甲狀腺球蛋白抗體和甲狀腺過氧化物酶抗體在兒童免疫性血小板減少癥中的表達(dá)及臨床意義

王學(xué)梅 海力其古麗·努日丁 劉玉 古麗巴哈·買買提 嚴(yán)媚

（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒內(nèi)一科，新疆烏魯木齊 830054）

免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是以血小板（platelet，PLT）數(shù)量減少、自發(fā)性出血為特征的兒童常見出血性疾病，目前臨床治療以防止嚴(yán)重出血為主要目的，一般預(yù)后良好。但部分ITP患兒病情可發(fā)生遷延，進(jìn)展為慢性ITP，引起重度皮膚黏膜、臟器出血，增加患兒死亡風(fēng)險(xiǎn)［1］。呂明恩等［2］研究中慢性ITP患兒3個月疾病緩解率僅為22.80%，提示慢性ITP患兒預(yù)后較差。因此尋找客觀指標(biāo)評估兒童ITP，并分析ITP臨床分型，對制定合理的治療方案、改善患兒預(yù)后具有重要臨床意義。甲狀腺球蛋白抗體（thyroglobulin antibody，TGAb）是在甲狀腺病理損傷后釋放至血液中，已被證實(shí)在自身免疫性疾病中呈異常表達(dá)［3］。甲狀腺過氧化物酶抗體（thyroid peroxidase antibody，TPOAb）是自身免疫性甲狀腺疾病診斷、評估預(yù)后的重要指標(biāo)，是機(jī)體免疫系統(tǒng)受到刺激后產(chǎn)生，Gallo等［4］已證實(shí)TPOAb與機(jī)體免疫功能密切相關(guān)。且研究指出，ITP的發(fā)生、進(jìn)展與機(jī)體免疫機(jī)制密切相關(guān)［5］。結(jié)合TGAb、TPOAb的作用與ITP的發(fā)病機(jī)制，初步推測二者可能與兒童ITP發(fā)病及臨床分型有關(guān)。鑒于此，本研究探討TGAb、TPOAb在兒童ITP中的表達(dá)及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

前瞻性選擇2019年10月至2021年10月我院收治的120例ITP患兒作為ITP組，另選擇60例非ITP患兒作為非ITP組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）ITP組：①ITP符合《兒童原發(fā)性免疫性血小板減少癥診療規(guī)范（2019年版）》［6］中相關(guān)診斷，血常規(guī)檢查至少2次提示PLT計(jì)數(shù)＜100×109/L，表現(xiàn)為皮膚黏膜出血、臟器出血等。②參照上述診療規(guī)范［6］判定ITP患兒臨床分型，包括新診斷ITP：病程＜3個月；持續(xù)性ITP：3個月≤病程≤12個月；慢性ITP：病程＞12個月。（2）非ITP組：非ITP組患兒為非ITP，如感染、藥物等引起的PLT減少，血栓性PLT減少等。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并原發(fā)性、繼發(fā)性免疫缺陷??；（2）合并過敏性紫癜、風(fēng)濕性疾病；（3）合并彌散性血管內(nèi)凝血、血友病等其他出血性疾??；（4）合并溶血性貧血、急性白血病等其他血液系統(tǒng)疾?。唬?）近期接受過免疫制劑治療或激素藥物治療。

本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（211129-01），患兒家屬簽署知情同意書。

1.2 樣本量計(jì)算

根據(jù)樣本量計(jì)算公式：n=計(jì)算樣本量，其中n為ITP組例數(shù)，設(shè)雙側(cè)α=0.01，β=0.05，把握度1-β為95%；k為ITP組與非ITP組的比例，本研究中為2；σ1、σ2分別為ITP組與非ITP組的標(biāo)準(zhǔn)差（分別將TGAb、TPOAb的標(biāo)準(zhǔn)差帶入計(jì)算），δ為ITP組與非ITP組平均值的差值（分別將TGAb、TPOAb的平均值差值帶入計(jì)算）。利用PASS 15軟件計(jì)算得到ITP組樣本量為81，非ITP組樣本量為41。考慮失訪及拒訪的情況以30%計(jì)算，最終至少需要的ITP組樣本量≥116例，非ITP組樣本量≥59例，最終納入120例ITP患兒及60例非ITP患兒作為研究對象。

1.3 基線資料收集

設(shè)計(jì)患兒臨床資料調(diào)查表，由患兒家屬代為填寫，內(nèi)容包括患兒年齡、性別、體重指數(shù)（body mass index，BMI）、感染情況（艾滋病病毒、丙型肝炎病毒及幽門螺旋桿菌等）、其他誘發(fā)因素（遺傳因素、疫苗注射等）、發(fā)病季節(jié)（春季、夏季、秋季、冬季）、黏膜出血（有、無）、皮膚出血（有、無）等情況。

1.4 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測

入院當(dāng)日或次日清晨采集患兒空腹靜脈血15 mL，分裝于3支試管中：（1）取5 mL血液樣本，抗凝處理后放入流式檢測管中，使用DxFLEX型流式細(xì)胞儀（貝克曼庫爾特生物科技）測定T淋巴細(xì)胞亞群，包括CD3+、CD4+、CD8+。（2）另取5 mL血液樣本，離心15 min（半徑10 cm，轉(zhuǎn)速3 500 r/min），使用ST800型凝血分析儀（阿里生物技術(shù)）測定血漿凝血酶原時間（prothrombin time，PT）、活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝 血 酶 時 間（thrombin time，TT）、纖 維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）。（3）剩余5 mL血液樣本，離心10 min（半徑10 cm，轉(zhuǎn)速3 000 r/min），使用DS-500C型血細(xì)胞分析儀（深圳理邦實(shí)驗(yàn)生物電子）測定PLT水平；使用ADVIA Centaur型化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定血清TGAb、TPOAb水平，儀器與試劑盒夠自德國西門子公司。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，若最小理論頻數(shù)＜5，采用Fisher確切概率法。采用有序logistic回歸分析檢驗(yàn)各因素對ITP臨床分型的影響。繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，計(jì)算ROC曲線下面積（area under curve，AUC），分析TGAb、TPOAb對ITP臨床分型的評估價值，AUC＜0.5為無價值，0.5≤AUC＜0.7為價值較低，0.7＜AUC≤0.9為價值中等，＞0.9為價值高。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用R 4.1.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件與rmda軟件包，以高風(fēng)險(xiǎn)閾值為橫坐標(biāo)、凈收益率為縱坐標(biāo)，繪制決策曲線，分析TGAb、TPOAb評估ITP臨床分型的凈收益率。

2 結(jié)果

2.1 ITP組與非ITP組臨床資料與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

ITP組患兒CD3+、CD4+比例及PLT計(jì)數(shù)低于非ITP組，CD8+比例及TGAb、TPOAb水平高于非ITP 組（P＜0.05）。2組患兒年齡、性別、BMI、凝血功能比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 ITP組與非ITP組臨床資料與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

表1（續(xù)）

2.2 不同ITP臨床分型患兒臨床資料比較

120例ITP患兒中新診斷ITP 53例（44.2%），持續(xù)性ITP 42例（35.0%），慢性ITP 25例（20.8%）。3組患兒年齡、性別、BMI、誘發(fā)因素、發(fā)病季節(jié)及黏膜出血、皮膚出血情況比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同ITP臨床分型患兒臨床資料比較

2.3 不同ITP臨床分型患兒實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

慢性ITP患兒CD3+、CD4+比例及PLT計(jì)數(shù)低于新診斷ITP、持續(xù)性ITP患兒，CD8+比例及TGAb、TPOAb水平高于新診斷ITP、持續(xù)性ITP患兒（P＜0.05）；新診斷ITP與持續(xù)性ITP患兒實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 不同ITP臨床分型患兒實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 （±s）

表3 不同ITP臨床分型患兒實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 （±s）

注：a示與新診斷ITP比較，P＜0.05；b示與持續(xù)性ITP比較，P＜0.05。［ITP］免疫性血小板減少癥；［PT］凝血酶原時間；［APTT］活化部分凝血活酶時間；［TT］凝血酶時間；［FIB］纖維蛋白原；［PLT］血小板；［TGAb］甲狀腺球蛋白抗體；［TPOAb］甲狀腺過氧化物酶抗體。

項(xiàng)目T淋巴細(xì)胞亞群(%)CD3+CD4+CD8+凝血功能PT(s)APTT(s)TT(s)FIB(g/L)PLT(×109/L)TGAb(IU/mL)TPOAb(IU/mL)新診斷ITP(n=53)62.3±5.2 42.2±3.3 31.8±2.5 12.24±0.68 28.0±1.7 14.8±1.3 3.2±0.5 33.8±6.2 52±9 53.7±8.7持續(xù)性ITP(n=42)61.7±5.2 41.9±3.1 32.1±2.6 12.42±0.83 27.8±1.6 14.8±1.2 3.2±0.4 33.7±6.2 53±9 54.1±9.0慢性ITP(n=25)56.3±4.4a,b 38.5±2.9a,b 34.7±2.8a,b 12.37±0.79 28.0±1.8 15.0±1.3 3.3±0.6 26.3±4.9a,b 65±11a,b 65.2±11.4a,b F值25.130 26.354 26.141 0.704 0.219 0.134 0.401 39.525 51.423 30.742 P值＜0.001＜0.001＜0.001 0.497 0.804 0.875 0.671＜0.001＜0.001＜0.001

2.4 ITP臨床分型影響因素的logistic有序回歸分析

將ITP臨床分型作為因變量（0=非ITP，1=新診斷ITP，2=持續(xù)性ITP，3=慢性ITP），將CD3+、CD4+、CD8+、PLT、TGAb、TPOAb納入作為自變量（均為連續(xù)變量），行有序logistic回歸分析結(jié)果顯示，CD8+比例及TGAb、TPOAb水平高表達(dá)與兒童慢性ITP的發(fā)生密切相關(guān)（OR＞1，P＜0.05），CD3+、CD4+比例低表達(dá)與兒童慢性ITP的發(fā)生密切相關(guān)（OR＜1，P＜0.05）。見表4。

表4 ITP臨床分型影響因素的logistic有序回歸分析

2.5 TGAb、TPOAb對兒童慢性ITP的預(yù)測價值

將血清TGAb、TPOAb作為檢驗(yàn)變量，將ITP臨床分型作為狀態(tài)變量（1=慢性ITP，0=新診斷ITP、持續(xù)性ITP），繪制ROC曲線（圖1），結(jié)果顯示，TGAb、TPOAb及TGAb+TPOAb評估兒童慢性ITP的AUC＞0.80，具有一定的預(yù)測價值（P＜0.001），見表5。

圖1 TGAb、TPOAb評估兒童慢性ITP的ROC曲線

表5 TGAb、TPOAb對兒童慢性ITP的預(yù)測價值

2.6 TGAb、TPOAb評估兒童慢性ITP的決策曲線

以凈收益率為縱坐標(biāo)，高風(fēng)險(xiǎn)閾值為橫坐標(biāo)，繪制TGAb、TPOAb評估兒童慢性ITP的決策曲線（圖2），結(jié)果顯示，當(dāng)高風(fēng)險(xiǎn)閾值分別為0.0～0.5、0.56～1.0時，血清TGAb+TPOAb表達(dá)評估兒童ITP臨床分型的凈收益率優(yōu)于二者單獨(dú)的凈收益率，且在高風(fēng)險(xiǎn)閾值0.0～1.0范圍內(nèi)的凈收益率始終＞0，有臨床意義，凈收益率最大值為0.208。

圖2 TGAb、TPOAb評估兒童慢性ITP的決策曲線

3 討論

目前臨床治療兒童ITP需根據(jù)不同臨床分型、出血分級制定針對性的治療方案，如新診斷ITP、持續(xù)性ITP患兒出血情況較輕，僅需采用一線治療，而嚴(yán)重出血的持續(xù)性ITP及慢性ITP則需在一線治療基礎(chǔ)上根據(jù)患兒具體情況制定治療方案［7］。目前對ITP臨床分型的評估主要根據(jù)患兒病程進(jìn)行判定，但部分患兒起病隱匿，早期的癥狀缺乏典型性，詳細(xì)病程并不明確，以致僅根據(jù)病程對患兒臨床分型進(jìn)行評估存在一定局限［8］。因此尋找客觀指標(biāo)結(jié)合ITP病程評估患兒的臨床分型、制定合理的治療方案尤為重要。

T淋巴細(xì)胞亞群可反映機(jī)體的細(xì)胞免疫，其中CD3+、CD4+、CD8+的動態(tài)平衡維持機(jī)體免疫功能的穩(wěn)定，可通過釋放多種細(xì)胞因子，并通過細(xì)胞與細(xì)胞的接觸，抑制機(jī)體免疫系統(tǒng)對致病因素的免疫應(yīng)答，維持機(jī)體的免疫平衡［9］。當(dāng)CD3+、CD4+、CD8+異常表達(dá)后，可引起兒童免疫功能紊亂，進(jìn)而間接引起ITP的發(fā)生［10］。因此T淋巴細(xì)胞亞群可作為評估ITP的重要指標(biāo)。但T淋巴細(xì)胞亞群異常表達(dá)也可見于惡性腫瘤、艾滋病、自身免疫性疾病等多種與免疫功能相關(guān)的其他疾病中，在評估ITP的應(yīng)用中受到一定限制。

TGAb為甲狀腺濾泡柱狀細(xì)胞內(nèi)的糖蛋白，在正常情況下僅在甲狀腺細(xì)胞內(nèi)循環(huán)，當(dāng)機(jī)體甲狀腺損傷后，可釋放至血液中，引起自身免疫性疾病的發(fā)生［11］。TPOAb是分布在甲狀腺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和頂緣的膜結(jié)合糖蛋白分子，具有催化活性，是合成甲狀腺激素的關(guān)鍵酶，可在T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病中呈異常表達(dá)［12］。本研究中，ITP患兒與非ITP患兒TGAb、TPOAb表達(dá)水平存在顯著差異。Wang等［13］通過對比活動期ITP患者與健康患者外周血、骨髓中T淋巴細(xì)胞亞群水平，發(fā)現(xiàn)ITP患者外周血與骨髓中CD4+T淋巴細(xì)胞亞群失衡，進(jìn)一步提示免疫功能紊亂在ITP的病理生理過程中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果與上述研究［13］結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，TGAb、TPOAb在兒童ITP中呈異常表達(dá)，且與ITP臨床分型有關(guān)。分析原因在于，TGAb表達(dá)升高后，可結(jié)合甲狀腺球蛋白，作用于免疫球蛋白Fc部分c末端受體，激活自然殺傷細(xì)胞，進(jìn)而對靶細(xì)胞造成損傷，破壞甲狀腺細(xì)胞［14］。甲狀腺細(xì)胞損傷后，導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，影響白細(xì)胞介素-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β等多種細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)而影響機(jī)體的免疫功能，降低ITP患兒自然緩解率，促使疾病向慢性化發(fā)展，影響患兒預(yù)后［15］。此外，TGAb表達(dá)升高引起的B淋巴細(xì)胞減少，可直接影響其與效應(yīng)性T細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞之間的相互作用，引起ITP患兒的免疫抑制，進(jìn)而促進(jìn)疾病進(jìn)展、遷延，增加疾病慢性化風(fēng)險(xiǎn)［16］。Eick等［17］研究發(fā)現(xiàn)，TPOAb表達(dá)升高后為了結(jié)合甲狀腺抗原，參與抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，進(jìn)而引起T細(xì)胞介導(dǎo)的甲狀腺細(xì)胞損傷，說明TPOAb異常表達(dá)可損傷甲狀腺細(xì)胞功能，進(jìn)而影響ITP患兒免疫反應(yīng)，導(dǎo)致疾病向慢性化發(fā)展。同時TPOAb可與甲狀腺內(nèi)豐富的補(bǔ)體結(jié)合，激活膜攻擊復(fù)合物，損傷甲狀腺細(xì)胞，進(jìn)而通過減少B淋巴細(xì)胞分泌，影響免疫功能，增加患兒ITP慢性化的風(fēng)險(xiǎn)，影響預(yù)后［18］。

ROC曲線結(jié)果顯示，TGAb、TPOAb及TGAb+TPOAb評估兒童慢性ITP的AUC＞0.80，具有一定預(yù)測價值。決策曲線結(jié)果顯示，當(dāng)高風(fēng)險(xiǎn)閾值分別為0.0～0.5、0.56～1.0時，血清TGAb+TPOAb表達(dá)評估兒童ITP臨床分型的凈收益率優(yōu)于二者單獨(dú)的凈收益率，且在高風(fēng)險(xiǎn)閾值0.0～1.0內(nèi)的凈收益率始終＞0，有臨床意義。提示TGAb、TPOAb對兒童慢性ITP具有較高的預(yù)測價值。因此，臨床可早期檢測ITP患兒血清TGAb、TPOAb水平，并根據(jù)二者表達(dá)情況，結(jié)合患兒病程，評估患兒病情與臨床分型，針對不同臨床分型制定相應(yīng)的治療方案，進(jìn)而提高臨床治療效果，降低患兒死亡風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，TGAb、TPOAb在ITP患兒中呈異常表達(dá)，且與ITP臨床分型有關(guān)，可早期檢測患兒TGAb、TPOAb表達(dá)，可為評估ITP及其臨床分型提供客觀依據(jù)。但本研究也存在局限性，如未納入重型與難治性ITP患兒，分析上述分型ITP患兒基線資料與血清TGAb、TPOAb表達(dá)水平，研究結(jié)果可能存在偏倚，且未觀察TGAb、TPOAb表達(dá)與ITP治療效果、預(yù)后的關(guān)系，未來需要進(jìn)一步擴(kuò)大研究范圍，延長觀察時間，進(jìn)行深入分析。