多環(huán)芳烴類污染物對(duì)斑馬魚(yú)脅迫效應(yīng)的研究進(jìn)展

周宇淼, 張煥新,* , 鐘瑋, 孔強(qiáng),#

1. 山東師范大學(xué)地理與環(huán)境學(xué)院,濟(jì)南 250000

2. 山東省濟(jì)南市生態(tài)環(huán)境局章丘分局,濟(jì)南 250200

自然環(huán)境中的多環(huán)芳烴(PAHs)主要是由礦質(zhì)燃料如煤、石油等有機(jī)高分子化合物在不完全燃燒時(shí)產(chǎn)生的[1]。 水域中,PAHs 的入侵途徑主要有工農(nóng)業(yè)廢水排放、大氣污染物沉降、固體廢物滲瀝和土壤環(huán)境遷移等,對(duì)水生生物構(gòu)成一定的威脅。 采用模式生物斑馬魚(yú)(Danio rerio)作為受試生物可以快速有效地揭示PAHs 對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)及其機(jī)理。作為易于使用的體內(nèi)模型,斑馬魚(yú)及其胚胎和幼魚(yú)正越來(lái)越多地被用于評(píng)估污染物毒性作用,并對(duì)機(jī)體損傷的各種機(jī)制具有良好的預(yù)測(cè)能力[2]。 而對(duì)于環(huán)境污染物的毒性表征,生物組學(xué)方法(如高通量測(cè)序、微陣列和核磁共振)已被廣泛應(yīng)用于確定分子水平上的變化[3]。 通過(guò)研究PAHs 對(duì)斑馬魚(yú)的毒理效應(yīng),可為評(píng)估PAHs 對(duì)水生生物的生態(tài)毒性效應(yīng)提供依據(jù),這為降低水體PAHs 的毒性效應(yīng),減少和治療污染物對(duì)人類健康的損傷提供關(guān)鍵信息。 此綜述系統(tǒng)描述了PAHs 的毒性作用機(jī)制,更為直觀地評(píng)價(jià)了環(huán)境中污染物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn),為進(jìn)一步探究水體有機(jī)污染物對(duì)水生生物及人類健康的影響提供理論依據(jù)。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)于PAHs 污染對(duì)于模式生物的生理毒性研究逐漸增多。 通過(guò)不同途徑將斑馬魚(yú)暴露于PAHs 類污染物中可獲得大量的毒理學(xué)數(shù)據(jù),明晰了此類污染物對(duì)于斑馬魚(yú)脅迫效應(yīng)的具體損傷機(jī)制,這對(duì)于豐富污染物毒性效應(yīng)數(shù)據(jù)、發(fā)展毒理學(xué)應(yīng)用以及對(duì)人類疾病的發(fā)現(xiàn)和治療都有獨(dú)特的意義。 時(shí)至今日,關(guān)于PAHs 暴露對(duì)于斑馬魚(yú)抗氧化防御機(jī)制的文獻(xiàn)已不在少數(shù),但缺少系統(tǒng)性的歸納、分析和解釋。 于此,本文旨在前人研究基礎(chǔ)之上,重點(diǎn)綜述不同種類不同濃度的PAHs 暴露對(duì)于斑馬魚(yú)及其幼魚(yú)和胚胎的毒性效應(yīng)和實(shí)質(zhì)性表征,分析短期和少量長(zhǎng)期作用效果的差異及組織結(jié)構(gòu)的顯著變化等,解釋和闡明PAHs 毒性發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,最后對(duì)該領(lǐng)域研究的必要性和研究前景進(jìn)行闡釋。

1 PAHs 脅迫對(duì)斑馬魚(yú)行為、生長(zhǎng)發(fā)育和組織結(jié)構(gòu)的影響(Effects of PAHs stress on the behavior,growth and tissue structure of zebrafish)

生物的行為反應(yīng)以及致死致畸等效應(yīng)是生物體面對(duì)外界環(huán)境刺激時(shí)體內(nèi)生理變化的外在響應(yīng)[4],斑馬魚(yú)大腦在功能和形態(tài)上與哺乳動(dòng)物的大腦相似,且對(duì)污染物外在反應(yīng)響應(yīng)敏感、迅速,因此經(jīng)常被應(yīng)用于生態(tài)毒理學(xué)的研究中。

1.1 行為學(xué)的影響

受到PAHs 的脅迫后,斑馬魚(yú)的神經(jīng)、代謝和免疫將通過(guò)運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的支配對(duì)應(yīng)激、逆轉(zhuǎn)和位移等行為學(xué)指標(biāo)產(chǎn)生影響。 Mohanty 等[5]研究了 PAHs 對(duì)斑馬魚(yú)行為學(xué)和抗氧化防御機(jī)制的脅迫,最終得知斑馬魚(yú)暴露于水中的苯并[a]芘(B[a]P)后,發(fā)生了趨暗行為的逆轉(zhuǎn),這可能與斑馬魚(yú)腦室周圍灰色區(qū)(PGZ)的神經(jīng)形態(tài)學(xué)改變有關(guān)。 Das 等[6]經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間記錄發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期暴露于B[a]P 中會(huì)顯著損害斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)、活動(dòng)能力,其主要表現(xiàn)為總移動(dòng)距離和速度的減少。 Vignet 等[7]通過(guò)飼喂的手段使斑馬魚(yú)和不同濃度PAHs 組分長(zhǎng)期接觸,發(fā)現(xiàn)暴露組的斑馬魚(yú)相較于對(duì)照組表現(xiàn)出較高的活動(dòng)性、較低的探索活動(dòng)水平和較高的焦慮水平。 除此之外,其他因素也會(huì)影響 PAHs 對(duì)斑馬魚(yú)的毒性表現(xiàn),Aparna 和Patri[8]發(fā)現(xiàn)水體過(guò)度擁擠產(chǎn)生的應(yīng)激效應(yīng)可調(diào)節(jié)B[a]P 誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)行為改變,導(dǎo)致成年斑馬魚(yú)大腦主導(dǎo)學(xué)習(xí)和記憶缺陷的組織出現(xiàn)病理學(xué)改變。

1.2 生長(zhǎng)發(fā)育的影響

PAHs 對(duì)于斑馬魚(yú)的生長(zhǎng)發(fā)育毒性是較為常規(guī)的有機(jī)污染物毒性指標(biāo),斑馬魚(yú)與PAHs 接觸后會(huì)引發(fā)致死效應(yīng)或敏感部位如心血管、消化道和生殖器官等的損傷。 在此主要介紹PAHs 暴露后短期產(chǎn)生的急性毒性效應(yīng)和對(duì)斑馬魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中組織結(jié)構(gòu)的影響。

斑馬魚(yú)暴露于PAHs 中后,產(chǎn)生急性應(yīng)激毒性效應(yīng)是最普遍的表型現(xiàn)象之一,且對(duì)于斑馬魚(yú)的幼魚(yú)和胚胎的病理?yè)p傷作用更為明顯。 為了揭示特征污染物對(duì)斑馬魚(yú)的內(nèi)在毒性作用機(jī)制,一般以生物標(biāo)志物作為指示參數(shù)來(lái)測(cè)定污染物對(duì)斑馬魚(yú)的亞致死或致畸效應(yīng)[9]。 如Alves 等[10]分析了加油站油水分離器排放的廢水中所含的PAHs 對(duì)于斑馬魚(yú)的毒性作用,發(fā)現(xiàn)21.8×10-2mg·L-1萘(Nap)暴露96 h,對(duì)50%的斑馬魚(yú)幼魚(yú)都產(chǎn)生了明顯的有效毒害作用。Perrichon 等[11]將斑馬魚(yú)胚胎及幼魚(yú)暴露于2 種含PAHs 的化石燃油組分(brut 阿拉伯輕質(zhì)燃料油和Erika 重燃料油)中后,發(fā)現(xiàn)暴露于Erika 組分中的斑馬魚(yú)在生命早期階段就產(chǎn)生了高度的應(yīng)激反應(yīng)。 Li等[12]發(fā)現(xiàn)GM-2 分散劑可以增強(qiáng)原油對(duì)斑馬魚(yú)的損傷效應(yīng),這是由于GM-2 分散劑增加了原油對(duì)斑馬魚(yú)的暴露量。 蔡吉榛等[13]為探究近海域沉積物中含氯多環(huán)芳烴(ClPAHs)的生物學(xué)毒性作用,將斑馬魚(yú)胚胎暴露于含有2 種不同濃度PAHs 的湛江水體底泥沉積物提取物中,并且發(fā)現(xiàn)胚胎的致死效應(yīng)和致畸程度與提取物中ClPAHs 濃度呈現(xiàn)正相關(guān)。

還有其他研究表明,光照能夠誘導(dǎo)PAHs 對(duì)斑馬魚(yú)的氧化損傷作用增強(qiáng)。 例如Willis 和Oris[14]研究發(fā)現(xiàn),施加高強(qiáng)度的紫外線(UV)輻射后,水中一定濃度(如蒽(Ant)1 mg·L-1)的 PAHs 對(duì)斑馬魚(yú)毒性顯著增加。 更有文獻(xiàn)表明石油暴露對(duì)斑馬魚(yú)產(chǎn)生毒性的物質(zhì)可能不止 PAHs,González-Doncel 等[15]發(fā)現(xiàn)對(duì)斑馬魚(yú)產(chǎn)生的有效毒性作用與直接的石油暴露有關(guān),且毒性機(jī)制不僅是PAHs 單獨(dú)暴露的作用機(jī)制,這需要進(jìn)一步確定是哪些石油成分引發(fā)了與單獨(dú)PAHs 暴露不同的毒性效果。

自然環(huán)境中的PAHs 不止以原始形態(tài)存在,其易受到其他氧化作用如光化學(xué)氧化和微生物轉(zhuǎn)化等生成酮、酚、酯和羧酸等氧化產(chǎn)物,為此,Diamante等[16]對(duì)暴露于羥基化PAHs 中的斑馬魚(yú)胚胎進(jìn)行觀察,最終發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生的發(fā)育毒性使斑馬魚(yú)存活率顯著下降并觀察到循環(huán)缺陷,同時(shí)血紅蛋白水平下降明顯。

1.3 對(duì)于組織結(jié)構(gòu)的影響

PAHs 暴露一段時(shí)間后由于其持久性和生物蓄積性等固有特性,會(huì)在斑馬魚(yú)的組織中逐漸積聚進(jìn)而產(chǎn)生負(fù)面影響。 當(dāng)暴露的水環(huán)境中含有一定濃度的 PAHs 時(shí),被斑馬魚(yú)吸入、吞食或接觸吸收的PAHs 會(huì)在其組織和器官中不斷蓄積,對(duì)組織產(chǎn)生影響進(jìn)而出現(xiàn)不良反應(yīng)。 Zhai 等[17]的研究表明,斑馬魚(yú)對(duì)PAHs 的吸收主要發(fā)生于頭部和消化道內(nèi),且附著于懸浮顆粒上的PAHs 更容易被斑馬魚(yú)的組織吸收并產(chǎn)生生物富集效應(yīng)。 當(dāng)懸浮顆粒濃度為500 mg·L-1時(shí),斑馬魚(yú)對(duì)芘(Pyr)和氟蒽(Flu)的吸收速率常數(shù)分別增加了 16.4% ~ 109.3% 和 21.8% ~490.4%。 Xie 等[18]將斑馬魚(yú)暴露于 0.1 mg·L-1B[a]P 15 d 后,發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)腸道內(nèi)常見(jiàn)的致病菌如葡萄球菌顯著增多,導(dǎo)致斑馬魚(yú)腸道微生物失調(diào)并引發(fā)炎癥,此外,B[a]P 顯著提高了斑馬魚(yú)白介素il1β的mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平,其中il6、il8、il10和ifnphi1轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。 Vignet 等[19]通過(guò)飼喂使斑馬魚(yú)暴露于PAHs 中,并在個(gè)體、組織和分子水平上分析了生殖性狀的差異性,組織學(xué)分析顯示暴露組斑馬魚(yú)表現(xiàn)出明顯的卵巢發(fā)育成熟缺陷。 Hicken 等[20]使斑馬魚(yú)胚胎直接暴露于含有極低濃度PAHs (∑PAH=2.4×10-2~3.6×10-2mg·L-1)原油中,當(dāng)胚胎短暫暴露時(shí)會(huì)引起亞致死、反應(yīng)延遲等效應(yīng),而胚胎暴露近1 a 后,成年后的斑馬魚(yú)的心臟形狀出現(xiàn)了細(xì)微變化,心血管輸出量減少,游泳能力顯著下降。

綜上所述,PAHs 確實(shí)可以對(duì)魚(yú)類正常的組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生干擾,并通過(guò)不同的成分觸發(fā)不同的途徑,從而產(chǎn)生不同的影響。

2 PAHs 脅迫對(duì)于斑馬魚(yú)生理生化指標(biāo)的影響(Effects of PAHs stress on physiological and biochemical indexes of zebrafish)

當(dāng)水環(huán)境受到各種有毒物質(zhì)污染,尤其是PAHs匯入時(shí),如何在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)、評(píng)估其污染效應(yīng)成為生態(tài)毒理學(xué)研究的重點(diǎn)問(wèn)題之一,模式生物的生理生化毒性效應(yīng)檢測(cè)作為一種優(yōu)良研究手段應(yīng)運(yùn)而生。 PAHs 對(duì)斑馬魚(yú)產(chǎn)生脅迫效應(yīng)時(shí),生物本身會(huì)通過(guò)反饋調(diào)節(jié)相關(guān)酶的活性,進(jìn)而調(diào)節(jié)代謝速率;或通過(guò)激素調(diào)節(jié)影響生物的脂質(zhì)代謝過(guò)程,因此酶活性和脂質(zhì)代謝的改變往往作為研究脅迫效應(yīng)的基礎(chǔ)指標(biāo)。

2.1 代謝酶和抗氧化酶活性的改變

自然環(huán)境中的PAHs 常以復(fù)雜混合物的形式出現(xiàn),一些混合物已被證明在斑馬魚(yú)及其胚胎中有擾亂代謝的作用,導(dǎo)致其體內(nèi)的代謝酶活性變差而引起協(xié)同發(fā)育毒性。 Wang 等[21]發(fā)現(xiàn)成年斑馬魚(yú)體內(nèi)PAHs 濃度與代謝酶活性存在相互作用關(guān)系。 隨著PAHs 濃度的增加,細(xì)胞色素P450(CYPs)和總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性開(kāi)始升高,當(dāng)PAHs 濃度達(dá)到峰值時(shí),活性下降到最低狀態(tài)。 Timme-Laragy等[22]發(fā)現(xiàn)在斑馬魚(yú)模型中,含PAHs 的復(fù)雜混合物的毒性是由芳香烴受體2(AHR2)介導(dǎo)的,并通過(guò)抑制cyp1a 酶活性而增強(qiáng)毒性效應(yīng),cyp1a基因表達(dá)被抑制后會(huì)改變斑馬魚(yú)的正常代謝,進(jìn)而對(duì)斑馬魚(yú)的生存和發(fā)育過(guò)程產(chǎn)生影響。 Wincent 等[23]的研究結(jié)果表明,含氧多環(huán)芳烴(oxy-PAHs)混合物作為一種強(qiáng)有力的Ahr 激活劑,可以誘導(dǎo)斑馬魚(yú)體內(nèi)的谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)活性改變,同時(shí)表現(xiàn)出顯著的發(fā)育毒性。 Kim 等[24]將斑馬魚(yú)幼魚(yú)暴露于一定濃度(2.5×104mg·L-1)的伊朗重質(zhì)原油含水餾分(WAFs)中5 d,發(fā)現(xiàn)其甲狀腺內(nèi)過(guò)氧化氫酶活性水平顯著下降,甚至破壞了斑馬魚(yú)幼魚(yú)的甲狀腺功能。 除此之外仍有少量聯(lián)合毒性的研究,如譚敏卿[25]首次研究了菲(PHE)與高氯酸鈉對(duì)斑馬魚(yú)的聯(lián)合毒性效應(yīng),發(fā)現(xiàn)2 種物質(zhì)均導(dǎo)致斑馬魚(yú)胚胎的畸形率、死亡率升高,心率和孵化率降低且對(duì)SOD 的影響為先抑制后誘導(dǎo),并得出PHE 與高氯酸鈉對(duì)斑馬魚(yú)的聯(lián)合毒性作用為拮抗。 此數(shù)據(jù)為二者聯(lián)合毒性研究提供重要依據(jù)。

所以當(dāng)外界環(huán)境中的PAHs 對(duì)斑馬魚(yú)產(chǎn)生脅迫效應(yīng)時(shí),其體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的自由基,進(jìn)而刺激自身抗氧化防御機(jī)制酶發(fā)揮作用,對(duì)機(jī)體進(jìn)行保護(hù)。 據(jù)上述可知,斑馬魚(yú)體內(nèi)代謝酶活性的改變是抵御PAHs 毒性作用的重要表征。

2.2 對(duì)脂質(zhì)代謝的影響

暴露于PAHs 時(shí),斑馬魚(yú)的肝臟炎癥總是伴隨著脂質(zhì)氧化,PHE 是一種典型的PAHs,會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)脂質(zhì)代謝紊亂。 如 Mai 等[26]將斑馬魚(yú)暴露于PHE(0.3 mg·L-1)中 15 d,GO 富集分析表明 PHE 誘導(dǎo)了脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體活性、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)變化,引起脂肪消化吸收通路富集,導(dǎo)致肝臟細(xì)胞肥大、血液積聚、白細(xì)胞增多及巨噬細(xì)胞數(shù)量增加。

斑馬魚(yú)作為僅次于小鼠的一種優(yōu)秀的體內(nèi)模型在當(dāng)下研究中應(yīng)用甚廣,但體外模型的建立仍有很大的研究空間。 Ning 等[27]首次利用體外模型評(píng)估了PAHs 類對(duì)脂質(zhì)代謝的作用,結(jié)果表明,5 種硝基多環(huán)芳烴(NPAHs)暴露組中有4 種組分表現(xiàn)出明顯的靶向雌激素受體α(ERα)激動(dòng)活性,并誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞分泌 17β-雌二醇(E2)。 由此證明 NPAHs 通過(guò)ERα信號(hào)通路誘導(dǎo)潛在的脂質(zhì)毒性。

這些研究為持久性有機(jī)污染物誘導(dǎo)的功能蛋白酶和脂質(zhì)代謝干擾作用提供了新的視角,并為更好地理解PAHs 的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)提供了思路。

3 PAHs 對(duì)斑馬魚(yú)脅迫效應(yīng)分子機(jī)制的研究進(jìn)展(Research progress on molecular mechanism of PAHs stress effect on zebrafish)

分子機(jī)制是指生物機(jī)體結(jié)構(gòu)組成部分的相互關(guān)系,以及其間發(fā)生的各種變化過(guò)程的物理、化學(xué)性質(zhì)和相互關(guān)系[28]。 在實(shí)驗(yàn)室條件下,可利用分子、細(xì)胞生物學(xué)等研究手段闡明脅迫毒性發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,篩選出生物標(biāo)志物,確定污染物致癌致畸效應(yīng)干預(yù)的靶點(diǎn),于此可對(duì)機(jī)體損傷修復(fù)提供分子依據(jù)。評(píng)估環(huán)境污染物對(duì)于斑馬魚(yú)的毒性效應(yīng)時(shí)采用全基因組的差異表達(dá)基因分析,其數(shù)據(jù)可以很好地闡明暴露的毒性效應(yīng)及其相關(guān)的機(jī)制[29]。

3.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)

與環(huán)境相關(guān)的PAHs 對(duì)斑馬魚(yú)脅迫效應(yīng)的研究不僅需要聚焦于其致癌作用,更需要了解其引起的發(fā)育毒性作用的細(xì)胞分子機(jī)制。 比如在脊椎魚(yú)類動(dòng)物細(xì)胞中,PAHs 多集中在脂滴中,可觸發(fā)生物轉(zhuǎn)化、氧化應(yīng)激和炎癥等基因的上調(diào)。

研究基因分子的差異化多采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)(qPCR)。 如 Bui 等[30]使吸附于納米煙塵顆粒上的PAHs 與斑馬魚(yú)直接接觸8 d 以上,應(yīng)用高通量測(cè)序和qPCR 得出與生物轉(zhuǎn)化、氧化應(yīng)激和谷胱甘肽相關(guān)的代謝通路的調(diào)控基因如Hmox1和Nqo1上調(diào),熒光分析的結(jié)果表明PAHs 主要積累于斑馬魚(yú)的脂質(zhì)細(xì)胞中并導(dǎo)致其胚胎發(fā)育異常。 Shankar等[31]將斑馬魚(yú)暴露在16 種常見(jiàn)PAHs 中,結(jié)合發(fā)育毒性表型終點(diǎn)和全基因組轉(zhuǎn)錄組學(xué)對(duì)脅迫48 hpf斑馬魚(yú)胚胎的16 種PAHs 進(jìn)行毒性分類,確定mRNA 表達(dá)水平的下游變化,發(fā)現(xiàn)暴露組cyp1a轉(zhuǎn)錄水平顯著升高并主要激活了Ahr2,這會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)尾鰭發(fā)育畸形而進(jìn)一步阻礙其運(yùn)動(dòng)行為。 Garcia等[32]也證明了這種由PAHs 暴露引起的基因差異性表達(dá),發(fā)現(xiàn)在PAHs 暴露組的斑馬魚(yú)中,可調(diào)節(jié)軟骨發(fā)育的slincR基因被sox9b5’UTR 抑制轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致斑馬魚(yú)體外出血,并發(fā)現(xiàn)slincR基因出現(xiàn)上調(diào),而導(dǎo)致斑馬魚(yú)軟骨發(fā)育異常繼而出現(xiàn)顱面畸形。 這些研究都表明PAHs 的毒性作用機(jī)制是觸發(fā)應(yīng)激基因表達(dá)差異。

差異基因的凸顯可能會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致各種胚胎發(fā)育缺陷。 McIntyre 等[33]發(fā)現(xiàn)含PAHs 濃度相對(duì)較高(9×10-3mg·L-1和1.6×10-3mg·L-1)的雨水會(huì)驅(qū)動(dòng)斑馬魚(yú)胚胎的心環(huán)缺陷和心房反流,這些可見(jiàn)缺陷的嚴(yán)重程度與解毒酶cyp1a的表達(dá)以及與心臟收縮功能缺陷通路相關(guān)的基因(nppb＞myl6＞myl7)相對(duì)應(yīng),斑馬魚(yú)心臟發(fā)育異常以及小眼、孵化延遲和魚(yú)鰾的異常膨脹等表型可以證明魚(yú)類生命早期階段對(duì)PAHs 的毒性影響非常敏感。 Fang 等[34]也同樣使用了qPCR 技術(shù)進(jìn)行脅迫效應(yīng)分析,將斑馬魚(yú)幼魚(yú)和胚胎暴露于含B[a]P 的水環(huán)境3.3 hpf 時(shí),B[a]P 激活了包括機(jī)體死亡、生長(zhǎng)衰竭、先天性心臟病、出血和頭部形態(tài)異常等發(fā)育途徑,產(chǎn)生顯著性差異的基因如als2a、cep70和mycbp2主要富集于細(xì)胞形態(tài)控制和染色體凝聚通路中,以上基因表達(dá)使斑馬魚(yú)幼魚(yú)呈現(xiàn)出死亡率增加、孵化延遲、心臟水腫和頭部形態(tài)發(fā)育異常。 所以實(shí)驗(yàn)期間斑馬魚(yú)在基因、轉(zhuǎn)錄變異和外顯子水平上發(fā)生了顯著的轉(zhuǎn)錄組變化,且這些變化可能導(dǎo)致長(zhǎng)期不利的生理后果,而探究PAHs 對(duì)于斑馬魚(yú)的長(zhǎng)期作用效果的相關(guān)研究還有待完善。

還有一些研究也進(jìn)一步證實(shí)了PAHs 的暴露會(huì)引起表觀遺傳的改變。 由于pdx-1β是細(xì)胞分化至關(guān)重要的啟動(dòng)子,Yun 等[35]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和qPCR對(duì)低濃度9 芴酮(9-FLO)暴露后24 hpf 時(shí)斑馬魚(yú)胚胎中pdx-1啟動(dòng)子區(qū)8個(gè)CpG 位點(diǎn)的甲基化水平進(jìn)行了評(píng)估,發(fā)現(xiàn)在斑馬魚(yú)胚胎時(shí)期低濃度oxy-PAHs 的暴露會(huì)使pdx-1啟動(dòng)子區(qū)域的DNA 甲基化程度增加,因此得出9-FLO 毒性作用是通過(guò)調(diào)控DNA 甲基化、增加葡萄糖水平和降低心率來(lái)破壞胰腺器官的發(fā)育。

總的來(lái)說(shuō),在任何污染物引發(fā)的魚(yú)類發(fā)育與生殖健康的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中,采用分子的方法更有利于幫助研究人員研究脅迫相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控因子,從而提高研究效率。

3.2 代謝組學(xué)

環(huán)境代謝組學(xué)是一種相對(duì)較新的分子技術(shù),可用于評(píng)估化學(xué)暴露的生物后果。 代謝物模式的變化可用于表征由化學(xué)物質(zhì)引起的毒性反應(yīng),代謝組學(xué)分析可以是有針對(duì)性的,對(duì)已知的代謝物進(jìn)行定量,也可以是無(wú)針對(duì)性的,對(duì)所有已知和未知的代謝物進(jìn)行綜合分析。 如 Elie 等[36]采用了一種非靶向代謝組學(xué)方法來(lái)檢測(cè)斑馬魚(yú)(Danio rerio)的體內(nèi)代謝譜,將斑馬魚(yú)暴露于苯并[a]蒽(BAA)和苯并[a]蒽-7,12-二酮(BAQ)中,通過(guò)多因素、單因素和通路富集分析并基于KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)路徑研究斑馬魚(yú)代謝物的變化,發(fā)現(xiàn)BAA 和BAQ 暴露主要會(huì)擾動(dòng)氨基酸代謝,差異代謝物富集在:谷胱甘肽代謝,甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝,半胱氨酸和蛋氨酸代謝,初級(jí)新陳代謝,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代謝以及氨酰生物合成等通路中。 以上代謝通路改變會(huì)引起DNA氧化損傷、誘導(dǎo)心臟功能發(fā)育和血管供氧障礙。

也有一些研究同樣證明了PAHs 會(huì)對(duì)斑馬魚(yú)代謝產(chǎn)生干擾作用。 如 Sogbanmu 等[37]將 Nap、PHE、Pyr 和B[a]P 等PAHs 的單獨(dú)暴露效果進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)PHE 對(duì)斑馬魚(yú)代謝具有顯著的有害影響,并在處理后72 hpf 出現(xiàn)了高水平的致畸效應(yīng),如組織水腫增加、出血和發(fā)育異常等。 Fujita 等[38]將含有PAHs的稀釋瀝青的沉積物衍生水溶性組分(SDWSF)對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行暴露,并利用代謝組學(xué)研究SDWSF 的胚胎毒性機(jī)制,使用單變量和多變量分析統(tǒng)計(jì)出9個(gè)代謝產(chǎn)物,其中有5 種是標(biāo)準(zhǔn)氨基酸,即丙氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸、蘇氨酸和酪氨酸,其他4 種分別是甜菜堿、?；撬帷⒓≤蘸透视?在100% SDWSF 處理下,這些代謝產(chǎn)物的豐度均發(fā)生了顯著變化,由此可見(jiàn)含PAHs 的混合物會(huì)對(duì)斑馬魚(yú)代謝通路產(chǎn)生影響,繼而引發(fā)死亡、心包水腫和卵黃囊水腫等毒性效應(yīng)。 在斑馬魚(yú)的受試組織肝臟中細(xì)胞分子的損傷程度一般可以通過(guò)測(cè)定DNA 的甲基化程度來(lái)實(shí)現(xiàn)。陳宏姍等[39]將斑馬魚(yú)雌魚(yú)和胚胎暴露于Nap,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明Nap 有明顯的發(fā)育毒性并出現(xiàn)濃度依賴性,甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(MSAP)方式檢測(cè)得出DNA 甲基化程度在肝臟中的嚴(yán)重性明顯高于肌肉組織,且肝臟中低濃度(8.4×10-5mg·L-1)和高濃度(8.4×10-1mg·L-1)組的基因組總甲基化水平分別比對(duì)照組高出了12.88%和8.16%,可見(jiàn)PAHs 可通過(guò)擾亂斑馬魚(yú)物質(zhì)代謝使DNA 甲基化,從而造成中樞神經(jīng)、肝臟和腦發(fā)育異常。

以上多采用無(wú)針對(duì)性代謝物分析,這種方法可以用圖形描述模式的任何顯著差異,這使獲得有關(guān)毒性機(jī)制、途徑和暴露生物標(biāo)記物的信息成為可能。

4 斑馬魚(yú)在生態(tài)毒理學(xué)中應(yīng)用的必要性及研究展望(The necessity and research prospect of zebrafish’s application in ecotoxicology)

人類對(duì)環(huán)境的污染負(fù)荷已經(jīng)對(duì)生物構(gòu)成了嚴(yán)重威脅,研究污染物對(duì)生物的具體毒性作用機(jī)制以及修復(fù)機(jī)理刻不容緩。 已有大量報(bào)道表明,暴露于環(huán)境毒物如PAHs 中時(shí),很可能會(huì)引起生物個(gè)體抗氧化防御系統(tǒng)的病理性改變。 由于人類壽命長(zhǎng)且后代數(shù)量相對(duì)較少,因此很難直接了解PAHs 暴露的潛在和世代相傳的影響,而斑馬魚(yú)作為一個(gè)標(biāo)志性的模型生物,具有培養(yǎng)簡(jiǎn)單、毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)多樣化等典型特點(diǎn),其胚胎和幼魚(yú)可作為高通量分子篩選的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ缴?既彌補(bǔ)了細(xì)胞模型的單一性,又彌補(bǔ)了嚙齒動(dòng)物模型的受試時(shí)間長(zhǎng)、養(yǎng)殖周期長(zhǎng)等不足,并且被廣泛應(yīng)用于環(huán)境污染物的毒性效應(yīng)研究,特別是環(huán)境中持久性有機(jī)污染物毒性作用評(píng)估。 斑馬魚(yú)作為近10年來(lái)研究生態(tài)毒理機(jī)制的理想體內(nèi)模型生物,先前的研究表明,斑馬魚(yú)與人類基因組有70% ~80% 的同源序列[40],二者的乙酰膽堿酯酶(AchE)也有62%的相似氨基酸序列[41]。 斑馬魚(yú)也表現(xiàn)出與人類一樣的抗氧化保護(hù)系統(tǒng),以對(duì)抗環(huán)境中的有毒物質(zhì)[42]。 由于一些PAHs 與身體組織的親脂性親和力,某些PAHs 與氧化應(yīng)激之間的相互聯(lián)系代謝是斑馬魚(yú)多種病理過(guò)程中的決定性調(diào)節(jié)因子之一。 PAHs 不僅在斑馬魚(yú)的胚胎中具有發(fā)育毒性,而且還影響其心臟的發(fā)育和相關(guān)基因的表達(dá)。PAHs 細(xì)胞代謝產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物通過(guò)改變斑馬魚(yú)的抗氧化防御狀態(tài),破壞其細(xì)胞膜脂質(zhì)和細(xì)胞蛋白。 因此掌握PAHs 對(duì)斑馬魚(yú)的毒性作用機(jī)制和斑馬魚(yú)體內(nèi)研究的優(yōu)勢(shì)性可進(jìn)一步減弱PAHs 及其新合成物或化合物的商業(yè)使用對(duì)人體健康造成的潛在危害。

通過(guò)本文的歸納分析可以看出,斑馬魚(yú)暴露于PAHs 時(shí),具體表現(xiàn)如下。(1)其運(yùn)動(dòng)能力會(huì)被明顯抑制,其效應(yīng)在短時(shí)間低劑量時(shí)主要表現(xiàn)在游泳速度加快、轉(zhuǎn)體頻繁、活動(dòng)范圍變化、焦慮性增強(qiáng)等;隨著暴露時(shí)間的增長(zhǎng)或污染物濃度提高會(huì)表現(xiàn)出明顯的抑制作用。(2)斑馬魚(yú)亞致死和致畸效應(yīng)及正常組織結(jié)構(gòu)的改變與PAHs 濃度響應(yīng)呈正相關(guān)的趨勢(shì)。(3)PAHs 使體內(nèi)活性氧自由基濃度升高,通過(guò)激活體內(nèi)防御機(jī)制產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)、器官炎癥反應(yīng)、器官功能蛋白和脂質(zhì)代謝的紊亂,這往往會(huì)破壞其正常的機(jī)體功能而產(chǎn)生不可逆后果。(4)通過(guò)芳香烴受體介導(dǎo)途徑,刺激下游包含氧化應(yīng)激在內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄水平顯著升高,并誘導(dǎo)不同代謝通路基因表達(dá)或者改變代謝產(chǎn)物。

各界學(xué)者已在PAHs 對(duì)斑馬魚(yú)毒性脅迫效應(yīng)的研究中取得了顯著成果,但現(xiàn)階段對(duì)于斑馬魚(yú)的毒性暴露研究多集中在單個(gè)遺傳品系的響應(yīng)機(jī)制,許多野生型品系和數(shù)千個(gè)突變品系的響應(yīng)機(jī)制研究較少;研究技術(shù)多集中在高通量分析[43]、行為跟蹤[44]和質(zhì)譜分析[45]等,而PAHs 暴露后預(yù)測(cè)斑馬魚(yú)靶向基因或者直接將基因型與化學(xué)暴露改變的表型聯(lián)系起來(lái)的前沿技術(shù)報(bào)道較少;轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中有關(guān)PAHs暴露對(duì)斑馬魚(yú)差異基因遺傳的跨代效應(yīng)以及它們對(duì)新生代發(fā)育的影響機(jī)制數(shù)據(jù)較少。 綜上,對(duì)未來(lái)PAHs 對(duì)于斑馬魚(yú)的脅迫效應(yīng)研究提供以下3個(gè)參考方向:斑馬魚(yú)的品系、暴露條件、生物利用度或PAHs 附著載體的改變可能會(huì)影響毒性效應(yīng)強(qiáng)度,記錄多品系野生斑馬魚(yú)暴露結(jié)果或有針對(duì)性地選擇暴露方式更貼近于實(shí)際污染環(huán)境,更有助于進(jìn)一步分析PAHs 對(duì)斑馬魚(yú)種群的短期和長(zhǎng)期影響;毒理學(xué)研究的主要目標(biāo)是能夠在短時(shí)間內(nèi)篩查許多化合物,并能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)其對(duì)人類的毒性,新技術(shù)和平臺(tái)的開(kāi)發(fā)對(duì)于識(shí)別目標(biāo)器官并生成關(guān)于化學(xué)作用機(jī)理的假設(shè)非常重要,如通過(guò)CRISPR-Cas9 基因組修飾技術(shù)[46]預(yù)測(cè)斑馬魚(yú)基因型變化,以將篩選和行為測(cè)試的數(shù)據(jù)與不良結(jié)局途徑框架中的作用與發(fā)生機(jī)制聯(lián)系起來(lái),此外,DNA 納米技術(shù)[47]可使斑馬魚(yú)獲得更精確的基因熒光標(biāo)記,也有廣闊研究前景;分子機(jī)制研究具有更靈敏更經(jīng)濟(jì)、更可轉(zhuǎn)移至斑馬魚(yú)的潛力,為了最好地利用斑馬魚(yú)作為模式生物,了解與人類有關(guān)的PAHs 毒性發(fā)生機(jī)理,需要弄清PAHs 暴露引發(fā)的胚胎差異基因在斑馬魚(yú)親本的起源和本體發(fā)育中的作用信息,使斑馬魚(yú)毒理學(xué)領(lǐng)域朝著脊椎動(dòng)物毒理學(xué)領(lǐng)域的最新水平發(fā)展。