槲皮素對(duì)馬鈴薯酪氨酸酶 活性的影響以及機(jī)理研究

槲皮素是一種五羥基黃酮，來(lái)源廣泛，具有多種生物學(xué)活性和很高的藥用價(jià)值。實(shí)驗(yàn)證明，黃酮類化合物對(duì)自由基、超氧陰離子均有良好的清除作用，除了抗炎作用，槲皮素還具有抗菌、抗病毒、抗糖尿病、免疫調(diào)節(jié)和心血管保護(hù)等作用，并有新的藥理作用，比如抗抑郁、抗衰老等。

酪氨酸酶（EC1.14.18.1，Tyrosinase）普遍存在于微生物、動(dòng)植物和人體中，具有雙重催化作用，在生物體內(nèi)是黑色素合成的關(guān)鍵酶，同時(shí)與人的衰老、昆蟲(chóng)的發(fā)育及傷口愈合、果蔬的褐變都有著密切關(guān)系。本文以L-多巴為底物，采用酶抑制動(dòng)力學(xué)法研究了槲皮素對(duì)酪氨酸酶的抑制特性及類型，結(jié)果表明，槲皮素對(duì)馬鈴薯酪氨酸酶的抑制常數(shù)KI為2.23mg/mL，屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，這對(duì)于開(kāi)發(fā)槲皮素為抗氧化劑并研究其對(duì)馬鈴薯酪氨酸酶活性的影響具有指導(dǎo)性意義。

一、材料與儀器

1.實(shí)驗(yàn)材料。馬鈴薯、槲皮素、L-DOPA、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉。

2.實(shí)驗(yàn)儀器。FA2004型分析電子天平、HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋、XW-80A漩渦混合儀、MK3酶標(biāo)儀、KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器、冷凍干燥離心機(jī)以及超低溫離心機(jī)。

二、實(shí)驗(yàn)與方法

1.酪氨酸酶提取液的制備。稱取去皮切碎馬鈴薯（-20℃冷凍過(guò)夜），按1：5（m/V）的比例加入磷酸鹽緩沖液2mL，用震蕩機(jī)震蕩1min后離心處理，倒出上清液。

2.酶活力的測(cè)定方法。配置濃度為25Mm、pH為6.8的磷酸鹽緩沖溶液，將底物L(fēng)-多巴溶解在上述磷酸鹽溶液中，配置成濃度為0.8mg/mL的L-多巴溶液。取一個(gè)96孔板，先加入40μL上述L-多巴溶液，再加入80μL磷酸緩沖液（濃度25mM，pH6.8），立即放在震蕩器上震蕩，使其混合均勻。加入40μL馬鈴薯酪氨酸酶的磷酸緩沖溶液（25mg/mL，25mM，pH6.8）開(kāi)始反應(yīng)，在波長(zhǎng)492nm下測(cè)定溫孵前后每孔的吸光度。然后將96孔板在30℃條件下溫孵20min，并在波長(zhǎng)492nm下測(cè)定溫孵后每孔的吸光度。

3.探究酶活力測(cè)定的最適條件。選取底物濃度、pH、馬鈴薯酪氨酸酶液提取時(shí)間、酶液加入量、反應(yīng)溫度這5個(gè)與酶活力相關(guān)的因素，探究酶活力測(cè)定的最適條件。分別配置濃度為0.40mg/mL、0.80mg/mL、1.20mg/mL、1.40mg/mL、2.0mg/mL的L-多巴溶液，測(cè)定酶活力;分別在試管中加入pH值為5.8、6.2、6.8、7.2、7.6、8.0的磷酸鹽緩沖液，測(cè)定酶活力;分別設(shè)定0h、0.5h、1.0h、2.0h、3.0h的馬鈴薯酪氨酸酶提取時(shí)間，按照上述方法測(cè)定酶活力;取0.5g液氮冷凍后的馬鈴薯粉末，加入1.0mL磷酸鹽緩沖溶液（25mM，pH6.8），等梯度稀釋，酶液濃度分別為0.5g/mL、0.25g/mL、0.125g/mL、0.0625g/mL、0.03125g/mL，測(cè)定酶活力;加入酪氨酸酶提取液后，分別在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃的不同溫度水浴條件下測(cè)定酶活力。

4.槲皮素對(duì)馬鈴薯酪氨酸酶活力影響的測(cè)定及抑制率的計(jì)算。在96孔板中加入L-多巴（6mmol/L）及磷酸鹽緩沖液（pH6.8），充分混勻，在30℃水浴中溫育10min后加入40μL不同質(zhì)量濃度（0mg/mL、0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL）的槲皮素溶液，然后加入30μL酶提取液，立即充分混勻，測(cè)定OD492nm。具體操作如表1所示。

抑制率公式為：抑制率（%）=[（A-B）-（C-D）]/（A-B）x100

在上式中，A表示溫孵后空白孔在波長(zhǎng)492nm下的吸光度，B表示溫孵前空白孔在波長(zhǎng)492nm下的吸光度，C表示溫孵后樣品孔在波長(zhǎng)492nm下的吸光度，D表示溫孵前樣品孔在波長(zhǎng)492nm下的吸光度。

三、結(jié)果與分析

1.酶活力測(cè)定的最適條件。選取底物濃度、pH、酪氨酸酶液提取時(shí)間、酪氨酸酶液加入量、反應(yīng)溫度這5個(gè)酪氨酸酶活性的影響因素，探究酶活力測(cè)定的適宜條件。（1）當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.4mg/mL-2.0mg/mL時(shí)，酶活力隨著底物濃度的增大而增加，達(dá)到1.2mg/mL后，隨著底物濃度的增加，酶活力增加較為緩慢，故選擇1.2mg/mL為最適底物濃度。（2）當(dāng)pH為5.8-6.8時(shí)，酶活力隨著pH的增大而增加;當(dāng)pH小于6.8時(shí)，酶活力相對(duì)降低，故選擇pH6.8為最適條件。但當(dāng)pH大于7.6時(shí)，酶活力有一定的回升，需要考慮同工酶因素，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定具體酶的類型。（3）馬鈴薯酪氨酸酶液儲(chǔ)存在4℃冰箱中，2.0h內(nèi)酶活力變化不大，但在2.0h后酶活力降低。因此，酶提取液應(yīng)在2h內(nèi)用完，在此時(shí)間內(nèi)使用酶提取液，酶活力變化對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的影響較小。（4）當(dāng)酪氨酸酶提取液濃度小于0.25g/mL時(shí)，酶活力與酶液濃度基本呈線性關(guān)系。當(dāng)酶液濃度大于0.25g/mL時(shí)，酶活力增長(zhǎng)緩慢，說(shuō)明酶提取液已近飽和，故選擇0.25g/mL勻漿為最佳濃度。（5）酪氨酸酶在30℃時(shí)活力最高，溫度升高或降低，酶活力均下降（圖1）。

底物濃度、pH、酪氨酸酶液提取時(shí)間、酪氨酸酶液加入量、反應(yīng)溫度這5因素對(duì)酪氨酸酶的活性均有一定影響。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.2mg/mL，酪氨酸酶液提取后2h內(nèi)，酪氨酸酶液濃度為0.25g/mL，溫孵溫度為30℃，pH為6.8時(shí)，為酶活力測(cè)定的適宜條件。由于酪氨酸酶是從馬鈴薯中自提的，所以得到的最適條件會(huì)存在不同。因此本實(shí)驗(yàn)選用同一批馬鈴薯提取出的酪氨酸酶，并在較短時(shí)間內(nèi)用完，盡可能減小實(shí)驗(yàn)誤差。

2.槲皮素對(duì)馬鈴薯酪氨酸酶的抑制動(dòng)力學(xué)分析。在測(cè)酶活體系中，固定加入酶量，改變底物L(fēng)-多巴的濃度，測(cè)定酶在不同濃度抑制劑下的催化活力。以酶反應(yīng)的初速度的倒數(shù)對(duì)底物濃度Cs作圖，為一組雙曲線，說(shuō)明酶促反應(yīng)遵循米氏動(dòng)力學(xué)方程（表2）。以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，可以判斷槲皮素對(duì)該酶的抑制作用類型，結(jié)果如圖2所示，Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖在一組現(xiàn)行坐標(biāo)點(diǎn)相交，直線橫軸截距隨槲皮素質(zhì)量濃度的改變而發(fā)生改變，而縱軸截距保持不變，表現(xiàn)為競(jìng)爭(zhēng)型抑制。二次作圖，以斜率對(duì)槲皮素質(zhì)量濃度作回歸直線（圖3），可以求出槲皮素對(duì)馬鈴薯酪氨酸酶的抑制常數(shù)（KI）為2.23mg/mL。

四、討論與結(jié)論

本研究分析了酶液加入量、底物濃度、溫度等單個(gè)因素對(duì)馬鈴薯酪氨酸酶活力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)每個(gè)因素對(duì)酪氨酸酶的活性均存在不同程度的影響。酶活力測(cè)定的適宜條件為：底物濃度1.2mg/mL、酪氨酸酶液濃度0.25g/mL、反應(yīng)溫度30℃、pH6.8。本研究顯示，槲皮素對(duì)馬鈴薯酪氨酸酶的抑制作用類型為競(jìng)爭(zhēng)型抑制，槲皮素因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)與底物L(fēng)-多巴相似，能夠與酪氨酸酶的活性中心結(jié)合，通過(guò)與底物競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致酶活力下降，其對(duì)馬鈴薯酪氨酸酶的抑制常數(shù)為2.23mg/mL。

槲皮素是酪氨酸酶抑制劑，馬鈴薯內(nèi)的酪氨酸酶同樣受到槲皮素的抑制影響。管驍?shù)炔捎玫睦野彼崦甘羌兤?，本?shí)驗(yàn)使用的酪氨酸酶是馬鈴薯提取物，純酶和粗酶的酶活力不同，對(duì)相同底物的影響也不同。同時(shí)，馬鈴薯內(nèi)酪氨酸酶的提取過(guò)程受到多種因素影響，比如溫度、pH等，最終導(dǎo)致的結(jié)果是，與槲皮素對(duì)酪氨酸酶純品的抑制率相比，槲皮素對(duì)馬鈴薯提取酪氨酸酶的抑制率較低。

本文通過(guò)酶抑制動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，研究了槲皮素對(duì)馬鈴薯酪氨酸酶的抑制特性及其機(jī)理。結(jié)果表明，槲皮素是馬鈴薯酪氨酸酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，抑制常數(shù)為2.23mg/mL，該研究可以為酪氨酸酶競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的分子設(shè)計(jì)提供一定的參考依據(jù)。

作者簡(jiǎn)介：王露逸（1993-），女，漢族，山東青島人，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)及檢驗(yàn)。