煎基準(zhǔn)樣品9份，每份約0.05 g，精密稱定，分別按已知含量的50%、100%、150%加入對照品5-羥甲基糠醛、芍藥苷、鹽酸小檗堿和黃芩苷，每個濃度設(shè)置3個平行樣品，按照2.2.3項(xiàng)下制備方法制成供試品溶液，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算各成分的加樣回收率，結(jié)果顯示芍藥苷、小檗堿、黃芩苷及5-羥甲基糠醛的平均回收率范圍分別為97.63%～102.03%、98.26%～101.60%、97.30%～101.60%、87.24%～90.39%，RSD值均<3%，符合《中國藥典》要求。

2.2.6 保陰煎基準(zhǔn)樣品的含量測定

根據(jù)上述色譜條件及供試品溶液制備方法的考察結(jié)果，本研究建立的保陰煎基準(zhǔn)樣品中5-羥甲基糠醛、芍藥苷、小檗堿、黃芩苷的同時含量測定方法可用于多批次保陰煎基準(zhǔn)樣品的含量測定。取15批保陰煎基準(zhǔn)樣品，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。記錄樣品中5-羥甲基糠醛、芍藥苷、小檗堿和黃芩苷及其隨行對照品的峰面積，按照外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算各成分含量，結(jié)果見表4。

表4 15批保陰煎基準(zhǔn)樣品中各成分的含量

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

由于甲醇具有較強(qiáng)的紫外末端吸收，作為流動相在梯度洗脫中出現(xiàn)了顯著的基線漂移，故在保陰煎指紋圖譜檢測時選擇紫外末端吸收較弱的乙腈作為流動相的有機(jī)相。保陰煎既含有黃芩苷等酸性成分，又含有小檗堿等堿性成分，色譜分離流動相中必須添加改性劑，故對乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.15%磷酸水的流動相組成系統(tǒng)進(jìn)行考察。根據(jù)色譜峰的數(shù)目、峰型及分離度，可以明顯看出流動相為乙腈-0.1%磷酸水時，峰型良好且分離度良好。在210～400 nm波長范圍內(nèi)采集HPLC色譜圖，對比發(fā)現(xiàn)，檢測波長為230 nm時，能獲得最多的峰，各峰強(qiáng)度均適中。

在含量測定時，采集芍藥苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、5-羥甲基糠醛在200～400 nm的紫外光譜圖，觀察各成分的紫外吸收特征，分別選擇芍藥苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、5-羥甲基糠醛在231 nm、264 nm、277 nm、284 nm的達(dá)峰波長為保陰煎中該成分的檢測波長。分別考察甲醇-0.1%磷酸水和乙腈-0.1%磷酸水的洗脫系統(tǒng)，結(jié)果顯示乙腈-0.1%磷酸水為流動相時分離度良好。進(jìn)一步對柱溫進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)柱溫為40 ℃時各峰在其檢測波長下均能達(dá)到基線分離，峰型較好，峰面積適中。

3.2 供試品溶液制備方法考察

本實(shí)驗(yàn)在建立指紋圖譜及含量測定方法時均對取樣量、提取時間及提取溶劑進(jìn)行考察，優(yōu)選供試品溶液制備方法。根據(jù)各成分的峰面積、峰型及分離度，最終選擇1.0 g基準(zhǔn)樣品用甲醇-無水乙醇(1∶1)超聲提取30 min制備指紋圖譜供試品溶液，0.10 g基準(zhǔn)樣品用75%甲醇超聲提取30 min制備含量測定供試品溶液，能夠使各峰均能獲得最優(yōu)提取。

3.3 分析方法評價(jià)

本研究首先利用高效液相色譜法建立了保陰煎指紋圖譜，確定了20個共有峰，包含了保陰煎組方藥味白芍、續(xù)斷、黃芩、黃柏、甘草的特征成分。該指紋圖譜僅檢測到來自生地黃和熟地黃的5-羥甲基糠醛，也沒有發(fā)現(xiàn)山藥的成分，主要是由于采用紫外檢測器，一些紫外吸光系數(shù)較小的成分和含量相對很低的成分難以獲得檢測，例如地黃苷D、梓醇及山藥甾體皂苷等成分[22-23]。對于此類成分，本研究通過薄層色譜法進(jìn)行了定性鑒別。

保陰煎主治一切陰虛內(nèi)熱動血等證，現(xiàn)代文獻(xiàn)報(bào)道多用于先兆性流產(chǎn)和功能性子宮出血的治療[24-25]。本研究前期利用中醫(yī)方證代謝組學(xué)方法，闡釋了保陰煎治療功能性子宮出血的生物效應(yīng)，鑒定了63個原型入血成分和10個代謝產(chǎn)物，其中來自生地黃和熟地黃的5-羥甲基糠酸(原型成分為5-羥甲基糠醛)、來自白芍的芍藥苷、來自黃芩的黃芩苷、來自黃柏的小檗堿，是與生物標(biāo)志物高度相關(guān)的體內(nèi)顯效成分，可作為保陰煎關(guān)鍵質(zhì)量標(biāo)志物[13]。因此，本研究在指紋圖譜分析基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化色譜條件和供試品溶液制備方法，建立了這4個關(guān)鍵質(zhì)量標(biāo)志物的同時含量測定方法。

4 結(jié)論

本研究建立了保陰煎基準(zhǔn)樣品HPLC指紋圖譜檢測方法，通過15批基準(zhǔn)樣品的測定，確定了對照指紋圖譜及20個共有峰，暫定相似度大于0.9。選擇藥效相關(guān)、體現(xiàn)配伍的4個成分芍藥苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、5-羥甲基糠醛，作為保陰煎基準(zhǔn)樣品質(zhì)控成分，利用HPLC建立了同時含量測定方法。結(jié)合指紋圖譜和多成分含量測定，為保陰煎基準(zhǔn)樣品的整體質(zhì)量控制及其復(fù)方制劑的開發(fā)提供了方法。