基于色澤量化與UPLC指紋圖譜的不同產(chǎn)地荊芥藥材質(zhì)量評價△

王壽富，田甜，謝明晏，崔婷，姚曉璇，程鈺潔，魏梅，孫冬梅

廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244

荊芥最早以“假蘇”為別名記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，被列為中品，其藥用部位為唇形科植物荊芥Schizonepeta tenuifoliaBriq.的干燥地上部分。荊芥采收季節(jié)為夏、秋二季，花開到頂、穗綠時割取地上部分，除去雜質(zhì)，曬干。荊芥屬臨床上常用的解表類中藥，其味辛，性微溫，具有解表散風、透疹、消瘡的功效，主要用于感冒、頭痛、麻疹、風疹、瘡瘍初起等表證[2]。荊芥的種植產(chǎn)地眾多，早期品種包括江蘇產(chǎn)的“蘇荊芥”、浙江產(chǎn)“浙荊芥”、河北產(chǎn)“祁荊芥”，隨著栽培技術(shù)的進步，現(xiàn)今在全國各地區(qū)均有種植，主要包括安徽、河北、浙江、河南等地區(qū)[3]。

顏色是中藥材及中藥飲片鑒別和質(zhì)量評價的常用指標之一，《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版對荊芥的性狀描述為“莖呈方柱形，表面呈淡黃綠色或淡紫紅色，斷面呈類白色。葉呈黃綠色，多已脫落?；ü邳S綠色或淡棕色。小堅果外表呈棕黑色”[2]。藥材性狀中植株表面顏色和花冠顏色跨度較大，考慮藥材產(chǎn)地分布較多，推測是由于不同產(chǎn)地藥材差異較大，導致荊芥藥材質(zhì)量難以控制。

近年來，色澤量化原理被廣泛應(yīng)用于中藥材及飲片顏色測定中，為中藥材和飲片的質(zhì)量評價提供技術(shù)支持和參考[4-5]，但關(guān)于荊芥藥材質(zhì)量與色度值的相關(guān)性研究未見國內(nèi)外文獻報道。本研究采用超高效液相色譜法（UPLC）測定不同產(chǎn)地荊芥藥材的指紋圖譜，采用分光測色儀測定藥材粉末顏色，同時測定醇溶性浸出物、水溶性浸出物及指標成分含量，運用SPSS 26.0 軟件分析粉末顏色與各項測定指標的相關(guān)性，運用聚類分析、正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）、熵權(quán)TOPSIS 法對不同產(chǎn)地荊芥藥材進行質(zhì)量評價研究，以期為荊芥藥材的產(chǎn)地優(yōu)化、質(zhì)量評價提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

TS7700 型分光測色儀（深圳市三恩時科技有限公司）；H-Class 型液相色譜儀（沃特世儀器公司）；ME204E 型萬分之一天平、XP26 型百萬分之一天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-700DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DHG-9147A 型電熱恒溫干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；Milli-Q-Direct 超純水系統(tǒng)（默克股份有限公司）。

1.2 試藥

對照品迷迭香酸（批號：111871-201706，純度：90.5%）、橙皮苷（批號：110721-201818，純度：96.2%）、胡薄荷酮（批號：111706-201907，純度：99.8%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇（分析純，西隴科學股份有限公司）；乙醇（分析純，天津富宇精細化工有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，默克股份有限公司）；磷酸（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；水為超純水（實驗室自制）。

13 批荊芥藥材經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師、魏梅主任藥師鑒定，均為唇形科植物荊芥Schizonepeta tenuifolia Briq.的干燥地上部分。安徽省亳州市產(chǎn)樣品編號為S1～S3，河北省安國市產(chǎn)樣品編號為S4～S6，浙江省蕭山市產(chǎn)樣品編號為S7～S10，河南省周口市產(chǎn)樣品編號為S11～S13。樣品均為10 月份花開到頂、穗綠時采割，藥材的葉、花冠均多已脫落。

2 方法與結(jié)果

2.1 水溶性浸出物、醇溶性浸出物測定

按照《中國藥典》2020 年版（四部）浸出物測定法（通則2201）項下的熱浸法規(guī)定[6]，分別以水、70%乙醇作溶媒，測定不同產(chǎn)地的荊芥藥材水溶性浸出物、醇溶性浸出物含量，結(jié)果見表1～2。結(jié)果表明，水溶性浸出物、醇溶性浸出物值最高的樣品分別為S5、S6；產(chǎn)自河北安國的樣品水溶性浸出物均值、醇溶性浸出物均值最高，質(zhì)量較為穩(wěn)定。

表1 荊芥藥材水溶性浸出物質(zhì)量分數(shù)

表2 荊芥藥材醇溶性浸出物質(zhì)量分數(shù)

2.2 指紋圖譜的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Waters CORTECS UPLC T3 柱（150 mm×2.1 mm，1.6 μm）；以乙腈為流動相A，0.1%磷酸水溶液為流動相B，梯度洗脫（0～6 min，10%A；6～11 min，10%～13%A；11～14 min，13%～15%A；14～27 min，15%～20%A；27～46 min，20%～30%A；46～56 min，30%～50%A；56～66 min，50%～60%A）；檢測波長為235 nm；柱溫為30 ℃；流速為0.30 mL·min–1；進樣體積為2μL。

2.2.2 單一對照品溶液的制備 分別取對照品橙皮苷、迷迭香酸、胡薄荷酮適量，精密稱定，加甲醇制成分別含橙皮苷346.815 μg·mL–1、迷迭香酸245.725 μg·mL–1、胡薄荷酮148.078 μg·mL–1的單一對照品母液，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備 取荊芥藥材粉末（過二號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液（S1），按2.2.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次，以橙皮苷為參照峰，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果表明各色譜峰的相對保留時間RSD 均小于0.5%，相對峰面積RSD 均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗 按2.2.3 項下方法平行制備同一供試品溶液（S1）6份，按2.2.1項下色譜條件測定，以橙皮苷為參照峰，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果表明各色譜峰的相對保留時間RSD 均小于1.0%，相對峰面積RSD 均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液（S1），按2.2.1 項下色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣測定，以橙皮苷為參照峰，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果表明各色譜峰的相對保留時間RSD 均小于1.0%，相對峰面積RSD 均小于3.5%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 指紋圖譜的建立 取不同產(chǎn)地的荊芥藥材（S1～S13），按2.2.3 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進行測定，記錄各批次荊芥藥材的色譜圖。運用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012A 版），將13 批荊芥色譜圖導入評價系統(tǒng)，以荊芥藥材（S1）色譜圖為參照，時間窗寬度設(shè)為0.1 min，采用多點校正法進行Mark 峰匹配，選擇中位數(shù)法生成相應(yīng)對照指紋圖譜R，建立荊芥藥材的UPLC 指紋圖譜。13 批荊芥藥材共標定21 個共有峰，通過與對照品比對，確定9 號峰為橙皮苷、10 號峰為迷迭香酸、17 號峰為胡薄荷酮。13 批荊芥藥材的UPLC 疊加指紋圖譜、對照指紋圖譜R、單一對照品溶液色譜圖見圖1。

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圖1 荊芥UPLC疊加指紋圖譜、對照指紋圖譜R和單一對照品溶液色譜圖

2.2.8 相似度評價 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012A 版）分析軟件，以荊芥藥材對照圖譜R 為參照，對不同產(chǎn)地的荊芥藥材樣品進行相似度一致性評價。結(jié)果顯示，13 批荊芥藥材（S1～S13）指紋圖譜相似度依次為0.984、0.944、0.992、0.977、0.988、0.964、0.942、0.908、0.908、0.960、0.992、0.984、0.994，相似度均在0.9 以上，表明各批荊芥藥材指紋圖譜與對照圖譜相似度較高。

2.3 含量測定

2.3.1 標準曲線制備 分別精密吸取2.2.2 項下單一對照品母液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，置于25 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得到系列混合對照品溶液。分別吸取上述混合對照品溶液適量，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，以各成分的質(zhì)量濃度為橫坐標（X），以各成分對應(yīng)的峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得到橙皮苷、迷迭香酸、胡薄荷酮的線性回歸方程分別為Y=11 100.0X–1 958.9、Y=4 866.8X–2 375.7、Y=15 794.0X–57 036.0，r分別為0.998 4、0.999 0、0.999 8，表明橙皮苷、迷迭香酸、胡薄荷酮質(zhì)量濃度分別在6.936 3～110.980 8、4.914 5～78.632 0、2.961 6～47.385 0μg·mL–1與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度試驗 精密吸取2.3.1 項下混合對照品溶液（橙皮苷質(zhì)量濃度為55.490 4 μg·mL–1、迷迭香酸質(zhì)量濃度為39.316 0 μg·mL–1、胡薄荷酮質(zhì)量濃度為23.692 5μg·mL–1），按2.2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄各成分的色譜峰面積。結(jié)果表明，橙皮苷、迷迭香酸、胡薄荷酮峰面積RSD分別為0.77%、0.89%、2.40%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液（S1），按2.2.1 項下色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣測定，記錄各成分的色譜峰面積。結(jié)果表明，橙皮苷、迷迭香酸、胡薄荷酮峰面積RSD分別為0.94%、0.70%、3.20%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗 按2.2.3 項下方法平行制備同一供試品溶液（S1）6份，按2.2.1項下色譜條件進行測定，記錄各成分的色譜峰面積并計算質(zhì)量分數(shù)。結(jié)果表明，橙皮苷、迷迭香酸、胡薄荷酮質(zhì)量分數(shù)的RSD 分別為0.54%、0.87%、0.96%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.3.5 加樣回收率試驗 稱取已知含量的荊芥藥材粉末（S1）9份，每份0.25 g，精密稱定，按對照品加入量與供試品中待測定成分含量之比0.5∶1.0、1.0∶1.0、1.5∶1.0 的原則，精密加入橙皮苷、迷迭香酸、胡薄荷酮對照品，按2.2.3 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，計算得到橙皮苷、迷迭香酸、胡薄荷酮的加樣回收率和RSD，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，橙皮苷、迷迭香酸、胡薄荷酮含量測定分析方法回收率分別為96.51%～100.51%、96.68%～101.04%、96.52%～100.51%，RSD 分別為1.45%、1.50%、1.45%，符合《中國藥典》2020 年版9101 藥品質(zhì)量標準分析方法驗證指導原則要求。

表3 荊芥藥材中3個成分的加樣回收率試驗結(jié)果

2.3.6 樣品含量測定 取荊芥藥材粉末，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件對荊芥藥材的橙皮苷、迷迭香酸、胡薄荷酮含量（以干燥品計）進行測定，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，橙皮苷含量、胡薄荷酮含量最高的分別為安徽亳州、浙江蕭山產(chǎn)荊芥，河北安國產(chǎn)荊芥藥材的橙皮苷含量RSD、迷迭香酸含量RSD 相對較低，質(zhì)量較穩(wěn)定。

表4 荊芥藥材中指標成分質(zhì)量分數(shù)

2.4 色度值測定

2.4.2 精密度試驗 取同一樣品粉末（S1）適量，按2.4.1項下方法連續(xù)測量6次，記錄色度值，結(jié)果表明L*、a*、b*值的RSD 均小于3.5%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗 取同一樣品粉末（S1），平行測定6 份，記錄色度值，結(jié)果表明L*、a*、b*的RSD均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取同一樣品粉末（S1），按2.4.1 項下方法壓制成薄片，在室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h后，測定色度值。結(jié)果表明，L*、a*、b*的RSD均小于3.0%，表明樣品穩(wěn)定性良好。

2.4.5 樣品色度值測定 取13 批不同產(chǎn)地的荊芥藥材，按2.4.1 項下方法進行色度值測定并計算E，每批樣品平行測定3次，取平均值，結(jié)果見表5。

表5 荊芥藥材色度值

2.5 荊芥藥材數(shù)據(jù)分析

2.5.1 荊芥色度值與各項測定指標的相關(guān)性分析 利用SPSS 26.0 軟件對荊芥藥材浸出物、指標成分含量及色譜峰面積與色度值參數(shù)進行皮爾遜（Pearson）分析，結(jié)果見表6。結(jié)果表明，峰1分別與L*、b*、E值呈高度正相關(guān)，胡薄荷酮含量、峰17分別與L*、b*、E值呈顯著負相關(guān)，橙皮苷含量、峰9分別與b*值呈顯著正相關(guān)；峰3 分別與L*、b*、E值呈顯著正相關(guān)，橙皮苷含量、峰9分別與L*、E值呈顯著正相關(guān)，峰7、18 分別與L*、E值呈顯著負相關(guān)，峰5、11、13、14、16 分別與b*值呈顯著正相關(guān)，表明荊芥藥材中化學成分含量與藥材顏色具有較高的相關(guān)性。此外，水溶性浸出物、醇溶性浸出物含量與色度值相關(guān)性較低，表明從藥材粉末色度值無法辨別浸出物含量的高低。

表6 荊芥藥材色度值與浸出物含量、指標成分含量、色譜峰面積相關(guān)性分析

2.5.2 荊芥藥材色度值聚類分析及質(zhì)量標志物分析 將荊芥藥材的色度值參數(shù)導入SIMCA 14.1軟件進行層次聚類分析（HCA）。由圖2 可知，當相對聚類距離為15 時，13 批樣品可聚為兩類：S6～S10 聚為一類，以浙江蕭山產(chǎn)荊芥為主；S1～S5、S11～S13聚為一類，以安徽亳州、河北安國、河南周口產(chǎn)荊芥為主。

基于色度值的聚類分析結(jié)果，對13 批荊芥藥材的測定指標進行OPLS-DA。模型參數(shù)累積方差貢獻率（R2Y）為0.954，預(yù)測優(yōu)度系數(shù)（Q2）為0.783，均大于0.5，表明此模型為優(yōu)質(zhì)模型。進而對OPLSDA 模型中變量重要性投影（VIP）進行分析，結(jié)果見圖3。對各指標的VIP 值大小進行排序，選擇VIP值>1 的成分變量作為區(qū)分荊芥藥材的質(zhì)量標志物，包括峰17（胡薄荷酮，VIP 值為2.370 8）、9（橙皮苷，VIP 值為2.083 1）、13（VIP 值為2.013 2）、10（迷迭香酸，VIP 值為1.547 7）、11（VIP 值為1.479 2）、12（VIP 值為1.231 8）、14（VIP 值為1.128 6），說明基于色度值聚類分析的結(jié)果，峰9～14、17 對不同產(chǎn)地荊芥藥材的質(zhì)量具有顯著影響，可以作為區(qū)分不同產(chǎn)地荊芥藥材的質(zhì)量標志物。

圖3 荊芥藥材各測定指標OPLS-DA模型VIP分析

2.5.3 不同產(chǎn)地荊芥藥材熵權(quán)TOPSIS 法分析 熵權(quán)TOPSIS法是基于評價指標的信息熵大小，根據(jù)評價對象與理想化目標的接近程度進行順序優(yōu)選的一種多指標決策分析方法[7-9]，該分析方法能客觀評價不同批次荊芥藥材的質(zhì)量。對13 批荊芥藥材的色度值參數(shù)、指標成分含量、浸出物含量及色譜峰峰面積等指標建立初始決策矩陣，根據(jù)公式（2）～（3）將矩陣轉(zhuǎn)化為標準化決策矩陣，計算越大越優(yōu)型指標和越小越優(yōu)型指標（Rij）；按照公式（4）～（5）計算熵值（Ej）和權(quán)重（vj）。根據(jù)公式（6）確定加權(quán)決策矩陣（Z）；根據(jù)公式（7）～（8）計算得出最優(yōu)方案（Z＋）與最劣方案（Z–），再根據(jù)公式（9）計算每個樣品與最優(yōu)方案（Z＋）、最劣方案（Z–）的距離得到最優(yōu)解的歐氏貼近度（Ci），并進行排序，結(jié)果見表7。結(jié)果顯示，排名前5名的是安徽亳州產(chǎn)S1 樣品、河北安國產(chǎn)S4～S6 樣品、浙江蕭山產(chǎn)S10 樣品。根據(jù)13 批樣品的歐式貼近度值（Ci），安徽亳州、河北安國、浙江蕭山、河南周口4個產(chǎn)地荊芥的平均Ci值分別為0.432 3、0.475 0、0.362 0、0.251 3，表明河北安國所產(chǎn)荊芥的質(zhì)量整體高于安徽亳州、浙江蕭山、河南周口產(chǎn)樣品。

表7 荊芥藥材的熵權(quán)TOPSIS分析

式中，i為樣本數(shù)（i=1，2，……，m），j為評價指標（j=1，2，……，n）。

3 討論

隨著中藥材人工種植的推廣，對藥材進行質(zhì)量檢測和控制顯得尤為重要，而顏色作為中藥最直觀的外在特征之一，與中藥質(zhì)量密不可分[10]?！吨袊幍洹?020 年版對荊芥藥材性狀中顏色描述較為寬泛，且藥材產(chǎn)地分布較多，不同產(chǎn)地藥材有差異，難以有效控制荊芥藥材的質(zhì)量。本研究基于CIELAB 色彩空間理論，利用分光測色儀測定荊芥藥材的色度值，以期通過外在表征快速評價藥材質(zhì)量。荊芥藥材表面顏色與內(nèi)部顏色不均一，而粉末具有較好的均一性和穩(wěn)定性，故本研究采用荊芥藥材粉末進行實驗。通過色度值與各指標的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)峰1、3、9、17，胡薄荷酮含量，橙皮苷含量均分別與L*、b*、E值密切相關(guān)；峰7、18 分別與L*、E值密切相關(guān)，峰5、11、13、14、16 分別與b*值密切相關(guān)。由此說明荊芥藥材中的化學成分含量高低與其粉末色度值具有緊密相關(guān)性，測定藥材粉末的色度值可初步預(yù)估其中化學成分的含量高低，為荊芥藥材的質(zhì)量評價提供依據(jù)。此外，水溶性浸出物、醇溶性浸出物含量與色度值相關(guān)性較低，說明從藥材粉末色度值無法預(yù)測浸出物含量的高低。

荊芥在全國大部分地區(qū)均有種植，早期江蘇太倉產(chǎn)“蘇荊芥”、浙江蕭山產(chǎn)“浙荊芥”、河北安國產(chǎn)“祁荊芥”質(zhì)量較優(yōu)，如今隨生態(tài)環(huán)境變化、栽培技術(shù)的發(fā)展，產(chǎn)地成為影響荊芥藥材質(zhì)量的重要因素之一[3]。蘇暢等[11]研究表明，山東、河北、安徽等中部地區(qū)土地肥沃，土壤含水量較高，且揮發(fā)油含量高，是荊芥最適宜的種植區(qū)。本研究以13 批荊芥藥材為研究對象，運用HCA、OPLS-DA對不同產(chǎn)地荊芥藥材進行分析。由色度值的聚類分析結(jié)果可知，浙江蕭山產(chǎn)荊芥聚為一類；安徽亳州、河北安國、河南周口產(chǎn)荊芥聚為一類，表明此3 個產(chǎn)地的藥材顏色性狀較為相似。OPLS-DA 發(fā)現(xiàn)峰17（胡薄荷酮）、9（橙皮苷）、13、10（迷迭香酸）、11、12、14 共7 個成分的VIP 值均大于1，是重要的成分變量，提示此7 個成分可作為不同產(chǎn)地荊芥藥材的質(zhì)量標志物。結(jié)合熵權(quán)TOPSIS 法對13 批荊芥藥材中的色度值參數(shù)、指標成分含量、浸出物及色譜峰峰面積進行綜合質(zhì)量評價，結(jié)果表明河北安國所產(chǎn)荊芥質(zhì)量較佳，同時河北產(chǎn)“祁荊芥”的L*、b*值均較大，由此可以推測L*值越大、b*值越大（即藥材粉末顏色越亮、越黃），荊芥藥材質(zhì)量越好，這與《中華道地藥材》荊芥項下規(guī)定“色淡黃綠色”[12]相呼應(yīng)。

本研究所建立的荊芥藥材的UPLC 指紋圖譜測定方法穩(wěn)定可靠，并通過研究各項測定指標與色度值的相關(guān)性，結(jié)合多種統(tǒng)計分析方法對不同產(chǎn)地的荊芥藥材進行整體質(zhì)量差異研究，可為荊芥藥材的質(zhì)量評價提供參考。