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    鋁佐劑含量檢測(cè)方法的探討

    2022-11-16 04:34:45王平綜述劉梅影審校
    中國生物制品學(xué)雜志 2022年6期
    關(guān)鍵詞:佐劑靈敏度疫苗

    王平 綜述,劉梅影 審校

    國藥中生生物技術(shù)研究院有限公司,北京 101111

    從1926年Glenny 發(fā)現(xiàn)鋁佐劑至今,鋁佐劑的使用已有近百年的歷史。至目前為止,鋁佐劑是被批準(zhǔn)應(yīng)用于人類疫苗最廣泛的佐劑,也是我國唯一獲得臨床批準(zhǔn)使用的疫苗佐劑[1-4]。中國已上市含鋁佐劑疫苗共17 種,涉及滅活疫苗、重組基因工程疫苗、亞單位疫苗和聯(lián)合疫苗等多個(gè)疫苗類型,包括吸附百白破系列疫苗、甲 / 乙 / 戊肝系列疫苗、流感病毒系列疫苗以及森林腦炎滅活疫苗、雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗等[5-6]。

    鋁佐劑種類主要包括氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁鉀、氫氧化鋁和磷酸鋁的混合系統(tǒng)以及與其他佐劑成分組成的佐劑系統(tǒng),其中應(yīng)用最廣泛的為氫氧化鋁佐劑和磷酸鋁佐劑[2]。鋁佐劑的安全性和有效性均得到了充分驗(yàn)證[7-9],其含量對(duì)疫苗的免疫原性和安全性均具有重要影響。一方面通過增強(qiáng)抗原遞呈、增強(qiáng)Th2 細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答、激活B細(xì)胞誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生以及激活補(bǔ)體等作用增強(qiáng)疫苗的免疫原性;另一方面也存在安全隱患,可誘導(dǎo)過敏反應(yīng)和產(chǎn)生神經(jīng)毒性[10]。因此,國際上通過法規(guī)或通則的形式對(duì)鋁佐劑的安全性限度標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了嚴(yán)格規(guī)定[2,11-15]:均以鋁離子含量為單位計(jì),世界衛(wèi)生組織及歐盟為不高于1.25 mg / 劑,美國要求不高于0.85 mg / 劑;而目前上市疫苗鋁佐劑多為 0.3 ~0.5 mg / 劑。因此在不影響抗體產(chǎn)生量的前提下,應(yīng)盡可能降低疫苗中鋁佐劑含量,采用能夠達(dá)到預(yù)期人體有效性最小劑量的使用原則,盡可能降低臨床不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生[16-18]。

    鋁佐劑粒徑的不均一性容易引起分裝后每劑疫苗中鋁佐劑含量不一致,從而使接種個(gè)體產(chǎn)生免疫效果差異。隨著多肽疫苗、亞單位疫苗不斷涌現(xiàn),對(duì)疫苗佐劑的要求愈來愈高,對(duì)常規(guī)佐劑的改良研究也更加被重視起來,人們把目光從粒徑不均一、顆粒大的常規(guī)鋁佐劑投向納米鋁佐劑。納米鋁佐劑較常規(guī)鋁佐劑具有更多的優(yōu)點(diǎn):①顆粒更小。常規(guī)鋁佐劑在水溶液中形成1 ~20 μm 的顆粒,而納米鋁顆粒的直徑小于200 nm。因此相同含量的納米鋁佐劑會(huì)具有更大的表面積和更強(qiáng)的吸附能力;②納米鋁佐劑增加了抗原結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,較常規(guī)鋁佐劑不易脫出,且吸收更快、產(chǎn)生抗體時(shí)間更短;③納米鋁佐劑活性更強(qiáng)。微量納米鋁佐劑可使疫苗誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答[19-21]。納米鋁的應(yīng)用會(huì)在很多程度上降低鋁佐劑使用量,相應(yīng)降低鋁佐劑副反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn),但會(huì)對(duì)鋁佐劑檢測(cè)方法的靈敏度提出更高的要求。National Medical Products Administration 在 2019年12月發(fā)布的《預(yù)防用含鋁佐劑疫苗技術(shù)指導(dǎo)原則》中建議:將鋁佐劑和含鋁疫苗粒徑大小和分布納入質(zhì)量特性研究和日??刂频囊?,這就使得單支疫苗的鋁含量檢測(cè)成為質(zhì)量精準(zhǔn)控制的發(fā)展方向。

    目前含鋁佐劑疫苗常用的鋁含量檢測(cè)方法為乙二胺四乙酸二鈉(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt,EDTA-2Na)滴定法,該檢測(cè)方法是《中國藥典》三部(2020 版)[5]推薦方法,其原理是用過量EDTA-2Na 與Al3+發(fā)生反應(yīng),再用鋅滴定液滴定剩余EDTA-2Na,根據(jù)鋅滴定液的消耗量計(jì)算供試品中鋁佐劑含量。這種絡(luò)合滴定法簡單易行,是生物制品領(lǐng)域檢測(cè)鋁含量的經(jīng)典方法,也是《歐洲藥典》(第八版)[22]和WHO 推薦方法。但該方法存在不足之處:①根據(jù)指示劑顏色變化經(jīng)目測(cè)確定滴定終點(diǎn),易受人為因素影響;②靈敏度相對(duì)較低,為ppm 級(jí)別,檢測(cè)樣品一般需合并5 ~ 10 劑疫苗,不能檢測(cè)出單劑疫苗的鋁佐劑含量,不利于對(duì)疫苗的精準(zhǔn)質(zhì)量控制,這就需要靈敏度更高的檢測(cè)方法才能適應(yīng)檢測(cè)需求。

    目前國內(nèi)外各行業(yè)鋁含量檢測(cè)方法主要有分光光度法、色譜法、原子吸收光譜法(atomic absorption spectrophotometry,AAS)及電感耦合等離子體法(inductive coupled plasma emission spectrometry,ICP)等。根據(jù)檢測(cè)原理及靈敏度不同,檢測(cè)方法應(yīng)用領(lǐng)域也有所不同。分光光度法多應(yīng)用于食品領(lǐng)域,原子吸收光譜法多應(yīng)用于環(huán)境和化藥領(lǐng)域。這些方法對(duì)于疫苗中鋁佐劑含量檢測(cè)大多具有局限性,尤其是光譜方法,需要樣品預(yù)處理,即將疫苗樣品用濕式消解法(如硝酸消解法、硝酸-高氯酸消解法等)或微波消解,將其轉(zhuǎn)化為可溶的試樣。對(duì)于離子色譜法,為了測(cè)定復(fù)雜樣品中的鋁含量,經(jīng)常需對(duì)基質(zhì)進(jìn)行預(yù)濃縮和 / 或凈化,將不溶性的鋁轉(zhuǎn)化為可溶性的Al3+,同時(shí)又能排除疫苗中其他成分對(duì)檢測(cè)的干擾。以下我們對(duì)這些方法的原理、應(yīng)用及優(yōu)缺點(diǎn)作一介紹。

    1 鉻天青分光光度法

    光度法測(cè)定鋁的顯色劑較多,其中以鉻天青S為最佳。鉻天青簡稱CAS,是一種酸性染料。Al3+和鉻天青S 在弱酸性溶液中生成紅色的二元配合物,最大吸收波長為545 nm,如果加入含長碳鏈的有機(jī)表面活性劑,如溴化十六烷基三甲基銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB),則可形成三元配合物;其最大吸收波長向長波方向移動(dòng)(紅移),測(cè)定靈敏度顯著提高。目前食品中鋁含量測(cè)定采用食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.182—2017 規(guī)定的鉻天青分光光度法[23]。本方法原理為:在乙二胺-鹽酸緩沖液中,聚乙二醇辛基苯醚(TritonX-100)和溴代十六烷基吡啶(bromohexadecyl pyridine,CPB)的存在下,Al3+和鉻天青S 反應(yīng)生成藍(lán)綠色的四元膠束,于620 nm 波長處有特異吸收。分光光度法結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡單、成本較低,但也存在許多不足:①檢測(cè)過程步驟繁瑣,所用試劑較多;②形成的絡(luò)合物不穩(wěn)定[24];③靈敏度是 ppm 級(jí),適用于鋁含量較高(10 ~1 000 mg / kg)的情況[25];④易受多種因素影響[26];⑤使用大量有毒有害試劑,易造成環(huán)境的污染。

    2 色譜法

    目前國際上多采用色譜技術(shù)監(jiān)測(cè)環(huán)境中微量鋁含量,如反相高效液相色譜(reverse phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)-紫 外 檢測(cè)法[27-28]、液質(zhì)聯(lián)用(liquid chromatography mass spectrometry,LC-MS)[29]、離子色譜-柱后衍生法[30-31]等。USP37 在非處方藥鋁含量檢測(cè)中,除了滴定法還介紹了液相色譜法和離子色譜法,但在生物制品領(lǐng)域尚未見應(yīng)用色譜技術(shù)研究微量鋁含量的報(bào)道。可能是疫苗類樣品成分復(fù)雜,通過前處理對(duì)樣品進(jìn)行凈化排除蛋白、多糖類抗原物質(zhì)以及輔料成分對(duì)檢測(cè)的干擾是該方法能否成功的關(guān)鍵。

    2.1 RP-HPLC-紫外檢測(cè)法 RP-HPLC 分離技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于鋁與8-羥基喹啉(8-hydroxyquinoline,8-HQ)、8-羥基喹諾酮磺酸(8-hydroxyquinoline sulfonate,8-HQS)等螯合劑形成的絡(luò)合物分離。其中槲皮素(3,3′,4′,5′,7-五羥基黃酮)普遍存在于植物光合作用中,可與鋁選擇性地形成槲皮素-Al3+的絡(luò)合物。REKHI 等[32]使用槲皮素作為金屬絡(luò)合劑通過RP-HPLC 和紫外檢測(cè)器測(cè)定水樣中痕量鋁。首先采用織物相吸附萃?。╢abric phase sorptive extraction,F(xiàn)PSE)技術(shù)從水樣中預(yù)濃縮槲皮素-Al3+絡(luò)合物,然后通過反相C18 色譜柱實(shí)現(xiàn)槲皮素-Al3+絡(luò)合物的基線分離。新型FPSE-HPLC-紫外檢測(cè)法可靈敏、準(zhǔn)確、可靠地篩查各種水樣中鋁離子含量。

    2.2 LC-MS 乙磷鋁是一種植物殺蟲劑,在空氣中噴灑后對(duì)身體有害,BUIARELLI 等[33]采用選擇性液相層析串聯(lián)質(zhì)譜分析(liquid chromatography tandem-mass spectrometry,LC-MS / MS)方法來分析空氣顆粒物質(zhì)中的乙磷鋁殘留量。用Strata X 固相萃取技術(shù)從9 L 大氣顆粒物中采樣分析,用親水聚合物填料色譜柱和水 / 乙腈分步洗脫實(shí)現(xiàn)色譜分離,再用質(zhì)譜檢測(cè)以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring,MRM)模式在負(fù)電噴霧電離(electron spray ionization,ESI)中運(yùn)行。結(jié)果表明,該方法簡便、快速、適用于固體性質(zhì)樣品檢測(cè),可考慮應(yīng)用于其他種類樣品,如食物或土壤。

    2.3 離子色譜-柱后衍生 該方法檢測(cè)原理是利用Al3+與Tiron 衍生試劑在酸性條件下生成衍生物,在310 nm 波長處有特異吸收峰。通過陽離子螯合樹脂CS5 層析柱完成鋁的選擇性預(yù)濃縮以及鋁與其他過渡金屬及堿性金屬分離,再通過柱后衍生生成有紫外發(fā)色團(tuán)的衍生物。國藥中生生物技術(shù)研究院有限公司中心實(shí)驗(yàn)室建立了高溫干烤后加酸溶解的樣品前處理方法,解決了色譜技術(shù)檢測(cè)疫苗類產(chǎn)品的關(guān)鍵步驟。該方法可明顯提高鋁檢測(cè)的靈敏度和精確度,相較于滴定法減少了人為操作誤差,具有設(shè)置簡單、運(yùn)行速度快等優(yōu)點(diǎn),有利于對(duì)樣品進(jìn)行精準(zhǔn)質(zhì)量控制。

    2.4 AAS

    該方法為目前微量元素檢測(cè)的經(jīng)典方法[34-38],也是實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用最廣泛的方法,是基于被測(cè)元素基態(tài)原子在蒸氣狀態(tài)對(duì)其原子共振輻射的吸收進(jìn)行元素定量分析的方法。該方法選擇性強(qiáng),靈敏度高,分析范圍廣,目前可測(cè)定的元素種類已達(dá)70 多種。美國環(huán)境保護(hù)局出版的《水和廢水化學(xué)分析方法》明確指出水中34 個(gè)金屬用AAS 進(jìn)行測(cè)定;日本的工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(Japanese Industrial Standard,JIS)和我國水質(zhì)監(jiān)測(cè)也明確使用ASS 檢測(cè)的項(xiàng)目達(dá)15 項(xiàng)以上。國際標(biāo)準(zhǔn)組織(International Organization for Standardization,ISO)近幾年也在為把ASS 列為標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行積極工作。原子吸收光譜儀的關(guān)鍵部件是原子化系統(tǒng),按照原子化裝置的不同可分為火焰原子吸收光譜法(flame atomic absorption spectrometry,F(xiàn)-AAS)、石墨爐原子吸收法(graphite furnace atomic absorption spectrometry,GF-AAS)和氫化物發(fā)生原子吸收光譜法(hydride generation atomic absorption spectrometry,HG-AAS),適合檢測(cè)鋁元素的為前2 種方法。

    2.4.1 F-AAS 該方法具有準(zhǔn)確性好、操作簡單、成本較低、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于環(huán)境分析、農(nóng)業(yè)、冶金、石油工業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域[39-43]。武慧欣等[44]采用傳統(tǒng)濕法消解處理蔬菜樣品,用F-AAS 測(cè)定蔬菜中銅、鋅、鉛、鎘含量。結(jié)果顯示,4 種重金屬元素濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.03,回收率為在95% ~106%,檢測(cè)限均小于 0.31 mg / L。

    2.4.2 GF-AAS 與 F-AAS 相比,GF-AAS 具有靈敏度高、原子化效率高、測(cè)定元素范圍廣、進(jìn)樣量少以及利用率高等優(yōu)點(diǎn)[45-49]。焦二虎[50]采用 GF-AAS測(cè)定土壤樣品中鉛、鎘、鈷、銻、鈹含量,結(jié)果顯示,各元素檢出限為 0.008 ~ 0.06 μg / g,該方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。李墨等[51]用GF-AAS 測(cè)定生活水中的鋁含量,結(jié)果顯示,該方法操作簡便、快速、準(zhǔn)確、干擾小,方法檢測(cè)限為3.315 μg / L,最低檢出質(zhì)量濃度為13.26 μg / L,適合生活用水中鋁含量測(cè)定。雖然GF-AAS 檢測(cè)精度高于F-AAS,但重復(fù)性不如F-AAS 好,干擾性也大,這是由于石墨管內(nèi)部空間小,同時(shí)共存的基體物質(zhì)在空間的密度明顯增加,增加了其與被測(cè)元素間的相互作用機(jī)會(huì),產(chǎn)生的氣相干擾較F-AAS 嚴(yán)重,基體干擾也較嚴(yán)重,使得GF-AAS的準(zhǔn)確度要低于F-AAS。在檢測(cè)鋁含量時(shí),特制石墨管內(nèi)有鋯鹽涂層,且鋁元素較為活潑,不易保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性,尚需繼續(xù)改進(jìn)。

    2.4.3 HG-AAS HG-AAS 的顯著優(yōu)點(diǎn)是干擾小、重復(fù)性好。不足之處為:①原子化效率不足30%,因此相應(yīng)樣品進(jìn)樣量大,為10 ~ 20 mL,浪費(fèi)樣品;②靈敏度不高,為ppm 級(jí),痕量分析需對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)分離富集;③關(guān)鍵部件損耗大;④火焰由乙炔氣體產(chǎn)生,乙炔有難聞臭味且易燃,存在安全隱患。在檢測(cè)鋁元素時(shí),由于鋁元素電離能較高,空氣-乙炔火焰無法滿足要求,需使用一氧化二氮-乙炔火焰,因此危險(xiǎn)性較高。

    2.5 ICP

    ICP 屬于微量元素檢測(cè)的新方法,也是目前備受關(guān)注的推薦方法[52-56]。其原理為:待測(cè)物質(zhì)含元素發(fā)射的特征譜線,根據(jù)譜線存在與否和強(qiáng)度進(jìn)行樣品中相應(yīng)元素的定性和定量分析。將樣品經(jīng)蠕動(dòng)泵由氬氣帶入霧化系統(tǒng)進(jìn)行霧化形成氣溶膠,顆粒大且不均勻的氣溶膠由廢液口排出,顆粒小且均勻的氣溶膠進(jìn)入等離子體的軸向通道,在高溫和惰性氣氛中被充分蒸發(fā)、原子化、發(fā)生電離和激發(fā),發(fā)出所含元素的特征譜線。根據(jù)檢測(cè)器的不同可分為2 種類型,電感耦合等離子體光譜法(inductively coupled plasma-optical emission spectrometer,ICP-OES)和電感耦合等離子體質(zhì)譜法(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)。這兩種檢測(cè)方法的激發(fā)源均為電感耦合,ICP 通過全譜直讀/ 單道掃描的方式進(jìn)行光學(xué)測(cè)定,線性范圍寬、可同時(shí)對(duì)多種元素進(jìn)行檢測(cè)分析[57-60],從而實(shí)現(xiàn)樣本的高通量檢測(cè)。ICP 廣泛應(yīng)用于環(huán)境、食品、生物醫(yī)藥等多種領(lǐng)域。

    2.5.1 ICP-OES 光譜儀所用檢測(cè)器為CCD 檢測(cè)器,需要通過分析外標(biāo)物得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后對(duì)待測(cè)物開展定量分析。用該方法檢測(cè)13 價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗中鋁含量,檢出限為 0.015 μg / mL,方法準(zhǔn)確度和精密度均良好[61]。缺點(diǎn)是儀器價(jià)格昂貴,氬氣消耗量較大,全程需氬氣吹掃及電離,在基層單位推廣應(yīng)用具有一定困難。

    2.5.2 ICP-MS 原理同ICP-OES,不同之處在于檢測(cè)器為質(zhì)譜檢測(cè)器,以質(zhì)譜測(cè)量峰型,靈敏度可達(dá)ppb ~ ppt 級(jí),可實(shí)現(xiàn)樣本中痕量元素檢測(cè),檢測(cè)范圍較光譜法更廣泛,常用在包材相容性檢測(cè)中[62-64]。但質(zhì)譜檢測(cè)更易受到干擾,且該方法不可使用干法消解法處理樣品,因?yàn)檑釄鍟?huì)吸附一定量的鋁元素而影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。不足之處為:①設(shè)備昂貴,維護(hù)費(fèi)用高;②對(duì)操作人員要求較高,且需要自建方法,根據(jù)待測(cè)元素及其樣品中的干擾雜質(zhì),選擇合適的檢測(cè)波長,既要保證待測(cè)元素有最大吸收又要排除雜質(zhì)的干擾;③質(zhì)譜檢測(cè)器比較精細(xì),受外界干擾較大。因此,ICP-MS 的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性也備受大家關(guān)注。

    3 結(jié) 語

    以上幾種鋁含量檢測(cè)方法,就靈敏度而言,EDTA-2Na 滴定法和鉻天青分光光度法靈敏度較低。EDTA-2Na 滴定法不能檢測(cè)單劑疫苗中鋁佐劑含量,需合并5 ~ 10 支疫苗進(jìn)行檢測(cè),不能對(duì)疫苗進(jìn)行精準(zhǔn)質(zhì)量控制;目測(cè)滴定終點(diǎn),易產(chǎn)生人為誤差。而分光光度法操作步驟繁瑣,檢測(cè)過程中會(huì)用到有毒有害試劑,易造成環(huán)境污染。

    色譜法、AAS 和ICP 靈敏度顯著提高,能夠?qū)崿F(xiàn)單劑疫苗的檢測(cè),實(shí)現(xiàn)了對(duì)疫苗質(zhì)量的精準(zhǔn)質(zhì)量控制,為研發(fā)過程中鋁佐劑制備工藝、抗原吸附工藝和分裝工藝優(yōu)化提供了有效的判斷手段。但這3 種方法均需對(duì)樣品進(jìn)行前處理來滿足檢測(cè)需要。其中FAAS 原子化效率較低,比較浪費(fèi)樣品,但干擾小,重復(fù)性好;相反,GF-AAS 原子化效率較高,進(jìn)樣量小,但由于內(nèi)部空間狹小導(dǎo)致干擾大,重復(fù)性差。尤其F-AAS 使用易燃的乙炔氣體,存在安全隱患。

    ICP-OES / ICP-MS 法是近幾年微量元素檢測(cè)的新興方法,顯著優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)檢測(cè)多種元素,滿足了各國藥典對(duì)鋁佐劑不斷提高的質(zhì)控要求,可在檢測(cè)鋁含量的同時(shí)檢測(cè)砷、鐵等重金屬元素,大大減少了工作量,符合未來發(fā)展的需求,但缺點(diǎn)是儀器價(jià)格昂貴,維護(hù)成本高。

    綜上所述,實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)要求和條件選擇合適的檢測(cè)方法。

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