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    全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在臨床醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

    2022-11-16 04:34:45劉卓航綜述董少忠審校
    關(guān)鍵詞:差異基因研究者標(biāo)志物

    劉卓航 綜述,董少忠 審校

    1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650118;2.昆明醫(yī)科大學(xué),云南 昆明 650500

    自1995年科學(xué)家首次在酵母細(xì)胞中獲得第1個(gè)轉(zhuǎn)錄組,并提出轉(zhuǎn)錄組這個(gè)概念[1],到現(xiàn)在的后基因組學(xué)時(shí)代,轉(zhuǎn)錄組作為連接基因組和蛋白質(zhì)組遺傳信息與生物功能的必然紐帶,在生物領(lǐng)域獲得了持續(xù)廣泛的關(guān)注[2]。全轉(zhuǎn)錄組有2 種不同的定義:一種指全部mRNA 的集合,另一種指某個(gè)物種或特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下產(chǎn)生的所有RNA 的總和,包括各類編碼RNA 和各類非編碼RNA(non-coding RNA)[3]。不僅是在生物學(xué)方面,在其他領(lǐng)域尤其是臨床醫(yī)學(xué)方面,全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)也具有重要作用。本文對(duì)全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在探索一些復(fù)雜疾病的發(fā)病機(jī)制和診斷標(biāo)志物方面應(yīng)用的最新進(jìn)展作一綜述。

    1 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序平臺(tái)

    全轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究與測(cè)序平臺(tái)的變革密切相關(guān)。近年來,測(cè)序平臺(tái)的每一次變革均對(duì)全轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究模式產(chǎn)生了深刻的影響,發(fā)揮了巨大的推動(dòng)作用[4]。

    1.1 第一代測(cè)序技術(shù)平臺(tái) 20 世紀(jì)70年代末,SANGER 等[5]發(fā)明了雙脫氧終止法,實(shí)現(xiàn)了對(duì) DNA序列的測(cè)序與分析,以此為標(biāo)志的第一代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn),極大地促進(jìn)了轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。但由于Sanger測(cè)序本身存在的基因定量偏差,通量較低和自動(dòng)化相對(duì)較差等問題,逐漸被淘汰。

    1.2 第二代測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing,NGS)平臺(tái) 隨著研究者對(duì)測(cè)序技術(shù)的不斷改良和革新,NGS 出現(xiàn)。與第一代測(cè)序技術(shù)相比,NGS 具有精確度和靈敏度更高,覆蓋度更均勻,轉(zhuǎn)錄信息更豐富,數(shù)據(jù)質(zhì)量更高,成本更低等優(yōu)勢(shì),成為近年來轉(zhuǎn)錄組方面研究的主要方法。目前,全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的平臺(tái)有很多,其中主要有羅氏公司的454、美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司公司的SOLiD 和米魯納公司的Solexa三大平臺(tái)[6]。在過去10年間,Illumina 公司的Solexa技術(shù),即邊合成邊測(cè)序(seq-uencing by synthesis,SBS)技術(shù)發(fā)展迅速,其中HiSeq 系列的測(cè)序平臺(tái)成為NGS中應(yīng)用最廣泛的平臺(tái)[7]。

    1.3 第三代測(cè)序技術(shù)平臺(tái) 最近幾年逐漸興起的第三代測(cè)序技術(shù)(next-next generation sequencing)又稱為單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù),以Pacific Biosciences(Pac-Bio)公司的單分子實(shí)時(shí)測(cè)序(single molecule real time sequencing,SMRT)[8]和 Oxford Nanopore Technologies 公司的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)為代表[9]。其具有比NGS 更大的通量和更高的效率,且不需經(jīng)過橋式擴(kuò)增。

    2 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的原理和基本步驟

    全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是指運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)將生物體在某一特定狀態(tài)下的編碼和非編碼RNA 的序列測(cè)定出來,以獲得研究樣本幾乎所有的轉(zhuǎn)錄組[3]。

    首先對(duì)目標(biāo)樣品的總RNA 進(jìn)行提取,再根據(jù)需求進(jìn)行樣品處理,根據(jù)所選用的全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序平臺(tái)的要求將所需的RNA 片段化,構(gòu)建測(cè)序文件,進(jìn)行橋式PCR 擴(kuò)增,達(dá)到一定的豐度上機(jī)測(cè)序,以獲得需要的序列,再將所得到的序列與參考基因比對(duì),形成全基因組范圍內(nèi)的轉(zhuǎn)錄譜,進(jìn)行生物信息分析[10]。

    3 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在臨床上的應(yīng)用

    全轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的發(fā)展帶來的變革不僅僅是在生物學(xué)方面,還體現(xiàn)在在臨床醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。

    3.1 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在疾病診斷標(biāo)志物研究中的應(yīng)用 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在針對(duì)一些復(fù)雜疾病的診斷標(biāo)志物的檢測(cè)方面提供了更加豐富可靠的檢測(cè)手段。有研究者運(yùn)用RNA-seq 技術(shù)對(duì)擴(kuò)張型心肌?。╠ilated cardiomyopathy,DCM)和限制性心肌?。╮estrictive cardiomyopathy,RCM)患者進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,揭示了心衰患者蛋白編碼和lncRNA 的一種特殊表達(dá)模式,證實(shí)了患者的左室心肌生物標(biāo)記物可通過基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的方法可靠地識(shí)別,提供了對(duì)心力衰竭患者的心衰標(biāo)志物更可靠的檢出手段[11]。尤其是面對(duì)一些現(xiàn)有醫(yī)學(xué)手段難以解決的疾病,如精神分裂癥(schizophrenia,SCZ)。這類重度精神類疾病缺乏特異的診斷標(biāo)志物,在臨床上一般只能以患者癥狀作為診斷標(biāo)準(zhǔn),常規(guī)檢測(cè)手段的缺陷常導(dǎo)致診斷困難。而全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的運(yùn)用很好地改善了該問題,如有研究者使用全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)SCZ 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的circRNAs表達(dá)譜進(jìn)行測(cè)序,差異表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了新的SCZ 分子診斷標(biāo)志物,為診斷SCZ 提供了更加可靠的臨床依據(jù)[12]。

    全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序同樣也為一些復(fù)雜疾病的診斷提供了新的潛在診斷標(biāo)志物。如庫(kù)欣病,有研究通過全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)垂體ACTH 腺瘤全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,在轉(zhuǎn)錄組水平篩選相關(guān)差異表達(dá)基因和microRNA,并與患者臨床表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,為篩選庫(kù)欣病診斷標(biāo)志物提供了可能的依據(jù)[13]。有研究表明,運(yùn)用RNA-seq 技術(shù)對(duì)3 對(duì)結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)和匹配的正常黏膜(normal mucosa,NM)進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組分析,分析差異基因表達(dá),發(fā)現(xiàn)了可能用于鑒定直腸癌的新的生物標(biāo)志物[14]。

    3.2 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在疾病分子機(jī)制研究中的應(yīng)用 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序同樣為復(fù)雜疾病的分子機(jī)制研究提供了新的技術(shù)和方向,也為臨床上更好地防控和治療這些疾病提供了新的思路和策略。

    有研究顯示,全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序能夠用于分析2 型糖尿病和冠心病患者的心外膜組織脂肪(epicardial adipose tissue,EAT),通過鑒定分析差異表達(dá)基因,發(fā)現(xiàn)高血糖引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)可能與患者EAT變化有關(guān),為糖尿病患者中引起動(dòng)脈粥樣硬化的新途徑提供了依據(jù)[15]。

    全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)同樣也在疾病的臨床治療策略上提供了新的思路。如狂犬病,有研究者提取了狂犬病病毒CVS11 感染小鼠的腦細(xì)胞,并進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組分析,檢測(cè)到大量差異基因表達(dá)和lncRNA變化,為狂犬病病毒感染機(jī)體免疫反應(yīng)和免疫應(yīng)答的探索提供了參考,也為開發(fā)新的狂犬病有效治療藥物或疫苗提供了新的策略與方向[16]。有研究者使用全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)比較了人類CD4+T 細(xì)胞與Nef-deleted(Δ-Nef)NL4-3 病毒,分析差異基因表達(dá),表明在HIV-1 中Nef 蛋白的作用下,干擾素反應(yīng)、IL-15 和JAK / STAT 信號(hào)通路以及參與細(xì)胞代謝、凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控和核糖體生物發(fā)生的基因均發(fā)生改變,這些改變可能在啟動(dòng)宿主細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活化和病毒復(fù)制方面發(fā)揮作用[17]。另外,將全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)運(yùn)用于各類動(dòng)物模型和人類的肌肉組織,發(fā)現(xiàn)了骨組織中新的細(xì)胞類型,以及可能導(dǎo)致骨髓炎和骨質(zhì)疏松等骨骼疾病的新基因和新轉(zhuǎn)錄因子[18]。

    在如何有效防控和治療惡性腫瘤這類問題時(shí),全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序也提供了新的方向和解決策略。運(yùn)用全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可檢測(cè)出一些傳統(tǒng)手段難以檢測(cè)出的腫瘤驅(qū)動(dòng)因素,如拼接變異和基因組變化等。有研究者運(yùn)用全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)檢測(cè)多例多形性腺瘤(pleomorphic adenoma,PA)患者的配對(duì)腫瘤與瘤旁唾液腺腺體,篩選兩組間差異基因,分析預(yù)測(cè)差異基因所編碼蛋白間的相互作用,挖掘這些差異基因在腫瘤形成過程中的作用及通路[19]。還有研究者對(duì)患者的癌組織和正常組織進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)142 個(gè)差異表達(dá)基因,這些差異表達(dá)基因與腫瘤的增殖、遷移、黏附、血管生成及凋亡等生物學(xué)行為密切相關(guān)[20]。另外,還可通過全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)識(shí)別導(dǎo)致腫瘤形成及對(duì)治療產(chǎn)生抵抗的相關(guān)靶基因,對(duì)進(jìn)一步指導(dǎo)其臨床治療和診斷具有重要的理論及實(shí)踐意義[21]。在一些研究中,研究者運(yùn)用全轉(zhuǎn)錄測(cè)序技術(shù)分析與結(jié)腸癌相關(guān)的lncRNA,分析其中差異基因的表達(dá),并闡明這些相關(guān)基因可能與腫瘤生成有關(guān)[22]。另外,全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)還能篩選潛在的抗原表位和治療靶點(diǎn)。有研究者聯(lián)合全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)和質(zhì)譜分析(mass spectrometric,MS)兩種技術(shù)分析基因和蛋白的差異表達(dá)情況,通過HLA I 等位基因檢測(cè)結(jié)合RNA-seq 的基因變異、融合基因結(jié)果預(yù)測(cè),并篩選潛在的腫瘤新抗原或抗原表位,為了解甲狀腺癌的生物學(xué)行為和免疫因素在甲狀腺癌診治中的作用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[23]。

    隨著全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在研究疾病分子機(jī)制領(lǐng)域的逐漸深入,其必然成為防控和治療多種復(fù)雜疾病的新技術(shù)。

    3.3 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在微生物檢測(cè)方面的應(yīng)用 在臨床檢驗(yàn)學(xué)領(lǐng)域,全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展同樣帶來了變革。傳統(tǒng)的病原微生物鑒定技術(shù)主要分為2類:基于細(xì)胞培養(yǎng)的方法(如形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞生理生化特征、細(xì)菌培養(yǎng)分型、基因芯片、自動(dòng)化微生物分析系統(tǒng)等)和基于特異引物 / 探針 / 抗體的方法(如抗原抗體反應(yīng))[24]。但這些傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法均存在不足,尤其是在面對(duì)未知和突變病原體時(shí)。而通過運(yùn)用全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù),構(gòu)建基于高通量測(cè)序技術(shù)的病原體檢測(cè)系統(tǒng),則為病原微生物的檢測(cè)提供了新的更加方便、快速的手段,尤其是對(duì)于常規(guī)手段不易檢出的病原物。如2019年底暴發(fā)的新發(fā)肺炎疫情,經(jīng)鑒定病原體為一種新型冠狀病毒[25]。此次疫情的暴發(fā)給傳統(tǒng)的病原體檢測(cè)帶來巨大挑戰(zhàn),如何快速地從患者體內(nèi)鑒定出冠狀病毒顯得非常重要。有研究者利用全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)快速檢測(cè)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)中的冠狀病毒核酸序列,能夠靈敏、快速地從高通量測(cè)序數(shù)據(jù)中檢測(cè)出冠狀病毒序列,具有很好的泛化能力,可對(duì)新發(fā)和高變異株冠狀病毒序列進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測(cè)[26]。

    4 展 望

    全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)作為后基因組時(shí)代的產(chǎn)物,還可與其他組學(xué)技術(shù)相結(jié)合,形成新的探究復(fù)雜疾病的系統(tǒng)方法。盡管目前全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)尚存在一些問題,但隨著該技術(shù)的不斷發(fā)展成熟,以及應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域,其必將會(huì)成為生物學(xué)研究的有效手段,也會(huì)給臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶來一場(chǎng)技術(shù)革新。

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