Omicron 株新型冠狀病毒滅活疫苗（Vero 細(xì)胞）原液特異性鑒別試驗(yàn)RT-PCR 法的建立及驗(yàn)證

楊安納，龐德欽，周以斯，楊潔，楊東升，吳杰，孟勝利，王澤鋆，郭靖，申碩

武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，湖北 武漢 430060

2019年12月以來(lái)，由新型冠狀病毒引起的新型冠狀病毒肺炎迅速在全球蔓延，隨后出現(xiàn)多種突變株。從2021年11月9日在南非采集，并于2021年11月24日向WHO 報(bào)告的樣本中，首次確認(rèn)了B.1.1.529 突變株［1-2］。WHO 于 2021年11月26日將該突變株列為第5 種“密切關(guān)注突變體”（variant of concern，VOC），以希臘字母命名法命名為Omicron（奧密克戎）［3］。截至2022年3月中旬，在全球范圍內(nèi)每日新增的140 多萬(wàn)患者中，超過(guò)99%的感染均由Omicron 突變株引起，該毒株已成為全球超過(guò)150個(gè)國(guó)家或地區(qū)的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)流行毒株；較以前的突變株更容易感染年輕人和中年人［4］，且具有更強(qiáng)的傳播能力［5］，在肺部的復(fù)制性低于Delta 突變株和原型株［6-7］。目前有研究表明，多種技術(shù)路線研制疫苗的免疫血清及多種突變株康復(fù)者血清，對(duì)Omicron 株新型冠狀病毒的中和作用均明顯下降［8-13］。

由于該突變株免疫逃逸嚴(yán)重，多款疫苗針對(duì)其保護(hù)效力下降［14-18］。因此研發(fā)針對(duì)該毒株的改良型疫苗是遏制其傳播的手段之一。

相比于原型株的刺突蛋白基因序列，Omicron株新型冠狀病毒的刺突蛋白至少存在30 個(gè)氨基酸改變，與以往的新型冠狀病毒變異株相比，該突變株具有更高的突變程度［19-20］。其中在69、70 位缺失6 個(gè)堿基 5′-ACATGT-3′，214 位增加 9 個(gè)堿基 5′-GCCAGAAGA-3′。因此針對(duì)這2 處位點(diǎn)設(shè)計(jì)2 對(duì)引物，可通過(guò)RT-PCR 區(qū)分Omicron 株與其他新型冠狀病毒。

本研究將RT-PCR 法應(yīng)用于Omicron 株新型冠狀病毒滅活疫苗（Vero 細(xì)胞）原液的特異性鑒別試驗(yàn)，并對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 疫苗原液 原型株新型冠狀病毒滅活疫苗（Vero 細(xì)胞）原液（批號(hào)：S202103Y001，簡(jiǎn)稱(chēng)原型株原液）、Omicron 株新型冠狀病毒滅活疫苗（Vero 細(xì)胞）原液（批號(hào)：202201Y001、202201Y002、202201-Y003、202201Y004、202202Y005、202202Y006，簡(jiǎn) 稱(chēng)Omicron 株原液）、Beta 株新型冠狀病毒滅活疫苗（Vero 細(xì)胞）原液（批號(hào)：202112Y001B，簡(jiǎn)稱(chēng) Beta 株原液）、Delta 株新型冠狀病毒滅活疫苗原液（Vero 細(xì)胞）（批號(hào)：202108Y001，簡(jiǎn)稱(chēng) Delta 株原液）均由武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司提供。

1.2 主要試劑及儀器 RNA 抽提試劑盒（QIAamp Viral RNA Mini Kit）購(gòu)自德國(guó) QIAGEN 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptⅣ1st strand cDNA Synthesis Mix）購(gòu)自日本 TaKaRa 公司；Q5 High-Fidelity 2 ×Master Mix 購(gòu)自美國(guó) NEB 公司；DNA marker 購(gòu)自美國(guó) Thermo Fisher Scientific 公司；RNase free dH2O、Agarose G-10 購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PCR 儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosysteme 公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自英國(guó)Syngene 公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GIAIDS 數(shù)據(jù)庫(kù)中新型冠狀病毒Omicron 株基因組序列（EPI_ISL_402124），應(yīng)用 Snapgene 軟件設(shè)計(jì) 6 條引物，OSTF1：5′-CTTGGTTCCATGTTATCTCTGG-3′；OS1R：5′-CCCTGAGGGAGATCTTCTGGC-3′；OSTF3：5′-ATAGTGCGTGAGCCAGAAGA-3′；S2R：5′-CCTGAAGAAGAATCACCAGGAGTC-3′；S1F：5′-CCACGCGAACAAATAGATGGTTATGTCATG-3′；OSTR1：5′-CCATTGGTCCCAGAGATAA-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 樣本RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄 使用QIAamp Viral RNA Mini Kit 試劑盒提取供試品RNA。于1.5 mL離心管中加入 560 μL AVL 溶液，5.6 μL carrier RNA，140 μL 供試品，振蕩 15 s 混勻，室溫靜置 10 min；瞬時(shí)離心，加入 560 μL 無(wú)水乙醇，振蕩 15 s 混勻；瞬時(shí)離心，取上述溶液630 μL 加至吸附柱中（吸附柱放至收集管中），7 227 × g 離心 1 min；將吸附柱放至新的收集管中，吸取剩余溶液，加至試劑盒的吸附柱中（吸附柱放至收集管中），7 227 × g 離心 1 min；將吸附柱放至新的收集管中，加入500 μL AW1 溶液，7 227 × g 離心1 min；將吸附柱放至新的收集管中，加入 500 μL AW2 溶液，16 260 × g 離心 3 min；將吸附柱放至新的收集管中，16 260 × g 離心1 min；將吸附柱放至1.5 mL 離心管中，加入60 μL AVE溶液，室溫靜置 1 min；7 227 × g 離心 1 min；棄吸附柱，管中濾過(guò)液即為供試品RNA。用PrimeScriptⅣ1st strand cDNA Synthesis Mix 試劑盒將供試品RNA逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，冰上配制 20 μL 反應(yīng)體系：4 μL 5 ×PrimeScriptⅣstrand cDNA Synthesis Mix，2 μL Random 6 mers（50 μmol／L），8 μL RNA，6 μL RNase Free dH2O，混勻。PCR 儀按以下條件反應(yīng)：30 ℃ 10 min；42 ℃ 20 min；70 ℃ 15 min 使酶失活后，冰上冷卻，即得cDNA。

1.5 PCR 擴(kuò)增及產(chǎn)物鑒定 以合成的cDNA 為模板，利用正、反向引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。配制50 μL反應(yīng)體系：Q5?High-Fidelity 2 × Master Mix 25 μL，正反向引物各 2 μL，模板 cDNA 1 μL，RNase Free dH2O 20 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 2 min；94 ℃變性 30 s，63 ℃復(fù)性 30 s，72 ℃延伸 30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行條帶分析。

1.6 引物篩選 根據(jù)Omicron 株S 基因序列中相比于其他突變株所特有的插入及缺失基因序列設(shè)計(jì)4對(duì)引物：OSTF1 ／ OS1R、OSTF3 ／ S2R、S1F ／ OSTR1和OSTF1 ／ S2R，分別利用這4 對(duì)引物對(duì)原型株及Omicron 株原液進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)，觀察條帶特異性，篩選合適引物。

1.7 方法驗(yàn)證

1.7.1 專(zhuān)屬性 取202201Y001 批Omicron 株原液、S202103Y001 批原型株原液、202112Y001B 批 Beta株原液、202108Y001 批 Delta 株原液，按照 1.4 項(xiàng)方法進(jìn)行RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄，按照1.5 項(xiàng)方法進(jìn)行PCR 及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.7.2 重復(fù)性 取 202201Y0011 批 Omicron 株原液，按照1.4 項(xiàng)方法重復(fù)進(jìn)行3 次RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄，按照1.5 項(xiàng)方法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.7.3 中間精密度 取202201Y001 批Omicron 株原液，由2 名實(shí)驗(yàn)人員按照1.4 項(xiàng)方法重復(fù)進(jìn)行3 次RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄，按照1.5 項(xiàng)方法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。重復(fù)檢測(cè)3 d。

1.7.4 耐用性 取202201Y001 批Omicron 株原液，按照1.4 項(xiàng)方法重復(fù)進(jìn)行3 次RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄，以 cDNA 為模板，設(shè)置不同（53、55、58 ℃）PCR 反應(yīng)退火溫度，其他條件不變，按照1.5 項(xiàng)方法進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.7.5 靈敏度 用PBS 對(duì)202201Y001 批Omicron株原液進(jìn)行稀釋?zhuān)蛊涞鞍诐舛确謩e為25、5、1、0.2、0.04、0.008 μg ／ mL，按照 1.4 項(xiàng)方法進(jìn)行 RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄，按照1.5 項(xiàng)方法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。用PBS 對(duì)提取的病毒RNA進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)蛊浜怂釢舛确謩e為80、16、3.2、0.64、0.128、0.025 6 ng ／ μL，按照 1.4 項(xiàng)方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，按照1.5 項(xiàng)方法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.8 方法的初步應(yīng)用 取6 批Omicron 株原液，按照1.4 項(xiàng)方法進(jìn)行RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄，按照1.5 項(xiàng)方法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 方法的建立 使用引物 S1F ／ OSTR1、OSTF1 ／S2R 進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)，原型株和Omicron 株均能擴(kuò)增出相同大小的條帶，不具備區(qū)分兩者的能力；使用引物 OSTF1 ／ OS1R、OSTF3 ／ S2R 進(jìn)行 RT-PCR 檢測(cè)，僅Omicron 株擴(kuò)增出條帶，具備區(qū)分原型株與Omicron 株的能力，且引物 OSTF1 ／OS1R 中 2 條引物均包含了Omicron 株的特征突變位點(diǎn)序列：OSTF1包含了 69、70 位缺失的 6 個(gè)堿基 5′-ACATGT-3′，OS1R包含了214 位插入突變的9 個(gè)堿基5′-GCCAGAAGA-3′，特異性更強(qiáng)。因此選擇引物 OSTF1 ／ OS1R作為該方法的引物。見(jiàn)圖1。

圖1 RT-PCR 法引物篩選的凝膠電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile for screening of primers for RT-PCR

2.2 方法的驗(yàn)證

2.2.1 專(zhuān)屬性 Omicron 株原液經(jīng)RT-PCR 檢測(cè)可擴(kuò)增出約 460 bp 的條帶，而原型株、Beta 株、Delta 株原液均無(wú)擴(kuò)增條帶，見(jiàn)圖2。表明該方法專(zhuān)屬性良好，能有效區(qū)分Omicron 株與其他突變株。

圖2 RT-PCR 法專(zhuān)屬性驗(yàn)證凝膠電泳圖Fig.2 Electrophoretic profile for validation of specificity of RT-PCR

2.2.2 重復(fù)性 3 次試驗(yàn)Omicron 株原液經(jīng)RT-PCR檢測(cè)均能擴(kuò)增出約460 bp 的條帶，見(jiàn)圖3。表明該方法重復(fù)性良好。

圖3 RT-PCR 法重復(fù)性驗(yàn)證凝膠電泳圖Fig.3 Electrophoretic profile for validation for reproducibility of RT-PCR

2.2.3 中間精密度 2 名實(shí)驗(yàn)人員重復(fù)3 次對(duì)Omicron 株原液進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)，共檢測(cè)3 d，均能擴(kuò)增出約460 bp 的條帶，見(jiàn)圖4。表明該方法中間精密度良好。

圖4 RT-PCR 法中間精密度驗(yàn)證凝膠電泳圖Fig.4 Electrophoretic profile for validation for intermediate precision of RT-PCR

2.2.4 耐用性 Omicron 株原液在 53、55、58 ℃退火溫度下，經(jīng)RT-PCR 檢測(cè)均能擴(kuò)增出約460 bp 的條帶，見(jiàn)圖5。表明在53 ~ 58 ℃范圍內(nèi)改變退火溫度，該方法均能得到較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖5 RT-PCR 法耐用性驗(yàn)證凝膠電泳圖Fig.5 Electrophoretic profile for validation for durability of RT-PCR

2.2.5 靈敏度 隨著Omicron 株原液蛋白和RNA濃度的降低，電泳條帶亮度逐漸降低，蛋白濃度在0.04 μg ／mL 以上、RNA 濃度在 0.128 ng ／ μL 以上，均能擴(kuò)增出較亮的約460 bp 的條帶，見(jiàn)圖6。表明該方法具有較高的靈敏度。

圖6 RT-PCR 法靈敏度驗(yàn)證凝膠電泳圖Fig.6 Electrophoretic profile for validation for sensitivity（RNA concentration）of RT-PCR

2.3 方法的初步應(yīng)用 6 批Omicron 株原液經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，均可見(jiàn)約460 bp 的條帶，見(jiàn)圖7。

圖7 Omicron 株原液RT-PCR 產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.7 Electrophoretic profile of RT-PCR products of bulk of inactivated vaccine against Omicron strain

3 討 論

滅活疫苗成品多通過(guò)抗體與抗原特異性結(jié)合的反應(yīng)原理建立的方法來(lái)進(jìn)行抗原鑒別試驗(yàn)，如傷寒疫苗通過(guò)與相應(yīng)的血清進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，根據(jù)是否有明顯凝集反應(yīng)進(jìn)行鑒別；A 群C 群腦膜炎球菌多糖疫苗采用免疫雙向擴(kuò)散法，根據(jù)是否能與相應(yīng)抗體形成明顯沉淀線進(jìn)行鑒別；吸附破傷風(fēng)疫苗通過(guò)凝膠免疫沉淀試驗(yàn)，根據(jù)是否出現(xiàn)免疫沉淀反應(yīng)進(jìn)行鑒別試驗(yàn)［21］。目前《中國(guó)藥典》三部（2020 版）已有一些基于核酸序列特征建立的鑒別方法，如皮內(nèi)注射用卡介苗成品鑒別，采用多重PCR 法檢測(cè)卡介菌基因特異性的缺失區(qū)RD1［22］。雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗成品鑒別，采用RT-PCR 法擴(kuò)增Ⅰ型和Ⅱ型出血熱病毒特異性條帶［21-22］。

本研究根據(jù)Omicron 株S 蛋白基因序列特有的插入、缺失序列設(shè)計(jì)了僅針對(duì)該突變株具有擴(kuò)增作用的引物，利用該引物建立了RT-PCR 檢測(cè)方法，該方法可區(qū)分Omicron 株與原型株、Beta 株及Delta株。驗(yàn)證結(jié)果表明，該方法專(zhuān)屬性、重復(fù)性、日間精密度、耐用性和靈敏度良好，可用于Omicron 株新型冠狀病毒滅活疫苗原液鑒別。但由于未篩選到適宜的解吸附劑，因此目前還僅能應(yīng)用于疫苗原液階段的鑒別。后續(xù)會(huì)繼續(xù)篩選合適的解吸附劑，以便將該方法用至成品階段的鑒別試驗(yàn)。