• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    鋁佐劑含量檢測(cè)方法的探討

    2022-11-16 04:34:45王平綜述劉梅影審校
    中國生物制品學(xué)雜志 2022年6期
    關(guān)鍵詞:佐劑靈敏度疫苗

    王平 綜述,劉梅影 審校

    國藥中生生物技術(shù)研究院有限公司,北京 101111

    從1926年Glenny 發(fā)現(xiàn)鋁佐劑至今,鋁佐劑的使用已有近百年的歷史。至目前為止,鋁佐劑是被批準(zhǔn)應(yīng)用于人類疫苗最廣泛的佐劑,也是我國唯一獲得臨床批準(zhǔn)使用的疫苗佐劑[1-4]。中國已上市含鋁佐劑疫苗共17 種,涉及滅活疫苗、重組基因工程疫苗、亞單位疫苗和聯(lián)合疫苗等多個(gè)疫苗類型,包括吸附百白破系列疫苗、甲 / 乙 / 戊肝系列疫苗、流感病毒系列疫苗以及森林腦炎滅活疫苗、雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗等[5-6]。

    鋁佐劑種類主要包括氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁鉀、氫氧化鋁和磷酸鋁的混合系統(tǒng)以及與其他佐劑成分組成的佐劑系統(tǒng),其中應(yīng)用最廣泛的為氫氧化鋁佐劑和磷酸鋁佐劑[2]。鋁佐劑的安全性和有效性均得到了充分驗(yàn)證[7-9],其含量對(duì)疫苗的免疫原性和安全性均具有重要影響。一方面通過增強(qiáng)抗原遞呈、增強(qiáng)Th2 細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答、激活B細(xì)胞誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生以及激活補(bǔ)體等作用增強(qiáng)疫苗的免疫原性;另一方面也存在安全隱患,可誘導(dǎo)過敏反應(yīng)和產(chǎn)生神經(jīng)毒性[10]。因此,國際上通過法規(guī)或通則的形式對(duì)鋁佐劑的安全性限度標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了嚴(yán)格規(guī)定[2,11-15]:均以鋁離子含量為單位計(jì),世界衛(wèi)生組織及歐盟為不高于1.25 mg / 劑,美國要求不高于0.85 mg / 劑;而目前上市疫苗鋁佐劑多為 0.3 ~0.5 mg / 劑。因此在不影響抗體產(chǎn)生量的前提下,應(yīng)盡可能降低疫苗中鋁佐劑含量,采用能夠達(dá)到預(yù)期人體有效性最小劑量的使用原則,盡可能降低臨床不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生[16-18]。

    鋁佐劑粒徑的不均一性容易引起分裝后每劑疫苗中鋁佐劑含量不一致,從而使接種個(gè)體產(chǎn)生免疫效果差異。隨著多肽疫苗、亞單位疫苗不斷涌現(xiàn),對(duì)疫苗佐劑的要求愈來愈高,對(duì)常規(guī)佐劑的改良研究也更加被重視起來,人們把目光從粒徑不均一、顆粒大的常規(guī)鋁佐劑投向納米鋁佐劑。納米鋁佐劑較常規(guī)鋁佐劑具有更多的優(yōu)點(diǎn):①顆粒更小。常規(guī)鋁佐劑在水溶液中形成1 ~20 μm 的顆粒,而納米鋁顆粒的直徑小于200 nm。因此相同含量的納米鋁佐劑會(huì)具有更大的表面積和更強(qiáng)的吸附能力;②納米鋁佐劑增加了抗原結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,較常規(guī)鋁佐劑不易脫出,且吸收更快、產(chǎn)生抗體時(shí)間更短;③納米鋁佐劑活性更強(qiáng)。微量納米鋁佐劑可使疫苗誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答[19-21]。納米鋁的應(yīng)用會(huì)在很多程度上降低鋁佐劑使用量,相應(yīng)降低鋁佐劑副反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn),但會(huì)對(duì)鋁佐劑檢測(cè)方法的靈敏度提出更高的要求。National Medical Products Administration 在 2019年12月發(fā)布的《預(yù)防用含鋁佐劑疫苗技術(shù)指導(dǎo)原則》中建議:將鋁佐劑和含鋁疫苗粒徑大小和分布納入質(zhì)量特性研究和日??刂频囊?,這就使得單支疫苗的鋁含量檢測(cè)成為質(zhì)量精準(zhǔn)控制的發(fā)展方向。

    目前含鋁佐劑疫苗常用的鋁含量檢測(cè)方法為乙二胺四乙酸二鈉(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt,EDTA-2Na)滴定法,該檢測(cè)方法是《中國藥典》三部(2020 版)[5]推薦方法,其原理是用過量EDTA-2Na 與Al3+發(fā)生反應(yīng),再用鋅滴定液滴定剩余EDTA-2Na,根據(jù)鋅滴定液的消耗量計(jì)算供試品中鋁佐劑含量。這種絡(luò)合滴定法簡單易行,是生物制品領(lǐng)域檢測(cè)鋁含量的經(jīng)典方法,也是《歐洲藥典》(第八版)[22]和WHO 推薦方法。但該方法存在不足之處:①根據(jù)指示劑顏色變化經(jīng)目測(cè)確定滴定終點(diǎn),易受人為因素影響;②靈敏度相對(duì)較低,為ppm 級(jí)別,檢測(cè)樣品一般需合并5 ~ 10 劑疫苗,不能檢測(cè)出單劑疫苗的鋁佐劑含量,不利于對(duì)疫苗的精準(zhǔn)質(zhì)量控制,這就需要靈敏度更高的檢測(cè)方法才能適應(yīng)檢測(cè)需求。

    目前國內(nèi)外各行業(yè)鋁含量檢測(cè)方法主要有分光光度法、色譜法、原子吸收光譜法(atomic absorption spectrophotometry,AAS)及電感耦合等離子體法(inductive coupled plasma emission spectrometry,ICP)等。根據(jù)檢測(cè)原理及靈敏度不同,檢測(cè)方法應(yīng)用領(lǐng)域也有所不同。分光光度法多應(yīng)用于食品領(lǐng)域,原子吸收光譜法多應(yīng)用于環(huán)境和化藥領(lǐng)域。這些方法對(duì)于疫苗中鋁佐劑含量檢測(cè)大多具有局限性,尤其是光譜方法,需要樣品預(yù)處理,即將疫苗樣品用濕式消解法(如硝酸消解法、硝酸-高氯酸消解法等)或微波消解,將其轉(zhuǎn)化為可溶的試樣。對(duì)于離子色譜法,為了測(cè)定復(fù)雜樣品中的鋁含量,經(jīng)常需對(duì)基質(zhì)進(jìn)行預(yù)濃縮和 / 或凈化,將不溶性的鋁轉(zhuǎn)化為可溶性的Al3+,同時(shí)又能排除疫苗中其他成分對(duì)檢測(cè)的干擾。以下我們對(duì)這些方法的原理、應(yīng)用及優(yōu)缺點(diǎn)作一介紹。

    1 鉻天青分光光度法

    光度法測(cè)定鋁的顯色劑較多,其中以鉻天青S為最佳。鉻天青簡稱CAS,是一種酸性染料。Al3+和鉻天青S 在弱酸性溶液中生成紅色的二元配合物,最大吸收波長為545 nm,如果加入含長碳鏈的有機(jī)表面活性劑,如溴化十六烷基三甲基銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB),則可形成三元配合物;其最大吸收波長向長波方向移動(dòng)(紅移),測(cè)定靈敏度顯著提高。目前食品中鋁含量測(cè)定采用食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.182—2017 規(guī)定的鉻天青分光光度法[23]。本方法原理為:在乙二胺-鹽酸緩沖液中,聚乙二醇辛基苯醚(TritonX-100)和溴代十六烷基吡啶(bromohexadecyl pyridine,CPB)的存在下,Al3+和鉻天青S 反應(yīng)生成藍(lán)綠色的四元膠束,于620 nm 波長處有特異吸收。分光光度法結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡單、成本較低,但也存在許多不足:①檢測(cè)過程步驟繁瑣,所用試劑較多;②形成的絡(luò)合物不穩(wěn)定[24];③靈敏度是 ppm 級(jí),適用于鋁含量較高(10 ~1 000 mg / kg)的情況[25];④易受多種因素影響[26];⑤使用大量有毒有害試劑,易造成環(huán)境的污染。

    2 色譜法

    目前國際上多采用色譜技術(shù)監(jiān)測(cè)環(huán)境中微量鋁含量,如反相高效液相色譜(reverse phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)-紫 外 檢測(cè)法[27-28]、液質(zhì)聯(lián)用(liquid chromatography mass spectrometry,LC-MS)[29]、離子色譜-柱后衍生法[30-31]等。USP37 在非處方藥鋁含量檢測(cè)中,除了滴定法還介紹了液相色譜法和離子色譜法,但在生物制品領(lǐng)域尚未見應(yīng)用色譜技術(shù)研究微量鋁含量的報(bào)道。可能是疫苗類樣品成分復(fù)雜,通過前處理對(duì)樣品進(jìn)行凈化排除蛋白、多糖類抗原物質(zhì)以及輔料成分對(duì)檢測(cè)的干擾是該方法能否成功的關(guān)鍵。

    2.1 RP-HPLC-紫外檢測(cè)法 RP-HPLC 分離技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于鋁與8-羥基喹啉(8-hydroxyquinoline,8-HQ)、8-羥基喹諾酮磺酸(8-hydroxyquinoline sulfonate,8-HQS)等螯合劑形成的絡(luò)合物分離。其中槲皮素(3,3′,4′,5′,7-五羥基黃酮)普遍存在于植物光合作用中,可與鋁選擇性地形成槲皮素-Al3+的絡(luò)合物。REKHI 等[32]使用槲皮素作為金屬絡(luò)合劑通過RP-HPLC 和紫外檢測(cè)器測(cè)定水樣中痕量鋁。首先采用織物相吸附萃?。╢abric phase sorptive extraction,F(xiàn)PSE)技術(shù)從水樣中預(yù)濃縮槲皮素-Al3+絡(luò)合物,然后通過反相C18 色譜柱實(shí)現(xiàn)槲皮素-Al3+絡(luò)合物的基線分離。新型FPSE-HPLC-紫外檢測(cè)法可靈敏、準(zhǔn)確、可靠地篩查各種水樣中鋁離子含量。

    2.2 LC-MS 乙磷鋁是一種植物殺蟲劑,在空氣中噴灑后對(duì)身體有害,BUIARELLI 等[33]采用選擇性液相層析串聯(lián)質(zhì)譜分析(liquid chromatography tandem-mass spectrometry,LC-MS / MS)方法來分析空氣顆粒物質(zhì)中的乙磷鋁殘留量。用Strata X 固相萃取技術(shù)從9 L 大氣顆粒物中采樣分析,用親水聚合物填料色譜柱和水 / 乙腈分步洗脫實(shí)現(xiàn)色譜分離,再用質(zhì)譜檢測(cè)以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring,MRM)模式在負(fù)電噴霧電離(electron spray ionization,ESI)中運(yùn)行。結(jié)果表明,該方法簡便、快速、適用于固體性質(zhì)樣品檢測(cè),可考慮應(yīng)用于其他種類樣品,如食物或土壤。

    2.3 離子色譜-柱后衍生 該方法檢測(cè)原理是利用Al3+與Tiron 衍生試劑在酸性條件下生成衍生物,在310 nm 波長處有特異吸收峰。通過陽離子螯合樹脂CS5 層析柱完成鋁的選擇性預(yù)濃縮以及鋁與其他過渡金屬及堿性金屬分離,再通過柱后衍生生成有紫外發(fā)色團(tuán)的衍生物。國藥中生生物技術(shù)研究院有限公司中心實(shí)驗(yàn)室建立了高溫干烤后加酸溶解的樣品前處理方法,解決了色譜技術(shù)檢測(cè)疫苗類產(chǎn)品的關(guān)鍵步驟。該方法可明顯提高鋁檢測(cè)的靈敏度和精確度,相較于滴定法減少了人為操作誤差,具有設(shè)置簡單、運(yùn)行速度快等優(yōu)點(diǎn),有利于對(duì)樣品進(jìn)行精準(zhǔn)質(zhì)量控制。

    2.4 AAS

    該方法為目前微量元素檢測(cè)的經(jīng)典方法[34-38],也是實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用最廣泛的方法,是基于被測(cè)元素基態(tài)原子在蒸氣狀態(tài)對(duì)其原子共振輻射的吸收進(jìn)行元素定量分析的方法。該方法選擇性強(qiáng),靈敏度高,分析范圍廣,目前可測(cè)定的元素種類已達(dá)70 多種。美國環(huán)境保護(hù)局出版的《水和廢水化學(xué)分析方法》明確指出水中34 個(gè)金屬用AAS 進(jìn)行測(cè)定;日本的工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(Japanese Industrial Standard,JIS)和我國水質(zhì)監(jiān)測(cè)也明確使用ASS 檢測(cè)的項(xiàng)目達(dá)15 項(xiàng)以上。國際標(biāo)準(zhǔn)組織(International Organization for Standardization,ISO)近幾年也在為把ASS 列為標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行積極工作。原子吸收光譜儀的關(guān)鍵部件是原子化系統(tǒng),按照原子化裝置的不同可分為火焰原子吸收光譜法(flame atomic absorption spectrometry,F(xiàn)-AAS)、石墨爐原子吸收法(graphite furnace atomic absorption spectrometry,GF-AAS)和氫化物發(fā)生原子吸收光譜法(hydride generation atomic absorption spectrometry,HG-AAS),適合檢測(cè)鋁元素的為前2 種方法。

    2.4.1 F-AAS 該方法具有準(zhǔn)確性好、操作簡單、成本較低、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于環(huán)境分析、農(nóng)業(yè)、冶金、石油工業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域[39-43]。武慧欣等[44]采用傳統(tǒng)濕法消解處理蔬菜樣品,用F-AAS 測(cè)定蔬菜中銅、鋅、鉛、鎘含量。結(jié)果顯示,4 種重金屬元素濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.03,回收率為在95% ~106%,檢測(cè)限均小于 0.31 mg / L。

    2.4.2 GF-AAS 與 F-AAS 相比,GF-AAS 具有靈敏度高、原子化效率高、測(cè)定元素范圍廣、進(jìn)樣量少以及利用率高等優(yōu)點(diǎn)[45-49]。焦二虎[50]采用 GF-AAS測(cè)定土壤樣品中鉛、鎘、鈷、銻、鈹含量,結(jié)果顯示,各元素檢出限為 0.008 ~ 0.06 μg / g,該方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。李墨等[51]用GF-AAS 測(cè)定生活水中的鋁含量,結(jié)果顯示,該方法操作簡便、快速、準(zhǔn)確、干擾小,方法檢測(cè)限為3.315 μg / L,最低檢出質(zhì)量濃度為13.26 μg / L,適合生活用水中鋁含量測(cè)定。雖然GF-AAS 檢測(cè)精度高于F-AAS,但重復(fù)性不如F-AAS 好,干擾性也大,這是由于石墨管內(nèi)部空間小,同時(shí)共存的基體物質(zhì)在空間的密度明顯增加,增加了其與被測(cè)元素間的相互作用機(jī)會(huì),產(chǎn)生的氣相干擾較F-AAS 嚴(yán)重,基體干擾也較嚴(yán)重,使得GF-AAS的準(zhǔn)確度要低于F-AAS。在檢測(cè)鋁含量時(shí),特制石墨管內(nèi)有鋯鹽涂層,且鋁元素較為活潑,不易保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性,尚需繼續(xù)改進(jìn)。

    2.4.3 HG-AAS HG-AAS 的顯著優(yōu)點(diǎn)是干擾小、重復(fù)性好。不足之處為:①原子化效率不足30%,因此相應(yīng)樣品進(jìn)樣量大,為10 ~ 20 mL,浪費(fèi)樣品;②靈敏度不高,為ppm 級(jí),痕量分析需對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)分離富集;③關(guān)鍵部件損耗大;④火焰由乙炔氣體產(chǎn)生,乙炔有難聞臭味且易燃,存在安全隱患。在檢測(cè)鋁元素時(shí),由于鋁元素電離能較高,空氣-乙炔火焰無法滿足要求,需使用一氧化二氮-乙炔火焰,因此危險(xiǎn)性較高。

    2.5 ICP

    ICP 屬于微量元素檢測(cè)的新方法,也是目前備受關(guān)注的推薦方法[52-56]。其原理為:待測(cè)物質(zhì)含元素發(fā)射的特征譜線,根據(jù)譜線存在與否和強(qiáng)度進(jìn)行樣品中相應(yīng)元素的定性和定量分析。將樣品經(jīng)蠕動(dòng)泵由氬氣帶入霧化系統(tǒng)進(jìn)行霧化形成氣溶膠,顆粒大且不均勻的氣溶膠由廢液口排出,顆粒小且均勻的氣溶膠進(jìn)入等離子體的軸向通道,在高溫和惰性氣氛中被充分蒸發(fā)、原子化、發(fā)生電離和激發(fā),發(fā)出所含元素的特征譜線。根據(jù)檢測(cè)器的不同可分為2 種類型,電感耦合等離子體光譜法(inductively coupled plasma-optical emission spectrometer,ICP-OES)和電感耦合等離子體質(zhì)譜法(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)。這兩種檢測(cè)方法的激發(fā)源均為電感耦合,ICP 通過全譜直讀/ 單道掃描的方式進(jìn)行光學(xué)測(cè)定,線性范圍寬、可同時(shí)對(duì)多種元素進(jìn)行檢測(cè)分析[57-60],從而實(shí)現(xiàn)樣本的高通量檢測(cè)。ICP 廣泛應(yīng)用于環(huán)境、食品、生物醫(yī)藥等多種領(lǐng)域。

    2.5.1 ICP-OES 光譜儀所用檢測(cè)器為CCD 檢測(cè)器,需要通過分析外標(biāo)物得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后對(duì)待測(cè)物開展定量分析。用該方法檢測(cè)13 價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗中鋁含量,檢出限為 0.015 μg / mL,方法準(zhǔn)確度和精密度均良好[61]。缺點(diǎn)是儀器價(jià)格昂貴,氬氣消耗量較大,全程需氬氣吹掃及電離,在基層單位推廣應(yīng)用具有一定困難。

    2.5.2 ICP-MS 原理同ICP-OES,不同之處在于檢測(cè)器為質(zhì)譜檢測(cè)器,以質(zhì)譜測(cè)量峰型,靈敏度可達(dá)ppb ~ ppt 級(jí),可實(shí)現(xiàn)樣本中痕量元素檢測(cè),檢測(cè)范圍較光譜法更廣泛,常用在包材相容性檢測(cè)中[62-64]。但質(zhì)譜檢測(cè)更易受到干擾,且該方法不可使用干法消解法處理樣品,因?yàn)檑釄鍟?huì)吸附一定量的鋁元素而影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。不足之處為:①設(shè)備昂貴,維護(hù)費(fèi)用高;②對(duì)操作人員要求較高,且需要自建方法,根據(jù)待測(cè)元素及其樣品中的干擾雜質(zhì),選擇合適的檢測(cè)波長,既要保證待測(cè)元素有最大吸收又要排除雜質(zhì)的干擾;③質(zhì)譜檢測(cè)器比較精細(xì),受外界干擾較大。因此,ICP-MS 的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性也備受大家關(guān)注。

    3 結(jié) 語

    以上幾種鋁含量檢測(cè)方法,就靈敏度而言,EDTA-2Na 滴定法和鉻天青分光光度法靈敏度較低。EDTA-2Na 滴定法不能檢測(cè)單劑疫苗中鋁佐劑含量,需合并5 ~ 10 支疫苗進(jìn)行檢測(cè),不能對(duì)疫苗進(jìn)行精準(zhǔn)質(zhì)量控制;目測(cè)滴定終點(diǎn),易產(chǎn)生人為誤差。而分光光度法操作步驟繁瑣,檢測(cè)過程中會(huì)用到有毒有害試劑,易造成環(huán)境污染。

    色譜法、AAS 和ICP 靈敏度顯著提高,能夠?qū)崿F(xiàn)單劑疫苗的檢測(cè),實(shí)現(xiàn)了對(duì)疫苗質(zhì)量的精準(zhǔn)質(zhì)量控制,為研發(fā)過程中鋁佐劑制備工藝、抗原吸附工藝和分裝工藝優(yōu)化提供了有效的判斷手段。但這3 種方法均需對(duì)樣品進(jìn)行前處理來滿足檢測(cè)需要。其中FAAS 原子化效率較低,比較浪費(fèi)樣品,但干擾小,重復(fù)性好;相反,GF-AAS 原子化效率較高,進(jìn)樣量小,但由于內(nèi)部空間狹小導(dǎo)致干擾大,重復(fù)性差。尤其F-AAS 使用易燃的乙炔氣體,存在安全隱患。

    ICP-OES / ICP-MS 法是近幾年微量元素檢測(cè)的新興方法,顯著優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)檢測(cè)多種元素,滿足了各國藥典對(duì)鋁佐劑不斷提高的質(zhì)控要求,可在檢測(cè)鋁含量的同時(shí)檢測(cè)砷、鐵等重金屬元素,大大減少了工作量,符合未來發(fā)展的需求,但缺點(diǎn)是儀器價(jià)格昂貴,維護(hù)成本高。

    綜上所述,實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)要求和條件選擇合適的檢測(cè)方法。

    猜你喜歡
    佐劑靈敏度疫苗
    DC-Chol陽離子脂質(zhì)體佐劑對(duì)流感疫苗免疫效果的影響
    HPV疫苗,打不打,怎么打
    我是疫苗,認(rèn)識(shí)一下唄!
    我是疫苗,認(rèn)識(shí)一下唄!
    家教世界(2020年10期)2020-06-01 11:49:26
    我是疫苗,認(rèn)識(shí)一下唄!
    家教世界(2020年7期)2020-04-24 10:57:58
    導(dǎo)磁環(huán)對(duì)LVDT線性度和靈敏度的影響
    克痹寧凝膠對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的緩解作用
    中成藥(2018年10期)2018-10-26 03:40:48
    地下水非穩(wěn)定流的靈敏度分析
    SD大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型的建立與評(píng)估
    鋁佐劑的作用機(jī)制研究進(jìn)展
    男女午夜视频在线观看| 一级爰片在线观看| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 中文字幕制服av| 涩涩av久久男人的天堂| 午夜福利乱码中文字幕| 99re6热这里在线精品视频| 久久国产精品大桥未久av| 成人毛片60女人毛片免费| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产成人精品久久久久久| 亚洲av国产av综合av卡| 成人手机av| 99精品久久久久人妻精品| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 免费日韩欧美在线观看| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产成人欧美| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 另类亚洲欧美激情| 国产在线免费精品| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 99国产综合亚洲精品| 一级片免费观看大全| 看非洲黑人一级黄片| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 久久热在线av| 国产免费一区二区三区四区乱码| 下体分泌物呈黄色| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 少妇精品久久久久久久| 亚洲在久久综合| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲av日韩在线播放| 成人手机av| 中文字幕色久视频| 丰满乱子伦码专区| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产乱来视频区| 伊人久久国产一区二区| 精品亚洲成a人片在线观看| 成年动漫av网址| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产极品粉嫩免费观看在线| xxx大片免费视频| 国产视频首页在线观看| 国产成人a∨麻豆精品| 午夜福利影视在线免费观看| 国产精品一二三区在线看| 亚洲少妇的诱惑av| 美女中出高潮动态图| 欧美日本中文国产一区发布| 国产av码专区亚洲av| 久久免费观看电影| 极品人妻少妇av视频| 午夜久久久在线观看| 亚洲精品久久午夜乱码| av电影中文网址| 亚洲三区欧美一区| 极品少妇高潮喷水抽搐| 1024香蕉在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲人成电影观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲国产中文字幕在线视频| 久久久久久久精品精品| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 韩国av在线不卡| 伊人久久国产一区二区| 亚洲人成网站在线观看播放| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲七黄色美女视频| 国产 一区精品| 国产精品人妻久久久影院| 观看美女的网站| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲国产精品国产精品| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产欧美亚洲国产| 大话2 男鬼变身卡| 中文欧美无线码| 桃花免费在线播放| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 毛片一级片免费看久久久久| 最近2019中文字幕mv第一页| 免费黄网站久久成人精品| 另类亚洲欧美激情| 免费观看人在逋| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 视频区图区小说| √禁漫天堂资源中文www| 看免费av毛片| 日本欧美国产在线视频| 99久国产av精品国产电影| 国产99久久九九免费精品| 亚洲国产欧美在线一区| 日韩伦理黄色片| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 精品亚洲成国产av| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 两个人看的免费小视频| 两性夫妻黄色片| 天堂中文最新版在线下载| 高清视频免费观看一区二区| h视频一区二区三区| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲精品国产区一区二| 久热爱精品视频在线9| av电影中文网址| 久久 成人 亚洲| 久久综合国产亚洲精品| 少妇的丰满在线观看| 日本午夜av视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 我的亚洲天堂| 亚洲精品日本国产第一区| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久久鲁丝午夜福利片| 永久免费av网站大全| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久久久精品国产欧美久久久 | 午夜福利一区二区在线看| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲一码二码三码区别大吗| 免费在线观看黄色视频的| 国产片内射在线| 亚洲综合精品二区| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 人体艺术视频欧美日本| 大香蕉久久成人网| 久久久久国产一级毛片高清牌| 日日爽夜夜爽网站| 国产黄色视频一区二区在线观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 欧美激情 高清一区二区三区| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲精品国产一区二区精华液| 男男h啪啪无遮挡| 一边摸一边做爽爽视频免费| 丁香六月天网| 成年人免费黄色播放视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 免费av中文字幕在线| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 999精品在线视频| 亚洲第一av免费看| 看十八女毛片水多多多| 久久精品亚洲av国产电影网| 大片电影免费在线观看免费| 嫩草影院入口| 亚洲成人一二三区av| 日韩一区二区视频免费看| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲成国产人片在线观看| 一区二区三区四区激情视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 免费观看性生交大片5| 欧美国产精品一级二级三级| 大码成人一级视频| 各种免费的搞黄视频| 亚洲国产av影院在线观看| 中文字幕人妻熟女乱码| 最黄视频免费看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 99香蕉大伊视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 午夜av观看不卡| 一区在线观看完整版| 成人手机av| 久久久精品94久久精品| 欧美国产精品va在线观看不卡| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 精品视频人人做人人爽| 午夜av观看不卡| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产一卡二卡三卡精品 | 超碰97精品在线观看| 亚洲av电影在线进入| 日韩中文字幕视频在线看片| 久久久久久久大尺度免费视频| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲精品久久午夜乱码| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲国产av影院在线观看| 欧美精品亚洲一区二区| videosex国产| 男女国产视频网站| 欧美av亚洲av综合av国产av | 高清在线视频一区二区三区| 一级,二级,三级黄色视频| 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲七黄色美女视频| 人成视频在线观看免费观看| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲精品av麻豆狂野| 久久久久久免费高清国产稀缺| 久久久国产精品麻豆| 大码成人一级视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 亚洲人成电影观看| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲精品美女久久av网站| 成年女人毛片免费观看观看9 | 秋霞在线观看毛片| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 无遮挡黄片免费观看| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产精品女同一区二区软件| 在线观看一区二区三区激情| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲五月色婷婷综合| 成人亚洲精品一区在线观看| 两个人看的免费小视频| 成年动漫av网址| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产日韩欧美视频二区| 制服丝袜香蕉在线| 9191精品国产免费久久| 捣出白浆h1v1| 久久久国产一区二区| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 综合色丁香网| 日韩视频在线欧美| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 99国产综合亚洲精品| 搡老乐熟女国产| 亚洲精品一区蜜桃| 国产黄频视频在线观看| 午夜日韩欧美国产| 亚洲第一av免费看| 99热国产这里只有精品6| 免费日韩欧美在线观看| 久久女婷五月综合色啪小说| 黄色怎么调成土黄色| 日日啪夜夜爽| 观看av在线不卡| 老司机亚洲免费影院| 久久鲁丝午夜福利片| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产成人精品在线电影| 一边亲一边摸免费视频| 91成人精品电影| 国产黄色免费在线视频| 久久韩国三级中文字幕| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲av国产av综合av卡| 又黄又粗又硬又大视频| 久久毛片免费看一区二区三区| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲欧美日韩另类电影网站| av.在线天堂| 青青草视频在线视频观看| 丝袜喷水一区| 欧美日韩视频精品一区| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 久久精品国产亚洲av涩爱| 成年女人毛片免费观看观看9 | 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 久久久久久久久免费视频了| 欧美97在线视频| 青草久久国产| 亚洲成人手机| 亚洲少妇的诱惑av| 黄片无遮挡物在线观看| 国产99久久九九免费精品| 999精品在线视频| 在线看a的网站| 久久97久久精品| 日韩精品免费视频一区二区三区| 操美女的视频在线观看| 国产一级毛片在线| 一级,二级,三级黄色视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲,欧美精品.| 成人三级做爰电影| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲欧美激情在线| 精品福利永久在线观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久精品国产亚洲av涩爱| 久久久国产一区二区| 亚洲美女搞黄在线观看| 波多野结衣一区麻豆| 在线 av 中文字幕| videosex国产| 国精品久久久久久国模美| 人妻 亚洲 视频| 国产精品无大码| 男人爽女人下面视频在线观看| 精品少妇黑人巨大在线播放| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 老司机影院毛片| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲久久久国产精品| 国产精品人妻久久久影院| 青春草国产在线视频| 欧美日韩综合久久久久久| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产黄频视频在线观看| 欧美日韩精品网址| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产精品一区二区在线不卡| 免费少妇av软件| 99精品久久久久人妻精品| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 欧美日韩综合久久久久久| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲人成网站在线观看播放| 黑人猛操日本美女一级片| 波多野结衣av一区二区av| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 国产日韩一区二区三区精品不卡| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲四区av| 日韩电影二区| 成年美女黄网站色视频大全免费| av片东京热男人的天堂| 国产福利在线免费观看视频| av网站在线播放免费| 亚洲五月色婷婷综合| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 黑人猛操日本美女一级片| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 少妇的丰满在线观看| 99香蕉大伊视频| 国产亚洲最大av| 蜜桃国产av成人99| 伦理电影大哥的女人| 久热这里只有精品99| 欧美日韩视频精品一区| 美女国产高潮福利片在线看| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 中文字幕色久视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产精品久久久久成人av| 亚洲欧美成人精品一区二区| 日本色播在线视频| 无限看片的www在线观看| 免费在线观看完整版高清| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲精品视频女| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲成人国产一区在线观看 | 波多野结衣一区麻豆| 亚洲精品久久午夜乱码| 午夜免费观看性视频| 人人妻人人澡人人看| 97人妻天天添夜夜摸| 国产成人一区二区在线| 亚洲成国产人片在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 女人久久www免费人成看片| 天美传媒精品一区二区| 欧美日本中文国产一区发布| 中文字幕高清在线视频| 国产有黄有色有爽视频| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲七黄色美女视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产 精品1| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产精品一二三区在线看| 成人手机av| 老汉色∧v一级毛片| 99精品久久久久人妻精品| 18禁动态无遮挡网站| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 久久久久久人妻| 在线观看免费午夜福利视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 777米奇影视久久| 免费少妇av软件| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 久久久欧美国产精品| 欧美精品av麻豆av| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 七月丁香在线播放| 国产极品天堂在线| 综合色丁香网| av在线老鸭窝| 成人手机av| 美女国产高潮福利片在线看| 午夜福利免费观看在线| 成人漫画全彩无遮挡| 天天影视国产精品| 丝袜人妻中文字幕| 99久国产av精品国产电影| 亚洲在久久综合| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲国产精品国产精品| a级毛片在线看网站| 91精品国产国语对白视频| 日韩一区二区视频免费看| 国产麻豆69| 18禁观看日本| av片东京热男人的天堂| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 看免费av毛片| 色网站视频免费| 热99国产精品久久久久久7| 女性被躁到高潮视频| 国产毛片在线视频| 国产精品免费大片| 欧美成人精品欧美一级黄| 欧美精品一区二区大全| 国产99久久九九免费精品| 两个人免费观看高清视频| 中文字幕色久视频| 九九爱精品视频在线观看| 黄片无遮挡物在线观看| 欧美精品亚洲一区二区| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲国产精品999| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 成人亚洲欧美一区二区av| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产精品.久久久| 国产免费一区二区三区四区乱码| 男女下面插进去视频免费观看| 9热在线视频观看99| 亚洲精品视频女| 老汉色∧v一级毛片| 国产一区二区在线观看av| 亚洲第一av免费看| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产在线视频一区二区| 婷婷色综合www| 一级片免费观看大全| 国产精品一二三区在线看| 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美精品高潮呻吟av久久| 一级毛片电影观看| 国产一区二区激情短视频 | 日本av手机在线免费观看| 老司机影院毛片| 曰老女人黄片| 国产黄频视频在线观看| 十八禁高潮呻吟视频| 国产精品免费大片| 亚洲,欧美,日韩| 99久久综合免费| 永久免费av网站大全| 青春草国产在线视频| 在线观看免费午夜福利视频| 日本欧美视频一区| 久久综合国产亚洲精品| 国产精品.久久久| 老司机亚洲免费影院| 一区二区三区精品91| 成年av动漫网址| 午夜激情久久久久久久| 亚洲在久久综合| 久久精品国产综合久久久| 久久国产精品大桥未久av| 一区二区三区乱码不卡18| 人体艺术视频欧美日本| 咕卡用的链子| 欧美日本中文国产一区发布| 久久ye,这里只有精品| 午夜福利乱码中文字幕| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 午夜影院在线不卡| 精品久久蜜臀av无| 日日啪夜夜爽| 欧美日韩福利视频一区二区| 丝袜在线中文字幕| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 一区二区av电影网| 赤兔流量卡办理| 亚洲色图综合在线观看| 男女下面插进去视频免费观看| 国产精品久久久久久精品古装| 99热网站在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 好男人视频免费观看在线| 欧美精品一区二区大全| 亚洲精品国产av蜜桃| 大片电影免费在线观看免费| 91精品三级在线观看| 我要看黄色一级片免费的| 超色免费av| 老熟女久久久| 国产亚洲最大av| 欧美最新免费一区二区三区| 老司机在亚洲福利影院| 99精品久久久久人妻精品| 美女午夜性视频免费| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 黄频高清免费视频| 妹子高潮喷水视频| 最新在线观看一区二区三区 | 五月开心婷婷网| av不卡在线播放| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 伊人久久国产一区二区| 久久影院123| 黑丝袜美女国产一区| 欧美日韩av久久| 精品国产乱码久久久久久小说| 日韩精品免费视频一区二区三区| av国产精品久久久久影院| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 欧美人与善性xxx| 午夜福利影视在线免费观看| 日本av免费视频播放| 搡老岳熟女国产| 91老司机精品| 久久人妻熟女aⅴ| 韩国高清视频一区二区三区| 十分钟在线观看高清视频www| 久久av网站| 高清欧美精品videossex| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产精品一区二区在线不卡| 看十八女毛片水多多多| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 午夜日本视频在线| www日本在线高清视频| 成人亚洲欧美一区二区av| 中文字幕高清在线视频| 国产精品.久久久| 日本av手机在线免费观看| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 一本色道久久久久久精品综合| 午夜影院在线不卡| 美女扒开内裤让男人捅视频| av视频免费观看在线观看| 极品人妻少妇av视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 精品久久蜜臀av无| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 少妇人妻久久综合中文| 亚洲精品中文字幕在线视频| 99香蕉大伊视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产精品国产三级专区第一集| 999精品在线视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| 久久精品久久久久久久性| 国产熟女欧美一区二区| 色婷婷久久久亚洲欧美| 考比视频在线观看| 久久久久视频综合| h视频一区二区三区| 成人国产av品久久久| 午夜福利视频精品| 视频在线观看一区二区三区| 国产精品一区二区在线不卡| 国产午夜精品一二区理论片| 天美传媒精品一区二区| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 在线观看免费日韩欧美大片| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产一区二区三区综合在线观看| 亚洲一区中文字幕在线| 日韩av不卡免费在线播放| 高清在线视频一区二区三区| 我的亚洲天堂| 国产熟女欧美一区二区| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲av男天堂| 黑丝袜美女国产一区| 97人妻天天添夜夜摸| 一级毛片 在线播放| 亚洲久久久国产精品| 国产精品一区二区精品视频观看| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲国产成人一精品久久久| 中文字幕最新亚洲高清| 大话2 男鬼变身卡| 国产在线一区二区三区精| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 自线自在国产av| 久久午夜综合久久蜜桃|