五味子藤莖中木脂素提取純化工藝的優(yōu)化

董培良，許天恩，王蕊嬌，韓華

(黑龍江中醫(yī)藥大學,黑龍江 哈爾濱 150040)

五味子為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實，在我國東北及內蒙古地區(qū)有著豐富的種類和數(shù)量，又稱北五味子。五味子作為一種藥食同源的藥材被廣泛應用，具有收斂固澀、益氣生津、補氣養(yǎng)心之功效[1]。北五味子的干燥藤莖，不僅具有良好的藥用價值，還通常被用作調味劑，其可以通過曬干用來代替花椒作調味劑使用，習稱山花椒藤[2]。為了增加五味子果實的產量，需要對植株進行修剪，數(shù)據(jù)顯示每年被剪掉的藤莖重達2 500噸以上，這些剪掉的藤莖沒有被有效利用，造成了嚴重的資源浪費[3-4]。而五味子藤莖的化學組分與五味子果實具有很高的相似性[5]，主要包含木脂素、萜類[6-7]、多糖、揮發(fā)油[8-9]等?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，五味子中木脂素類成分是五味子主要有效成分，具有抗驚厥、抗?jié)儭⒖寡趸?、保護腦神經細胞，保護肝臟損傷[10-11]、改善記憶障礙[12-13]等多種藥理活性。

目前雖有多篇文獻報道了五味子的提取純化工藝[14]，但對于五味子藤莖的報道并不是很多，五味子在自然培植和野生林木護養(yǎng)過程中大量的藤莖被修剪除掉，造成了極大的藥用植物資源浪費。本實驗對于五味子藤莖中木脂素的提取純化工藝進行優(yōu)化，旨在為尋找五味子果實的替代品，節(jié)約藥用植物資源，也為相關藥物的開發(fā)奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀(美國Agilent公司);RE-2000B旋轉蒸發(fā)儀(瑞德儀器設備有限公司);XPR26DR電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司);SHA-Z恒溫搖床(常州金壇友良儀器有限公司);101A-1E型電熱鼓風干燥箱(上海實驗儀器公司);DA-2A真空干燥箱(鄭州南北實驗儀器公司)。

1.2 試藥

北五味子藤莖于黑龍江省饒河縣采收且經黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院藥用植物教研室樊銳鋒副教授鑒定為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的藤莖。五味子醇甲對照品(7432-28-2)、五味子醇乙對照品(58546-54-6)、五味子酯甲對照品(58546-56-8)、五味子甲素對照品(61281-38-7)、五味子乙素對照品(61281-37-6)、五味子丙素對照品(61301-33-5)均購于成都埃法生物科技有限公司，純度均>98%。甲醇、乙腈為色譜級(美國Fisher公司);純凈水。AB-8、D101、DA201、S-8、HPD100、HPD600、HP-20、X-5型大孔吸附樹脂均購于東鴻化工有限公司。

2 五味子藤莖木脂素提取工藝優(yōu)化

2.1 色譜條件

Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);檢測器DVD;檢測波長為250 nm;柱溫為30 ℃;體積流量1.0 mL/min;流動相條件為乙腈(A)-水(B);0～10 min，A 40%～50%;10～20 min，A 50%～55%;20～30 min，A 55%～70%;30～40 min，A 70%～80%。色譜圖見圖1。

注：A.混合標準品;B.五味子藤莖樣品。1.五味子醇甲;2.五味子醇乙;3.五味子酯甲;4.五味子甲素;5.五味子乙素;6.五味子丙素。圖1 混合標準品和五味子藤莖樣品HPLC色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

分別精確移取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素對照品至容量瓶中，加入甲醇搖勻，超聲溶解，并定容于10 mL的容量瓶中，得到濃度為五味子醇甲(203.6 μg/mL)、五味子醇乙(194.1 μg/mL)、五味子酯甲(204.5 μg/mL)、五味子甲素(197.2 μg/mL)、五味子乙素(206.7 μg/mL)、五味子丙素(202.4 μg/mL)的對照品貯備液，置于冰箱4 ℃避光保存。

2.2.2 供試品溶液的制備

將五味子藤莖粉碎過篩，并稱取2.0 g，置于100 mL圓底燒瓶中。分別按照正交試驗設計下的各條件進行回流提取，提取液通過抽濾得到濾液，將各次濾液合并并旋干濃縮，加甲醇搖勻，超聲溶解并定容到容量瓶中，經0.22 μm的微孔濾膜濾過，得到的濾液即為供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察

分別精密吸取對照品貯備液0.5、1、2、3、4、5 mL，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容搖勻，經0.22 μm微孔濾膜過渡，得到對照品進樣液，按照色譜條件“2.1”進樣測定峰面積，進樣量為10 μL。以單一對照品濃度(X,mg/mL)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，并得到回歸方程如下：五味子醇甲：Y=28 539.1X+8.414 29，R2=0.999 7;五味子醇乙Y=20 293.8X-4.371 43，R2=0.999 8;五味子酯甲Y=26 328.3X-1.871 43，R2=0.999 6;五味子甲素Y=19 840.6X+9.585 71，R2=0.999 7;五味子乙素Y=18 288.3X-1.371 43，R2=0.999 7;五味子丙素Y=22 584.2X-0.585 71，R2=0.999 9。結果表明五味子醇甲在10.18～101.8 μg/mL、五味子醇乙在9.705～97.05 μg/mL、五味子酯甲在10.225～102.25 μg/mL、五味子甲素在9.86～98.6 μg/mL、五味子乙素在10.335～103.35 μg/mL、五味子丙素在10.12～101.2 μg/mL范圍內呈良好線性關系。

2.3.2 精密度試驗

在色譜條件“2.1”下，分別測定五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素對照品溶液的峰面積，進樣量為10 μL，每個對照品分別測定6次。6種木脂素對照品峰面積的相對標準偏差(RSD)分別為1.41%、1.45%、1.41%、1.33%、1.28%、1.26%，結果表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗

在色譜條件“2.1”下多次測定同一供試品溶液，分別在放置0、4、8、12、16、24 h后重復進樣測定，分別測定不同時間點的供試品中6種木脂素的峰面積值，進樣量為10 μL。五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素峰面積的相對標準偏差(RSD)分別為0.56%、0.66%、0.74%、0.72%、0.74%、1.84%。結果表明在24 h內的供試品溶液基本穩(wěn)定。

2.3.4 重復性試驗

取同一批藥材五味子藤莖，粉碎過篩，在圓底燒瓶中進行回流提取，按照供試品溶液制備方法“2.2.2”分別制備供試品溶液6份，在色譜條件“2.1”下分別進樣測定6種木脂素的峰面積值，并計算相對標準偏差(RSD)。五味子醇甲峰面積的RSD為0.19%，五味子醇乙峰面積的RSD為0.27%，五味子酯甲峰面積的RSD為0.15%，五味子甲素峰面積的RSD為0.16%，五味子乙素峰面積的RSD為0.18%，五味子丙素峰面積的RSD為0.37%。結果表明該方法具有良好的重復性。

2.3.5 回收率試驗

稱取同一批次已知含量的五味子藤莖粉末6份，分別加入各對照品，按照“2.2.2”方法制備供試品溶液，在相同的色譜條件下，進樣量10 μL分別測定6種木脂素含量。五味子醇甲的平均回收率為99.61%，RSD為0.85%，五味子醇乙的平均回收率為98.48%，RSD為1.32%，五味子酯甲的平均回收率為98.93%，RSD為1.33%，五味子甲素的平均回收率為100.41%，RSD為1.17%，五味子乙素的平均回收率為98.65%，RSD為1.58%，五味子丙素的平均回收率為98.57%，RSD為1.63%。結果表明該方法準確性較好，可以進行定量分析試驗。

2.4 試驗設計與結果

正交試驗設計表采用L9(34)，影響因素分別為乙醇濃度、提取時間、乙醇倍數(shù)、提取次數(shù)，每個影響因素再選擇3個不同的水平，以五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素6種木脂素的含量之和作為總木脂素的量。通過繪制的標準曲線計算得到總木脂素含量作為各試驗方法的評價指標。因素水平設計見表1。

表1 正交試驗設計表

實驗結果見表2，以6種木脂素的總含量為指標進行方差分析結果見表3，對木脂素提取有影響的主要因素是乙醇濃度(A)，其次是提取次數(shù)(D)，A>D>B>C。所以得出的最佳提取條件為A3B1C1D2，為95%乙醇，使用8倍量，提取2次，每次時間1 h。

表2 正交試驗結果表

表3 方差分析表

2.5 驗證試驗

在得出的最佳提取工藝條件下重復3次試驗，對優(yōu)化后的工藝條件進行驗證。結果總木脂素含量分別為22.45 mg/g、21.86 mg/g、22.73 mg/g。平均提取率為22.35 mg/g。

3 五味子藤莖木脂素純化工藝優(yōu)化

3.1 五味子藤莖木脂素上樣液的制備

將五味子藤莖干燥粉末在上述最佳提取工藝條件下即8倍量95%乙醇提取2次，每次提取1h提取木脂素，過濾提取液，將各次濾液合并濃縮干燥，即為五味子藤莖乙醇浸膏，浸膏加入適量水可以得到五味子藤莖木脂素上樣液。

3.2 大孔吸附樹脂的前處理

分別稱取一定量的S-8、D101、DA201、AB-8、HPD100、HPD600、HP-20、X-5樹脂，先要使樹脂充分溶脹，加入95%的乙醇溶液浸泡24 h，乙醇溶液和樹脂量不低于2∶1。濕法裝柱，繼續(xù)用95%的乙醇沖洗，直到流出液中加水不出現(xiàn)渾濁為止，然后使用蒸餾水繼續(xù)洗滌直至流出液無明顯醇味，將樹脂儲存于蒸餾水中備用。

3.3 大孔吸附樹脂型號的篩選

3.3.1 吸附性能的考察

分別稱取經過前處理后的8種大孔樹脂(S-8、D101、DA201、AB-8、HPD100、HPD600、HP-20、X-5)各2.0 g，用濾紙吸干，將8種樹脂分別置于250 mL可密封的錐形瓶中，加入已測定濃度的木脂素提取液50 mL。將錐形瓶放置于恒溫振蕩搖床中，于25 ℃，100 r/min下振蕩24 h以達到飽和吸附，過濾后回收濾液，測定濾液中6種木脂素總含量，計算吸附量。

3.3.2 解析性能的考察

分別取充分吸附后的大孔樹脂，置于250 mL可密封的錐形瓶中，加入50 mL的蒸餾水在25 ℃，100 r/min下恒溫振蕩2 h，過濾后再加入95%乙醇100 mL，25 ℃下恒溫振蕩24 h(100 r/min)，合并兩次濾液，測定濾液中6種木脂素總含量，計算解析率。結果見表4。

表4 8種類型大孔樹脂對木脂素的吸附量和解吸率

由表4結果可知，雖然S-8型大孔吸附樹脂吸附量最大，但其解析率并不理想。綜合考慮吸附量和解析率兩個條件，AB-8型樹脂對木脂素的吸附性和解析性都較好，所以選擇AB-8型大孔樹脂進行接下來的純化工藝試驗。

3.4 AB-8型大孔吸附樹脂純化工藝考察

3.4.1 上樣液濃度的考察

分別取10.0 g AB-8型大孔樹脂5份，濕法裝入樹脂柱，柱體積約10 mL，將“3.1”中制備的提取液，配置濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的上樣液，每個濃度取總木脂素含量一定的體積，令其緩慢通過樹脂柱進行吸附，流速為1 BV/h，將得到的流出液濃縮后分別測定總木脂素含量，并計算相應吸附量，結果見表5。

表5 上樣液濃度對木脂素吸附量的影響

由表5可知，當上樣液濃度為2.0 mg/mL時，AB-8大孔吸附樹脂對木脂素的吸附能力最大，為16.94 mg/g，所以選擇最佳的上樣液濃度為2.0 mg/mL。

3.4.2 最大上樣量的考察

量取濃度為2.0 mg/mL的上樣液100 mL，以1 BV/h的流速通過10.0 g AB-8大孔樹脂柱吸附木脂素，分批次收集流出液，每10 mL 1次，共收集10次，回收溶劑，測定其中總木脂素含量。繪制流出液體積與流出液中總木脂素濃度的關系見圖2，根據(jù)泄露點(即流出液濃度達到上樣濃度的10%時的上樣液體積用量)確定最大上樣量。

圖2 泄露曲線

由圖2可知，當流出液達到7 BV的時候，其中的總木脂素濃度已經高于上樣液中的總木脂素濃度，為0.275 mg/mL，說明此時木脂素已經開始從樹脂柱中泄露，所以最大上樣量為70 mL。

3.4.3 洗脫劑體積分數(shù)的考察

配制濃度為2.0 mg/mL的上樣液70 mL，以1 BV/h的流速通過10.0 g AB-8大孔樹脂柱吸附木脂素，待完全吸附后，先用5 BV蒸餾水，洗滌除去雜質，然后分別用10 BV的體積分數(shù)分別為45%、55%、65%、75%、85%、95%的乙醇以1 BV/h體積流量連續(xù)洗脫，收集各體積分數(shù)的洗脫液，濃縮后測定各個梯度的洗脫液中總木脂素的含量，計算洗脫率，見表6。

表6 洗脫溶劑體積分數(shù)對解析率的影響

由表6可知，隨著洗脫劑的體積分數(shù)增高洗脫率也不斷增高，95%乙醇作為洗脫溶劑的洗脫率最好，所以選擇95%乙醇作為洗脫劑。

3.4.4 洗脫劑用量的考察

配制濃度為2.0 mg/mL的上樣液70 mL，以1 BV/h的流速通過10.0 g AB-8大孔樹脂柱吸附木脂素，吸附完全后，先用5 BV蒸餾水清洗除去雜質，再用100 mL的95%乙醇以1 BV/h體積流量洗脫，分批次收集流出液，每10 mL一次，共收集10次，分別測定總木脂素含量，繪制洗脫曲線。見圖3。

圖3 洗脫曲線

由圖3可知，當洗脫劑體積達到8 BV時收集得到的洗脫液中的總木脂素含量已經很低，所以選擇洗脫劑用量為80 mL。

3.5 結果

通過對上述各個工藝參數(shù)進行考察，確定五味子藤莖木脂素的最佳純化工藝條件為AB-8型大孔樹脂，上樣液濃度為2.0 mg/mL，最大上樣量為70 mL，洗脫劑體積分數(shù)為95%乙醇，洗脫劑用量為80 mL。

3.6 驗證試驗

按照已經確定的最佳純化工藝進行驗證性試驗，重復做3次，測定洗脫液中的總木脂素含量分別為50.85%、53.61%、53.95%，平均值為52.8%。

4 討論

目前已知藥材五味子的主要藥效活性成分是木脂素類成分，國內關于五味子藤莖的研究較少，本實驗通過對于五味子藤莖中的有效成分木脂素的提取工藝和純化工藝進行優(yōu)化，得到了一個穩(wěn)定可靠、具有重現(xiàn)性且提取率較高的五味子藤莖木脂素提取純化路徑，為日后進行相關工業(yè)生產和完善其藥物開發(fā)流程提供理論基礎。本實驗具有廣闊的應用開發(fā)前景，為充分利用藥用植物資源，尋找新的藥物選擇提供了可能，為將來研發(fā)新藥提供研究基礎。

莫永俊等[15]對于大孔樹脂純化五味子總木脂素的工藝進行了研究，但僅選擇了五味子醇甲作為考察指標，采用紫外分光光度法測定。而五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素也具有較強的藥理活性[16]并且這6種木脂素在五味子木脂素類成分中含量較高[17]。本實驗在此基礎上采用高效液相色譜法測定木脂素，并增加了五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素的測量指標，相對于單一成分作為考察指標，考察范圍更加全面、完善。

本實驗選用6種在五味子藤莖中的含量較高的木質素類成分，將其總含量作為評價指標達到優(yōu)化五味子藤莖種木脂素的提取工藝與純化工藝的目的。但僅從提取物中的木脂素含量作為評價指標尚且不足，為進一步開發(fā)新藥優(yōu)化五味子藤莖中木脂素的提取路徑，應加入藥效學與藥代動力學研究，結合單一木脂素成分的權重比，使結果更加客觀全面。