金黃色葡萄球菌四組分候選疫苗的免疫原性和保護效力評價

郭京蓉，林海濤，周繼唯，肖盟，袁玉蘭，張云濤

1.國藥中生生物技術研究院有限公司，北京 101111；2.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科，北京 100730；3.中國生物技術股份有限公司，北京 100029

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，簡稱金葡菌）是重要的院內(nèi)感染病原菌之一，可導致心內(nèi)膜炎、肺炎、膿毒性關節(jié)炎、骨髓炎和全身膿毒血癥等多種嚴重疾?。?］。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）等多重耐藥菌株的出現(xiàn)使抗生素治療有效率降低，疾病反復發(fā)作難以治愈，住院時間延長，病死率增加［2］，醫(yī)療費用大幅上升，金葡菌感染已成為全球范圍內(nèi)主要的臨床負擔。

疫苗是感染性疾病重要的防控手段。基于前期對預防金葡菌候選疫苗研發(fā)失敗原因的分析［3］，目前研發(fā)者普遍認為，針對表面多糖、細胞壁相關蛋白和分泌毒素等多靶點的多抗原組分疫苗誘導的保護性免疫反應可在金葡菌感染和致病過程中發(fā)揮疊加或協(xié)同效應，達到理想的保護效果。莢膜多糖（capsular polysaccharide，CP）具有抗吞噬作用，是金葡菌免疫逃避的關鍵。所有金葡菌臨床分離株均有CP5 或CP8 的遺傳途徑（基因通路），大部分菌株可表達CP5 或CP8，將純化CP 抗原與載體蛋白結(jié)合可提高其免疫原性和誘導T 細胞記憶［4］。α-溶血素（α-hemolysin，Hla）和錳轉(zhuǎn)運蛋白 C（manganese transporter C，MntC）分別是金葡菌分泌毒素和表面蛋白，在臨床分離株中廣泛表達且高度保守。Hla 對多種血細胞和組織細胞具有破壞作用，導致炎癥和組織損傷病變，能幫助金葡菌逃避宿主免疫攻擊；MntC 是金葡菌在宿主體內(nèi)獲取錳元素維持生長代謝的關鍵蛋白，在抵抗宿主免疫防御中發(fā)揮作用。CP 結(jié)合物、重組蛋白突變無毒 Hla（mutant nontoxic Hla，mHla）和MntC 均已在動物模型中顯示出一定的免疫原性和保護作用［5-7］，相關金葡菌多組分候選疫苗已進入臨床研究階段［8-9］。本研究用CP5 結(jié)合物、CP8 結(jié)合物、重組蛋白mHla、MntC 配制金葡菌四組分候選疫苗（Staphylococcus aureus 4-antigen vaccine，SA4Ag）免疫小鼠，采用不同基因型的金葡菌進行感染，以評價SA4Ag 的免疫原性和保護效力。

1 材料與方法

1.1 菌株 金葡菌國際標準株49521（CP5 型）和49525（CP8 型）購自ATCC，由國藥中生生物技術研究院有限公司金葡課題組傳代保存；6 株國內(nèi)臨床分離株分別分離自 75、66、5、72、74、69 歲金葡菌感染患者的血液樣本，編碼為WLMQ-1801、LZ-3211、NN-567、NN-591、SY-1490、HF-1588，前 3 份樣本為cap8 基因型，后3 份為cap5 基因型，均由中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科保存。

1.2 主要試劑及儀器 鋁佐劑購自德國Brenntag公司；HRP 標記的羊抗鼠 IgG1、IgG2a、IgG2b 購自美國Jackson ImmunoResearch 公司；牛血清白蛋白（BSA）購自澳洲 BOVOGEN 公司；CP5 結(jié)合物、CP8 結(jié)合物、重組蛋白mHla、MntC 及胰蛋白酶大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）平板由國藥中生生物技術研究院有限公司金葡課題組制備；酶標儀（MULTISKAN ASCENT）購自美國Thermo 公司。

1.3 實驗動物 SPF 級 BALB ／c 小鼠，雌性，5 周齡，體重14 ~ 16 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號為：SCXK（京）2016-0006。本實驗對小鼠的所有處理均以科研為目的進行養(yǎng)殖和使用，且按照《北京市實驗動物倫理審查指南》相關規(guī)定進行。

1.4 疫苗的配制 采用CP5 結(jié)合物、CP8 結(jié)合物、重組蛋白mHla、MntC 配制SA4Ag，將各組分原液加入PBS 稀釋的鋁佐劑中，每劑SA4Ag（0.2 mL）中含 CP5、CP8 各 2.5 μg，mHla、MntC 各 5 μg，鋁佐劑100 μg。

1.5 攻毒菌液的制備 將金葡菌國際標準株49521、49525 及6 株臨床分離株接種至TSA 平板，于37 ℃培養(yǎng)24 h；刮取菌苔于PBS 中，用分光光度法測定濃度（A600），調(diào)節(jié)至所需濃度。

1.6 SA4Ag 免疫后小鼠血清中特異性抗體水平的檢測將10 只小鼠隨機分為免疫組和對照組，每組5 只，經(jīng)皮下分別免疫SA4Ag 和鋁佐劑，0.2 mL／只，共免疫3次，每次間隔2 周。末次免疫后10 d，經(jīng)眼眶采血，分離血清，-20 ℃保存。用碳酸鹽緩沖液稀釋各抗原，分別包被酶標板（CP5 及 CP8 為 0.2 μg ／孔，mHla 及MntC 為 0.1 μg ／孔），4 ℃過夜；PBST 洗滌 3 次，用 1%BSA 于 37 ℃封閉 2 h；PBST 洗滌 3 次，加待測血清（2 倍系列稀釋，1 ∶100~1 ∶6 553 600），37 ℃孵育 1 h；PBST 洗滌3 次，分別加入HRP 標記的羊抗鼠IgG1、IgG2a 和 IgG2b（均 1 ∶10 000 稀釋），37 ℃孵育 30 min；PBST 洗滌 3 次，加入 TMB 顯色液，37 ℃顯色 10 min；2 mol／L 硫酸終止反應，用酶標儀檢測A450。以對照組A450均值的2.1 倍為cut-off 值，免疫組血清A450≥cut-off 值的最高稀釋度即為抗體滴度。

1.7 SA4Ag 免疫后小鼠血液及臟器中細菌載量的檢測將48 只小鼠隨機分為免疫組和對照組，每組24 只，分別免疫SA4Ag 和鋁佐劑，免疫途徑及劑量同1.6 項。末次免疫后10 d，經(jīng)小鼠腹腔分別注射亞致死劑量的金葡菌國際標準株49521 和49525 菌液，劑量分別為3.5× 108和2.0× 109CFU ／（0.2 mL·只），各組每種菌液分別感染12 只。于感染后1 和3 d，經(jīng)眼球摘除采血，至肝素采血管內(nèi)；無菌取小鼠心臟和腎臟，充分研磨，用 PBS 進行 10 倍系列稀釋（101~ 105）后，涂布于TSA 平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，進行 CFU 計數(shù)［10］。

1.8 SA4Ag 免疫后小鼠臟器的組織病理學觀察 將24 只小鼠隨機分為免疫組和對照組，每組12 只，分別免疫SA4Ag 和鋁佐劑，免疫途徑及劑量同1.6 項。末次免疫后10 d，分別注射亞致死劑量的金葡菌國際標準株49521 和49525，感染途徑及劑量同1.7 項，各組每種菌液分別感染6 只。感染后0 和3 d，觀察小鼠生存狀態(tài)，并稱體重；感染后3 d，無菌取小鼠心臟和腎臟，經(jīng)4%多聚甲醛溶液浸泡固定，參考文獻［10］方法制備切片，進行鏡下觀察。

1.9 SA4Ag 免疫后小鼠生存率的計算 將160 只小鼠隨機分為免疫組和對照組，每組80 只，分別免疫SA4Ag 和鋁佐劑，免疫途徑及劑量同1.6 項。末次免疫后10 d，經(jīng)小鼠腹腔分別注射致死劑量的金葡菌國際標準株49521、49525 及6 株臨床分離株 WLMQ-1801、LZ-3211、NN-567、NN-591、SY-1490、HF-1588 菌液，感染劑量分別為 7.0 × 108、4.0 × 109、7.0 × 109、5.0 × 109、4.0 × 109、9.0 × 109、1.0 × 1010、4.0×109CFU ／（0.2 mL·只）。感染后連續(xù)觀察10 d，每日記錄小鼠存活情況。

1.10 統(tǒng)計學分析 應用Prism 5 軟件進行作圖和統(tǒng)計學分析，試驗數(shù)據(jù)以均值 ± 標準差（）表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗，生存曲線間的比較采用Mantel-Cox Log-rank 檢驗，以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 SA4Ag 免疫后小鼠血清中的特異性抗體水平SA4Ag 免疫后可誘導高水平的 CP5、CP8、mHla 和MntC 抗原特異性 IgG1、IgG2a 和 IgG2b 亞型抗體，抗體亞型以IgG1 為主，各抗原的特異性IgG1 水平均明顯高于 IgG2a（t 分別為 10.190、9.254、5.774 和15.010，P 均 ＜ 0.001）。見圖 1。

圖1 小鼠血清中各亞型抗體水平Fig.1 Serum antibody levels of various subtypes in mice

2.2 SA4Ag 免疫后小鼠血液及臟器中的細菌載量與對照組比較，金葡菌國際標準株49521 和49525菌液感染1、3 d 后，免疫組小鼠血液、心臟、腎臟中的細菌載量均明顯降低（t = 2.362 ~ 6.253，P =0.000 2 ~ 0.039 8），見圖 2。表明 SA4Ag 免疫可通過抑制或殺滅細菌，降低細菌載量，保護小鼠抵抗金葡菌感染。

圖2 各組小鼠血液及器官中的細菌載量Fig.2 Bacterial loads in blood and organs of mice in various groups

2.3 SA4Ag 免疫后小鼠臟器的組織病理學觀察 金葡菌國際標準株49521 和49525 菌液感染3 d 后，對照組小鼠心臟均可見多灶性化膿性炎、心肌間隙炎及炎細胞浸潤伴菌絲等明顯病變，腎臟可見多灶性化膿性炎、小灶炎、集合管內(nèi)菌斑及炎細胞浸潤等明顯病變；免疫組小鼠心臟、腎臟未見明顯病理改變或病變較輕微。見圖3。表明SA4Ag 免疫可通過抑制或殺滅細菌，降低細菌攻擊器官組織的能力，減輕心臟、腎臟組織病理損傷和炎性細胞浸潤。

圖3 各組小鼠臟器組織病理學觀察（HE 染色，× 200）Fig.3 Histopathological examination of organs of mice in various groups（HE staining，× 200）

2.4 SA4Ag 免疫后小鼠的生存狀態(tài)及體重 金葡菌國際標準株49521 和49525 菌液感染后，對照組小鼠發(fā)病癥狀（精神萎靡、弓背聳毛等）明顯，免疫組小鼠發(fā)病癥狀較輕，生存狀態(tài)較好。與感染0 d 比較，金葡菌國際標準株49521 和49525 菌液感染3 d后，對照組小鼠體重均明顯下降（t 分別為12.570 和9.595，P 均 ＜ 0.001），免疫組差異無統(tǒng)計學意義（t分別為 1.880 和 1.932，P 分別為 0.096 9 和 0.089 5）；感染0 d 時，金葡菌國際標準株49521 和49525 菌液的對照組與免疫組小鼠體重差異均無統(tǒng)計學意義（t 分別為 0.572 和 0.896，P 分別為 0.582 9 和 0.396 3），感染3 d 后，對照組小鼠體重均明顯低于免疫組（t 分別為 4.608 和 2.966，P 分別為 0.001 7 和 0.018 0）。見圖4。表明SA4Ag 免疫能減輕小鼠感染后發(fā)病癥狀，減少體重下降幅度，提高小鼠生存質(zhì)量。

圖4 各組小鼠的體重Fig.4 Bodyweights of mice in various groups

2.5 SA4Ag 免疫后小鼠的生存率 與對照組比較，感染金葡菌國際標準株49521、49525 及6 株臨床分離株 WLMQ-1801、LZ-3211、NN-567、NN-591、SY-1490、HF-1588 菌液的免疫組小鼠生存率可提高70% ~90%，且差異均有統(tǒng)計學意義（χ2分別為 16.76、17.98、14.58、14.03、16.06、7.358、6.227、15.34，P 分別為 ＜ 0.000 1、＜ 0.000 1、0.000 1、0.000 2、＜ 0.000 1、0.006 7、0.012 6 和 ＜ 0.000 1），見圖 5。表明SA4Ag在小鼠體內(nèi)針對不同菌株致死劑量感染可提供廣泛保護。

圖5 各組小鼠的生存曲線Fig.5 Survival curves of mice in various groups

3 討 論

金葡菌感染和耐藥是全球性臨床及公共衛(wèi)生問題，2017年被 WHO 列入耐藥細菌清單［11］，2014 —2019年，金葡菌檢出率在我國臨床分離的革蘭陽性菌中居首位，MRSA 檢出率達30%以上［12］，金葡菌致病因子較多，在研發(fā)多組分疫苗時需進行抗原的選擇和組合，有效的疫苗抗原應為在人類感染過程中廣泛表達且高度保守的毒力因子，能誘導產(chǎn)生直接抑制細菌活力及毒性的抗體或介導調(diào)理吞噬作用的抗體及誘導適當?shù)募毎庖叻磻?，應在模擬人類疾病的臨床前動物模型中具有保護性［13］。

若抗體能在感染早期階段抑制并消滅細菌，阻止全面持續(xù)感染的發(fā)生，疫苗研發(fā)成功的幾率更大，因此，識別和選擇能誘導保護性免疫應答并在感染早期表達的抗原十分重要。CP 和MntC 均在感染早期表達，CP 的表達是金葡菌等致病菌逃避先天免疫反應的常見機制，有利于細菌在體內(nèi)生存。純化CP與載體蛋白結(jié)合后免疫原性提高，可誘導產(chǎn)生具有調(diào)理吞噬殺菌能力的功能抗體。Hla 是金葡菌表達的成孔外毒素，能裂解人的血小板、內(nèi)皮細胞、上皮細胞和白細胞等多種細胞，還能裂解兔紅細胞，但不裂解人的紅細胞，因此可應用于體外溶血實驗。Hla與靶細胞結(jié)合后，寡聚成孔前結(jié)構(gòu)，隨后通過脂質(zhì)雙分子層擠壓桶攻擊細胞膜，形成七聚體親水性跨膜通道。Hla 是金葡菌具有充分致病力所必需的，Hla表達增加的菌株毒力更強［14］。Hla 通過裂解多種細胞，削弱宿主免疫系統(tǒng)，實現(xiàn)免疫逃逸和細菌播散，并導致炎癥和多器官組織破壞，在肺炎、敗血癥等多種金葡菌感染性疾病發(fā)病機制中起關鍵作用［15］。錳與金葡菌增殖存活和毒力作用密切相關，其中錳主要作為超氧化物歧化酶的重要輔助因子，可確保超氧化物歧化酶的活性，從而抑制活性氧，抵御中性粒細胞的氧化殺傷。錳在金葡菌生命活動中必不可少，但過量存在對金葡菌又有毒性，因此錳的攝取受到高度調(diào)控。MntC 是負責錳獲?。ń饘俳Y(jié)合）的異三聚體膜轉(zhuǎn)運蛋白MntABC 的表面暴露亞基，在富營養(yǎng)條件下的體外生長過程中不表達，但感染后在體內(nèi)表達迅速上調(diào)，協(xié)助金葡菌攝取錳，從而抵御和修復氧化殺傷，使金葡菌在吞噬氧化暴發(fā)后在體內(nèi)存活并高效生長，這是金葡菌在宿主體內(nèi)傳播和建立感染的關鍵［16-17］。另外，MntC 還可通過與細胞外基質(zhì)和凝血級聯(lián)宿主蛋白的相互作用，協(xié)助金葡菌黏膜定植和侵襲性感染［18］。本研究制備了包含針對上述4 個靶點抗原組分的SA4Ag，可通過抑制或阻斷金葡菌毒素釋放、生長代謝和免疫逃逸等關鍵致病環(huán)節(jié)，從而發(fā)揮更強的保護作用。

用適宜的動物模型進行體內(nèi)保護效力實驗是對疫苗最直接有效的評價方式。雖然動物實驗在評價疫苗效力方面存在局限性，與應用于真實目標人群存在一定差異，但基于臨床感染特點的動物模型仍是疫苗臨床前研究不可或缺的評價方法，是進行臨床研究的重要參考。本研究制備的SA4Ag 以氫氧化鋁為佐劑，可誘導產(chǎn)生抗原特異性高效價的IgG 各亞型抗體。本實驗結(jié)果表明，在亞致死劑量下，SA4Ag 免疫可明顯降低小鼠血液和臟器細菌載量（P ＜0.05），減輕臟器病理改變，維持小鼠更好生存狀態(tài)，明顯減少體重下降幅度（P ＜ 0.05）；致死劑量下，SA4Ag 免疫可顯著提高小鼠生存率（P ＜0.05），對不同菌株（標準菌株和臨床分離菌株）產(chǎn)生廣譜保護。用多個有代表性的流行菌株在動物模型中進行挑戰(zhàn)實驗是衡量疫苗效力的可靠方法［13］，本研究中多個具有代表性的國內(nèi)臨床分離株對免疫小鼠的攻毒保護性結(jié)果為證實SA4Ag 的保護效力提供了更全面的數(shù)據(jù)支持。

綜上所述，SA4Ag 具有較好的免疫原性，在小鼠全身感染模型中可產(chǎn)生較好的保護效力。