對(duì)羥基苯甲酸丙酯對(duì)大型溞(Daphnia magna)的毒性作用及其分子機(jī)制

李鈺靜, 黎昕, 馬雲(yún), 李曉怡, 曾鴻鵠,2,3, 梁延鵬,2,3, 宋曉紅,2,3,*

1. 廣西環(huán)境污染控制理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,桂林理工大學(xué),桂林 541000

2. 巖溶地區(qū)水污染控制與用水安全保障協(xié)同創(chuàng)新中心,桂林理工大學(xué),桂林 541000

3. 廣西環(huán)境污染控制理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室科教結(jié)合科技創(chuàng)新基地,桂林 541000

對(duì)羥基苯甲酸丙酯(propylparaben, PrP)是一種廣泛應(yīng)用于個(gè)人護(hù)理品和藥物的抗菌防腐劑。 由于該類(lèi)防腐劑的廣泛使用,在不同環(huán)境介質(zhì)(如土壤、水體和室內(nèi)灰塵等)中均被檢出[1]。 PrP 是地表水體中該類(lèi)防腐劑檢出濃度和檢出率最高的物質(zhì)之一[2-3]。 例如,中國(guó)珠江地區(qū)地表水中檢測(cè)到PrP 的最大濃度為3 142 ng·L-1[3],日本德島和大阪的城市溪流中檢測(cè)的PrP 最大濃度為207 ng·L-1[4],西班牙加利西亞地區(qū)檢測(cè)的PrP 最大濃度為69 ng·L-1[5]。在污水受納水體中,其濃度可能更高[6],并可能影響水生生物的正常生理過(guò)程[7]。 也有研究表明,對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)及其鹽類(lèi)能在水體和人體組織細(xì)胞中積累[8]。 PrP 的結(jié)構(gòu)與雌激素相似,并具有外源性雌激素作用[9],屬于內(nèi)分泌干擾物(EDCs)[10]。 Pedersen等[11]在虹鱒(Oncorhynchus mykiss)腹腔中注射的對(duì)羥基苯甲酸乙酯(EtP)、對(duì)羥基苯甲酸丁酯(BuP)和PrP 可引起雌激素反應(yīng),顯著誘導(dǎo)魚(yú)體內(nèi)卵黃原蛋白(VTG)的增加,表明 BuP 和 PrP 具有與雙酚 A(BPA)類(lèi)似的雌激素作用。 董力等[12]發(fā)現(xiàn)PrP 對(duì)人體角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCat)具有細(xì)胞毒性作用,可抑制細(xì)胞增殖,且具有時(shí)間-劑量效應(yīng)。 PrP 長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)存在于水環(huán)境中,對(duì)水生生物的潛在風(fēng)險(xiǎn)不可忽視。

溞類(lèi)是水體中初級(jí)生產(chǎn)者(藻類(lèi))和消費(fèi)者(如魚(yú)類(lèi))之間的連接樞紐,可影響食物網(wǎng)中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量的流動(dòng),在水生生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[13]。 大型溞(Daphnia magna)具有繁殖快、生長(zhǎng)周期短等優(yōu)點(diǎn),對(duì)毒性物質(zhì)反應(yīng)靈敏,是一種重要的生態(tài)指示種。 Chatterjee 等[14]發(fā)現(xiàn)將多代大型溞暴露于受糞大腸桿菌污染的野外溪流水中,會(huì)影響大型溞正常的生長(zhǎng)發(fā)育,出現(xiàn)體表面積增大、血紅蛋白和產(chǎn)卵數(shù)量增加等異常性狀,基于F0 和F1 代樣品蛋白組學(xué)的分析發(fā)現(xiàn),污染物改變了大型溞的能量代謝途徑,機(jī)體出現(xiàn)了氧化應(yīng)激和氧轉(zhuǎn)運(yùn)減弱。

許多環(huán)境污染物可改變解毒和抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)[15],如過(guò)氧化氫酶(cat)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(gst)和激素受體96(hr96)等,從而引起暴露生物的生理變化。cat、gst和hr96是大型溞解毒相關(guān)的基因,CAT 將H2O2分解成O2和 H2O,以減輕 H2O2對(duì)細(xì)胞的氧化損傷[16]。 GST 是調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)有毒化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)的分子保護(hù)機(jī)制中的一種清除劑[17]。hr96是一種混雜的核受體,由許多內(nèi)源和外源物質(zhì)激活[18],負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)許多參與解毒過(guò)程的基因。cyp314、vtg是與大型溞生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因,cyp314屬于線(xiàn)粒體細(xì)胞色素P450亞家族的基因,參與蛻皮酮的生物合成,調(diào)節(jié)無(wú)脊椎動(dòng)物的生長(zhǎng)和繁殖過(guò)程[19]。vtg是卵黃蛋白的前體,是許多卵生動(dòng)物體內(nèi)的主要脂蛋白[20],受雌激素控制[21]。 因此,可選用cat、gst、hr96、cyp314和vtg等基因,研究生物體的生存、生長(zhǎng)速率和繁殖等生理反應(yīng)與分子水平變化的密切關(guān)系[22]。

本研究以大型溞的表型變化(體長(zhǎng)、殼刺長(zhǎng)、復(fù)眼面積、體表面積和心跳等)作為毒性效應(yīng)指標(biāo),使用熒光定量 PCR 技術(shù)檢測(cè)大型溞cat、gst、hr96、cyp314和vtg等基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量變化,研究PrP 對(duì)大型溞抗氧化和解毒代謝系統(tǒng)及生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響,為合理的評(píng)價(jià)PrP 的潛在毒性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)生物

大型溞(Daphnia magna)購(gòu)買(mǎi)于江門(mén)弘光高科技有限公司。 試驗(yàn)開(kāi)始前,大型溞在實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)2 周,實(shí)驗(yàn)用水為曝氣72 h 的自來(lái)水;溫度(20±2) ℃;pH 7.0±0.1、溶解氧＞5 mg·L-1、光暗期為 12 h ∶12 h;光照強(qiáng)度為8 000 lx。 大型溞每3 d 換水、喂食純種斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)。 斜生柵藻購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 急性毒性與亞慢性毒性暴露實(shí)驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)[23]的實(shí)驗(yàn)方法,對(duì)大型溞幼溞進(jìn)行急性毒性與亞慢性毒性暴露實(shí)驗(yàn),探究PrP 對(duì)大型溞生長(zhǎng)發(fā)育的影響。 選取出生約24 h 的480 只健康幼溞進(jìn)行暴露試驗(yàn),以PrP 的水環(huán)境檢測(cè)濃度(3 142 ng·L-1)[3]、大型溞 24 h-LC50(21.1 mg·L-1)[24-26]和 24 h最大無(wú)觀測(cè)效應(yīng)濃度(NOEC 24 hfeeding≥4 mg·L-1[26])為參考依據(jù),針對(duì)日常水環(huán)境、特殊環(huán)境水體(如污水受納水體、污水進(jìn)水口等)以及PrP 在水環(huán)境蓄積的極端情況等不同情形,分別設(shè)計(jì)了0、0.3、12 和 480 μg·L-14個(gè)不同的處理組。 將 PrP(分析純,西隴科學(xué)有限公司)用DMSO(分析純,西隴科學(xué)有限公司)配制成儲(chǔ)備液(20 g·L-1),并逐級(jí)稀釋配制成不同濃度的暴露液,暴露液中DMSO 的濃度為0.005% (V∶V)。 每個(gè)處理組設(shè)置 4 組平行,每個(gè)平行組中用100 mL 的玻璃皿裝入50 mL 暴露液,隨機(jī)放入15 只幼溞,置于恒溫光照培養(yǎng)箱中,其他條件與馴養(yǎng)期間相同。 暴露實(shí)驗(yàn)分為4 d 和8 d 共2 組,每日記錄大型溞的存活情況。

1.2.2 大型溞表型變化的測(cè)定與取樣

4 d 和8 d PrP 暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,使用體式顯微鏡(Revolve,美國(guó)ECHO)觀察和記錄大型溞的表型變化。 將存活的大型溞置于顯微鏡下觀察,統(tǒng)計(jì)大型溞30 s 的心跳次數(shù)[27],用目鏡測(cè)微尺測(cè)量大型溞的體長(zhǎng)、體高和殼刺長(zhǎng),用顯微鏡自帶軟件測(cè)量復(fù)眼、心臟和體表面積。 觀察結(jié)束后,將大型溞置于RNA 保存液中(Takara),-20 ℃保存?zhèn)溆?用于提取總RNA。

1.2.3 總RNA 提取和cDNA 合成

采用RNAiso Plus 試劑(TaKaRa)提取大型溞的總RNA。 取8 只大型溞作為混合樣品,用勻漿儀(XFSTPRP-48,上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)進(jìn)行冷凍勻漿,經(jīng)過(guò)均質(zhì)化—相分離—RNA 沉淀—RNA洗滌—RNA 溶解等過(guò)程,得到大型溞的總RNA。使用微量分光光度計(jì)(Q5000,美國(guó) Quawell)檢測(cè)RNA 的質(zhì)量。 用 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒(TaKaRa)將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA,用于熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)[28]的方法,設(shè)計(jì)qPCR 特異性引物(表1),引物由華大基因公司合成。 以各處理組和對(duì)照組的32個(gè)樣品 cDNA 為模板,以大型溞β-actin基因作為內(nèi)參基因,參照PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 試劑盒(ABI,美國(guó)賽默飛世爾科技公司)的操作說(shuō)明,使用qPCR 儀(QuantStudio 3,美國(guó)賽默飛世爾科技公司)開(kāi)展實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn),每個(gè)樣品重復(fù)3 次,并設(shè)置陰性對(duì)照。 PCR 反應(yīng)體系為:PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 10 μL,cDNA 模板 2 μL,上下游引物(10 μmol·L-1)各 1 μL,雙蒸水6 μL。 反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性:95 ℃,30 s。 40個(gè)循環(huán):95 ℃,5 s;55 ℃,30 s。 熔解曲線(xiàn):95 ℃,10 s;65 ℃,5 s;95 ℃、0.5 s。 反應(yīng)結(jié)束后,查看 PCR 的擴(kuò)增曲線(xiàn)和熔解曲線(xiàn)判斷PCR 反應(yīng)的特異性。

表1 大型溞熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)的特異性引物序列Table 1 Specific primer sequences of Daphnia magna used in the qPCR experiments

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SEM)表示,用Graphpad 軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)、Tukey 多重比較,不同 PrP 處理組與空白對(duì)照組之間開(kāi)展配對(duì)t檢驗(yàn),以P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果(Results)

2.1 PrP 對(duì)大型溞生長(zhǎng)發(fā)育的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,對(duì)照組大型溞生長(zhǎng)正常,無(wú)死亡;PrP 暴露的各處理組中,480 μg·L-1處理組暴露4 d的死亡率為1.67%;12 μg·L-1處理組暴露8 d 的死亡率為3.33%;其余各組大型溞存活率均為100%。不同濃度PrP 暴露后,與對(duì)照組的表型相比,處理組出現(xiàn)了殼刺長(zhǎng)度減小,體高、體長(zhǎng)、心臟面積和體表面積增加的發(fā)育異?，F(xiàn)象(圖1)。 大型溞發(fā)育異常的表型統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2 和圖3 所示。

圖1 對(duì)羥基苯甲酸丙酯(PrP)暴露后大型溞的生長(zhǎng)發(fā)育異常注:(a)4 d 對(duì)照組的大型溞,(b)4 d 處理組的大型溞,(c)8 d 對(duì)照組的大型溞,(d)8 d 處理組的大型溞;A 標(biāo)示殼刺長(zhǎng)度減小,B 標(biāo)示體高增加,C 標(biāo)示體長(zhǎng)增加,D 標(biāo)示心臟面積增加。Fig.1 Abnormal development of Daphnia magna after propylparaben (PrP) exposureNote: (a) Daphnia magna in the control group of 4 d, (b) Daphnia magna in the treatment group of 4 d, (c) Daphnia magna in the control group of 8 d, (d) Daphnia magna in the treatment group of 8 d; A shows shortening of the shell spines length,B shows increase of the body height, C shows increase of the body length, and D shows increase of the heart area.

由圖2(a)可知,不同濃度PrP 暴露4 d 后,各處理組大型溞的體長(zhǎng)與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P＞0.05);暴露8 d 時(shí),12 μg·L-1處理組大型溞的體長(zhǎng)顯著大于對(duì)照組(1.11 倍)(P＜0.05)。 在圖 2(b)中,480 μg·L-1PrP 暴露4 d 時(shí),大型溞體高顯著大于對(duì)照組(P＜0.05);暴露8 d 后,PrP 各處理組大型溞的體高均大于對(duì)照組,其中12 μg·L-1和 480 μg·L-1PrP 處理組的體高顯著增加(P＜0.05)。 由圖2(c)可知,不同濃度PrP 暴露 4 d 時(shí),480 μg·L-1處理組中大型溞殼刺長(zhǎng)度平均值僅為對(duì)照組均值的0.86 倍,顯著小于其他組(P＜0.05);暴露 8 d 后,12 μg·L-1處理組的大型溞殼刺長(zhǎng)度平均值為對(duì)照組均值的1.15 倍,顯著大于其他組(P＜0.05)。

在圖2(d)中,PrP 暴露4 d 后,各組間大型溞復(fù)眼面積并無(wú)顯著差異(P＞0.05);暴露 8 d 后,12 μg·L-1PrP 處理組大型溞復(fù)眼面積顯著增加(P＜0.05)。由圖2(e)可知,PrP 暴露4 d 后,480 μg·L-1處理組大型溞的體表面積顯著大于對(duì)照組(P＜0.05);暴露8 d后,各處理組中大型溞的體表面積均顯著大于對(duì)照組(P＜0.05);其中,12 μg·L-1處理組變化最顯著,該組平均值為對(duì)照組均值的1.35 倍。

圖2 不同PrP 處理組暴露4 d 和8 d 后大型溞表型的變化注:柱形圖上的不同字母代表相同處理時(shí)間點(diǎn)不同PrP 處理組間的顯著差異(P＜0.05);n=30,下同。Fig.2 Changes of phenotypes of Daphnia magna in the different PrP treatment groups after exposure for 4 d and 8 dNote: Different letters on the bars represent significant differences between the PrP treatment groups after the same exposure times (P＜0.05); n=30, the same as follows.

相比暴露4 d,PrP 暴露8 d 后大型溞的體長(zhǎng)、體高、復(fù)眼面積和體表面積均顯著增長(zhǎng);統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明大型溞的發(fā)育異常主要表現(xiàn)為:暴露4 d 后,480 μg·L-1PrP 處理組體高、體長(zhǎng)變化顯著;暴露8 d 后,12 μg·L-1PrP 處理組表型變化最顯著,表現(xiàn)為促進(jìn)大型溞的生長(zhǎng)發(fā)育。

由圖 3(a)可知,PrP 暴露 4 d 和 8 d 后,各處理組心率變化顯著(P＜0.05),其中480 μg·L-1處理組心率最高,刺激反應(yīng)顯著(P＜0.05)。 而隨暴露時(shí)間延長(zhǎng),0.3 μg·L-1處理組暴露8 d 時(shí)的心率較暴露4 d 時(shí)顯著降低(P＜0.05)。 在圖 3(b)中,PrP 暴露 4 d 后,480 μg·L-1處理組心臟面積顯著大于對(duì)照組(P＜0.05);暴露8 d 后,12 μg·L-1處理組心臟面積平均值為對(duì)照組的均值1.33 倍,增長(zhǎng)程度顯著高于其他處理組(P＜0.05)。 相比暴露 4 d,PrP 暴露 8 d 時(shí)大型溞的心臟面積顯著增長(zhǎng)(P＜0.05);綜上可知,大型溞暴露于不同濃度的PrP 4 d 和8 d 后,心臟面積和心率均受到影響,表明PrP 對(duì)大型溞具有心臟毒性。

圖3 不同PrP 處理組暴露4 d 和8 d 對(duì)大型溞心臟的影響注:柱形圖上的不同字母代表相同處理時(shí)間點(diǎn)不同PrP 處理組間的顯著差異(P＜0.05),*代表相同劑量PrP 暴露不同時(shí)間后的顯著差異(P＜0.05);n=30,下同。Fig.3 Effects on Daphnia magna hearts in the different PrP treatment groups after exposure for 4 d and 8 dNote: Different letters on the bars represent significant differences between the PrP treatment groups after the same exposure times (P＜0.05), and stars (*) on the bars represent significant differences after different times between the same PrP treatment groups (P＜0.05); n=30, the same as follows.

2.2 PrP 對(duì)大型溞解毒和生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

在不同濃度的PrP 暴露條件下,cat基因的mRNA 表達(dá)量變化趨勢(shì)如圖4(a)所示,暴露4 d 后,0.3 μg·L-1和 12 μg·L-1處理組cat基因的表達(dá)量顯著上調(diào)(P＜0.05),480 μg·L-1處理組顯著下調(diào)(P＜0.05);暴露8 d 時(shí),PrP 各處理組均與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05),但 0.3 μg·L-1處理組顯著小于 12 μg·L-1處理組(P＜0.05)。 圖 4(b)中,暴露 4 d 后,12 μg·L-1PrP 處理組gst基因的相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(P＜0.05);暴露8 d 時(shí),PrP 各處理組均與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。 圖 4(c)展示hr96基因的 mRNA 表達(dá)量的變化趨勢(shì),暴露 4 d 時(shí),0.3 μg·L-1PrP 處理組hr96基因的表達(dá)量顯著上調(diào)(P＜0.05),480 μg·L-1PrP 處理組顯著下調(diào)(P＜0.05);暴露 8 d 后,PrP 各處理組hr96基因的表達(dá)量均無(wú)顯著變化(P＜0.05);但0.3 μg·L-1PrP 暴露 4 d 后hr96基因的表達(dá)量顯著大于8 d 處理組(P＜0.05)。 綜上可知,暴露4 d 時(shí),大型溞的解毒相關(guān)基因具有一定的劑量效應(yīng);暴露時(shí)間延長(zhǎng)至8 d 時(shí),各處理組解毒相關(guān)基因與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

圖4 不同PrP 處理組暴露4 d 和8 d 對(duì)大型溞解毒相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.4 Effects on detoxification-related genes of Daphnia magna in the different PrP treatment groups after exposure for 4 d and 8 d

由圖 5(a)可知,0.3 μg·L-1PrP 處理組cyp314基因的mRNA 表達(dá)量先顯著上調(diào)(4 d,P＜0.05)后又顯著下降(8 d,P＜0.05)。 圖 5(b)中,480 μg·L-1PrP處理組暴露4 d 后vtg基因的表達(dá)量顯著下調(diào)(P＜0.05);暴露8 d 后,PrP 各處理組vtg基因的表達(dá)量均顯著下調(diào)(P＜0.05)。 由圖 4 和圖 5 可知,暴露4 d后,cyp314、vtg基因表達(dá)量的變化與解毒相關(guān)基因的變化基本保持同步;暴露 8 d 后,cat、gst、hr96和cyp314等基因無(wú)顯著變化,但PrP 各處理組vtg基因的表達(dá)量受到顯著抑制。

圖5 不同PrP 處理組暴露4 d 和8 d 對(duì)大型溞生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.5 Effects on growth and development genes of Daphnia magna in the different PrP treatment groups after exposure for 4 d and 8 d

3 討論(Discussion)

3.1 PrP 暴露對(duì)大型溞生長(zhǎng)發(fā)育的影響

大型溞的自然增長(zhǎng)率比生殖參數(shù)更加敏感,大型溞被低濃度污染物刺激后,受到輕度逆境脅迫,可促使其瞬時(shí)增長(zhǎng)率增大,以此來(lái)抵御外部不良的環(huán)境條件[31]。 本研究中,12 μg·L-1PrP 處理組大型溞的體長(zhǎng)、體高、殼刺長(zhǎng)、復(fù)眼面積和體表面積均顯著大于對(duì)照組,表明PrP 促進(jìn)了大型溞的生長(zhǎng)發(fā)育。這與一些研究結(jié)果相似,黃國(guó)蘭等[32]研究發(fā)現(xiàn)1.0、2.0 和4.0 mg·L-1的鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)對(duì)大型溞繁殖有抑制作用,而0.5 mg·L-1的DBP 顯著提高了大型溞的凈生殖率;劉青等[31]發(fā)現(xiàn)低濃度組(0.432、0.768 和1.120 μg·L-1)印楝素暴露大型溞后,內(nèi)稟增長(zhǎng)率與對(duì)照組相比也略有提高。 這些結(jié)果表明,大型溞種群動(dòng)態(tài)受到了影響,這種刺激作用干擾了大型溞正常的生長(zhǎng)發(fā)育,可能會(huì)造成大型溞的生命周期紊亂或產(chǎn)生致肥效應(yīng)。

卵黃素的產(chǎn)生受雌激素的控制,所以常被用作雌激素化合物的生物標(biāo)志物[33-34]。 暴露4 d 后12 μg·L-1PrP 處理組vtg基因的表達(dá)量不穩(wěn)定,可能與大型溞的個(gè)體差異有關(guān);暴露4 d 后,cyp314、vtg基因的表達(dá)量隨著PrP 濃度的升高先增加后下降,呈拋物線(xiàn)型劑量-效應(yīng)關(guān)系;低濃度 PrP 可刺激cyp314、vtg的表達(dá),具有雌激素效應(yīng),但高濃度的PrP 暴露可能對(duì)大型溞具有毒害作用,表現(xiàn)為毒性效應(yīng),造成大型溞的組織細(xì)胞損傷和表型變化。 由此說(shuō)明,PrP 對(duì)大型溞蛻皮激素與卵黃蛋白的合成造成影響,并誘導(dǎo)了大型溞的生長(zhǎng)發(fā)育異常。

此外,大型溞的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,表型變化相對(duì)于基因表達(dá)具有一定的滯后性,PrP 暴露4 d 的條件下基因的變化可能造成暴露8 d 時(shí)大型溞的發(fā)育異常。 Jemec 等[35]研究發(fā)現(xiàn),13.8 mg·L-1(亞致死濃度)BPA 暴露21 d 后,大型溞體長(zhǎng)和平均產(chǎn)卵量降低,并顯著抑制了CAT 和GST 的酶活性。 本研究中,PrP 暴露8 d 時(shí),各處理組vtg基因的mRNA 表達(dá)量均受到抑制,可能與大型溞體內(nèi)的活性氧積累引起的抗氧化與解毒反應(yīng)的能量消耗有關(guān),從而抑制了大型溞卵黃蛋白的產(chǎn)生,使大型溞的發(fā)育受到影響。Wang 等[17]發(fā)現(xiàn)布洛芬(IBU)暴露后大型溞也出現(xiàn)了類(lèi)似的現(xiàn)象,IBU 的存在引發(fā)的解毒過(guò)程也可能消耗大量的能量,導(dǎo)致機(jī)體生長(zhǎng)和產(chǎn)卵所需的能量減少,產(chǎn)卵量減少,從而導(dǎo)致生殖能力下降。

3.2 PrP 暴露對(duì)大型溞的心臟毒性

大型溞心臟器官與其他節(jié)肢動(dòng)物不同,是肌源性的,由一層肌肉細(xì)胞組成,在生理水平上可響應(yīng)各種內(nèi)源性信號(hào)分子,如生物體內(nèi)產(chǎn)生和循環(huán)的激素和神經(jīng)遞質(zhì)[27]。 心率是反映污染物對(duì)大型溞血液循環(huán)系統(tǒng)影響的敏感生理指標(biāo)[36]。 研究發(fā)現(xiàn),PrP 可與血漿蛋白結(jié)合,導(dǎo)致運(yùn)輸激素的外周活動(dòng)紊亂[37]。本研究中,480 μg·L-1PrP 暴露 4 d 后,大型溞心率激增且心臟面積顯著增加,cat基因的相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào),表明PrP 對(duì)心臟具有顯著的毒性作用。 也可能是由于PrP 在短時(shí)間、高濃度的刺激下,大型溞發(fā)生了氧化應(yīng)激反應(yīng),擾亂了大型溞的正常生理功能。

生物在轉(zhuǎn)錄水平上的變化,尤其是暴露于環(huán)境污染物時(shí)解毒系統(tǒng)所涉及的基因表達(dá)變化可提供最早期的警告信號(hào)[36]。 PrP 暴露 4 d 后,0.3 μg·L-1和12 μg·L-1處理組大型溞解毒相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào),生物體通過(guò)調(diào)節(jié)cat、gst活性來(lái)清除活性氧以避免氧化損傷;而大型溞在480 μg·L-1處理組的重度脅迫下,cat活性降低,過(guò)度積累活性氧(ROS)會(huì)導(dǎo)致有機(jī)體損傷。 Silva 等[38]的研究表明,對(duì)羥苯甲酸酯類(lèi)物質(zhì)的暴露導(dǎo)致了尼羅羅非魚(yú)鰓和肝細(xì)胞的生化變化,調(diào)節(jié)魚(yú)鰓和肝臟的抗氧化劑活性顯著增加;Wang 等[39]的研究表明,暴露于啶酰菌胺會(huì)降低斑馬魚(yú)胚胎的超氧化物歧化酶(SOD)活性,增加CAT 活性,并誘導(dǎo)氧化應(yīng)激;Cui 等[40]研究發(fā)現(xiàn),在急性接觸氯蟲(chóng)苯甲酰胺、氰蟲(chóng)苯甲酰胺和氟苯甲酰胺等農(nóng)藥后,大型溞體內(nèi)也觀察到類(lèi)似的抗氧化酶活性變化。 本實(shí)驗(yàn)中,暴露 4 d 后,cat、hr96基因的表達(dá)量隨著濃度升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì),具有拋物線(xiàn)型劑量-效應(yīng)關(guān)系。 大型溞暴露于PrP 的整個(gè)周期中,cat、hr96的表達(dá)量變化基本保持同步,其同步的原因可能是PrP 脅迫大型溞時(shí)cat、hr96協(xié)同調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育。 然而,由于調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性,后期需要研究更多參與抗氧化解毒系統(tǒng)的基因的變化,如nrf2、nqo1和gpx等[29]。

通過(guò)研究PrP 對(duì)大型溞生理變化(如體長(zhǎng)、殼刺長(zhǎng)、體表面積和心跳等)的影響,分析所選的5個(gè)基因(cat、gst、hr96、cyp314、vtg)的表達(dá)量來(lái)評(píng)估 PrP 對(duì)大型溞的毒性作用及分子機(jī)制。 PrP 暴露對(duì)大型溞的生長(zhǎng)發(fā)育具有促進(jìn)作用,呈現(xiàn)一定的時(shí)間與劑量效應(yīng),且PrP 暴露對(duì)大型溞具有一定的心臟毒性效應(yīng)。 暴露4 d 時(shí),大型溞解毒相關(guān)基因(cat、gst和hr96)與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因(cyp314、vtg)的表達(dá)量的變化基本保持同步,并呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng),表明這5個(gè)基因協(xié)同調(diào)節(jié)大型溞的解毒過(guò)程與生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。 綜上所述,PrP 能影響大型溞正常的生長(zhǎng)發(fā)育,研究結(jié)果可為PrP 的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)表征提供生態(tài)毒理數(shù)據(jù)。