小鼠肝炎病毒逆轉(zhuǎn)錄-重組酶聚合酶擴(kuò)增檢測方法的建立、驗證及應(yīng)用

閆雪，李明，張旭，張振，王霄，馬躍宇，馬鳴瀟，費東亮

1.錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121000；2.錦州市疾病預(yù)防控制中心，遼寧 錦州 121000

小鼠肝炎病毒（mouse hepatitis virus，MHV）屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，單股正鏈RNA 病毒，具有極強(qiáng)的傳染性，不僅造成乳鼠死亡，還可引起成年小鼠免疫應(yīng)答參數(shù)的改變，嚴(yán)重干擾實驗結(jié)果［1］。根據(jù)實驗動物微生物等級及監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)（GB14922-2011），MHV 為 SPF 級小鼠必檢清除項之一［2-3］。

目前，MHV 檢測方法主要有病毒分離與電子顯微鏡觀察、血清學(xué)和分子生物學(xué)方法，其中以ELISA和RT-qPCR 法最為常用。ELISA 法雖準(zhǔn)確度高，但操作復(fù)雜，敏感性低，對實驗人員技術(shù)要求較高［4-5］；RT-qPCR 法具有良好的特異性、靈敏性和可靠性，也是各實驗室對該病毒檢測的常用參考方法，但該方法對溫度控制和操作流程要求嚴(yán)格，需昂貴實驗設(shè)備，使其應(yīng)用受限［6-8］。作為PCR 的替代技術(shù)，重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase ploymerase amplification，RPA）技術(shù)是以T4 噬菌體核酸復(fù)制機(jī)制為主要反應(yīng)原理，利用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA 聚合酶的催化作用，實現(xiàn)目的基因在恒溫條件（25 ～42 ℃）下的快速擴(kuò)增，20 min 即可獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，且無需其他儀器設(shè)備［9-10］。該技術(shù)已在病毒的快速檢測中得到了廣泛應(yīng)用，如中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS）、埃博拉病毒（Ebola virus，EV）、犬瘟病毒（canine distemper virus，CDV）、口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDS）、禽流感病毒（bird flu virus，BFV）、布魯菌（Brucella）、戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）、豬偽狂犬病毒（pigpseudorabiesvirus，PPRV）及仙臺病毒（Sendaivirus，SV）等［11-17］，但將 RPA 技術(shù)應(yīng)用于 MHV 快速檢測鮮見報道。因此，本研究基于RPA 技術(shù)建立一種用于檢測 MHV 的逆轉(zhuǎn)錄-RPA（RT-RAP）法，為 MHV 的現(xiàn)場檢測及風(fēng)險監(jiān)測提供快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 樣本 32 份野外田鼠肝臟組織樣本由錦州疾病預(yù)防控制中心提供。

1.2 毒株、菌株及質(zhì)粒 MHV、鼠肺炎病毒（pneumonia virus of mice，PVM）、SV、鼠漢坦病毒（Hantaan virus，HV）、鼠細(xì)小病毒（minute virus of mice，MVM）、呼腸弧病毒Ⅲ型（reovirus typeⅢ，ReoⅢ）cDNA 由北京大學(xué)實驗動物部白英杰教授惠贈；E.coli BL21（DE3）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pET-MS2-M（MHV）由江蘇金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 主要試劑 病毒DNA／RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及DL2000 DNA marker 均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Twist AmpTMBasic ki（tTABAS03KIT）購自英國TwistDX 公司。

1.4 方法的建立 以GenBank 中登錄的MHV-FJ 株（FJ6647223）M 基因中保守區(qū)段（82 ～ 317 bp）為靶基因，設(shè)計RPA 特異性引物，以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pET-MS2-M（MHV）為模板進(jìn)行RPA 擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：Rehydra-tion Buffer 29.5 μL，上下游引物（終濃度為10 μmol ／ L）各 2.4 μL，模板 2 μL，去離子水補(bǔ)齊至47.5 μL，再加入醋酸鎂（終濃度為 280 mmol ／ L）2.5 μL，共50 μL。等溫擴(kuò)增。反應(yīng)產(chǎn)物中加入100 μL苯酚 ／ 氯仿提取劑，1 204 × g 離心 10 min；取上清10 μL，與 2 μL DNA Loading Buffer 混合，經(jīng) 1.4%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5 方法的優(yōu)化

1.5.1 引物的確定 設(shè)計6 對RPA 特異性引物，引物序列見表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。分別使用6 對引物按1.4 項方法進(jìn)行檢測，反應(yīng)溫度為39 ℃，反應(yīng)時間為30 min。

表1 用于RPA 檢測的引物序列Tab.1 Primer sequences for RPA

1.5.2 反應(yīng)溫度的確定 分別于 31、33、35、37、39、41 ℃條件下，采用最適引物，按1.4 項方法進(jìn)行檢測，反應(yīng)時間為30 min。

1.5.3 反應(yīng)時間的確定 將反應(yīng)時間分別設(shè)定為20、25、30、35 min，采用最適引物，按 1.4 項方法進(jìn)行檢測，反應(yīng)溫度為37 ℃。

1.6 方法的驗證

1.6.1 敏感性 將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pET-MS2-M（MHV）進(jìn)行10 倍系列稀釋，4.75 × 101～ 4.75× 106copies／μL共6 個梯度，采用優(yōu)化方法進(jìn)行檢測，驗證該方法的敏感性。

1.6.2 特異性 分別以 MHV、PVM、SV、HV、MVM、ReoⅢ cDNA 為模板，采用優(yōu)化方法進(jìn)行檢測，驗證該方法的特異性。

1.7 方法的應(yīng)用 取32 份野外田鼠肝臟組織樣本，采用病毒DNA／RNA 提取試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板，采用優(yōu)化方法進(jìn)行檢測。同時采用RT-qPCR 法進(jìn)行檢測，PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s；共30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃ 2 min。對兩種方法進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2.1 方法的優(yōu)化

2.1.1 最適引物 設(shè)計的6 對RPA 引物均可擴(kuò)增出約200 bp 的目的條帶，以M-MHV-2 的擴(kuò)增條帶亮度最強(qiáng)，且無非特異性條帶，見圖1。因此，確定最適引物為引物2。

圖1 RPA 擴(kuò)增引物的優(yōu)化Fig.1 Optimization of primers for RPA

2.1.2 最適反應(yīng)溫度 反應(yīng)溫度為 31、33、35、37、39、41 ℃時均可擴(kuò)增出約200 bp 的目的條帶，反應(yīng)溫度為37 ℃時，擴(kuò)增條帶最清晰，見圖2。因此，確定最適反應(yīng)溫度為37 ℃。

圖2 RPA 擴(kuò)增反應(yīng)溫度的優(yōu)化Fig.2 Optimization of temperature for RPA

2.1.3 最適反應(yīng)時間 反應(yīng)時間為 20、25、30、35 min時均可擴(kuò)增出約200 bp 的目的條帶，反應(yīng)時間為30和35 min 時，目的條帶亮度最強(qiáng)，差異較小，見圖3。為節(jié)約時間，確定最適反應(yīng)時間為30 min。

圖3 RPA 擴(kuò)增反應(yīng)時間的優(yōu)化Fig.3 Optimization of time for RPA

2.2 方法的驗證

2.2.1 敏感性 4.75 × 101～ 4.75 × 106copies ／ μL標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒 pET-MS2-M（MHV）中，4.75 × 102～ 4.75 ×106copies／μL 可擴(kuò)增出約 200 bp 的目的條帶，4.75 ×101copies ／ μL 未見該目的條帶，見圖 4。因此，確定該方法的檢測下限為4.75×102copies／μL。

圖4 RT-RPA 法敏感性的驗證結(jié)果Fig.4 Verification for sensitivity of RT-RPA

2.2.2 特異性 MHV、PVM、SV、HV、MVM、ReoⅢ中，僅有MHV cDNA 可擴(kuò)增出約200 bp 的目的條帶，其他病毒均未擴(kuò)增出該條帶，見圖5。表明該方法具有良好的特異性。

圖5 RT-RPA 法特異性的驗證結(jié)果Fig.5 Verification for specificity of RT-RPA

2.3 方法的應(yīng)用 32 份野外田鼠肝臟組織樣本中，RT-RPA 法檢出1 份陽性樣本，陽性率為3.13%（1 ／32），與RT-PCR 法結(jié)果一致，表明兩種方法具有較好的一致性。

3 討 論

MHV 主要通過空氣和接觸進(jìn)行傳播，無明顯季節(jié)性，通常表現(xiàn)為隱形感染，在應(yīng)激情況下表現(xiàn)為致死性肝炎、腸炎等，主要傳播途徑包括感染小鼠分泌物、糞便、尿液和污染的器具。MHV 是我國SPF 級別或該級別以上實驗小鼠必須排除的病原之一，在國家標(biāo)準(zhǔn)《實驗動物微生物學(xué)等級及監(jiān)測》（GB 14922.2-2011）規(guī)定中作為必檢項目，2013年首次被納入新版《中華人民共和國進(jìn)境動物檢疫疫病名錄》［1-2］。

實驗小鼠感染MHV 非常普遍，根據(jù)組織嗜性不同，可分為呼吸毒株和腸毒株。目前，針對MHV分子診斷方法主要基于PCR 技術(shù)建立起來的各種RT-PCR 檢測方法，該類方法具有快速、特異性高等優(yōu)點，但需要復(fù)雜的熱循環(huán)系統(tǒng)，因此該方法雖在實驗室檢測中廣泛應(yīng)用，但在現(xiàn)場檢測中無法推廣應(yīng)用。等溫擴(kuò)增技術(shù)可在恒溫或室溫下進(jìn)行核酸復(fù)制，大幅縮短了時間成本，具備高效便捷的優(yōu)點，其中又以RPA 技術(shù)應(yīng)用最廣泛［18-22］。本實驗建立的MHV RT-RPA 檢測方法在37 ℃條件下30 min 即可完成檢測，最低檢測下限為 4.75 × 102copies ／ μL。特異性驗證結(jié)果顯示，僅有MHV cDNA 作為模板出現(xiàn)目的條帶，而其他病毒cDNA 模板均為陰性，無非特異條帶出現(xiàn)，表明該方法具有良好的特異性。另外，該檢測方法也降低了對溫控設(shè)備的依賴，大幅縮短了反應(yīng)時間，表明該方法有望應(yīng)用于基層的MHV檢測。對臨床樣本檢測結(jié)果與RT-PCR 方法具有良好的一致，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確性。

綜上所述，本研究建立了能夠快速、高效檢測MHV 的RT-RPA 方法，該方法具有良好的特異性及敏感性，反應(yīng)快速、節(jié)省時間，在實驗動物質(zhì)量檢測方面具有良好的應(yīng)用前景，也為進(jìn)一步研發(fā)側(cè)流層析試紙條等MHV 相關(guān)快速檢測方法奠定了基礎(chǔ)。