染色體碎裂化在腫瘤中的作用及其檢測技術(shù)研究進(jìn)展

李 穎，羅娟娟，2，徐天菡，萬紹貴，2

（1. 贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2. 贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子病理中心，江西 贛州 341000）

2011 年，STEPHENS P J 等［1］在研究慢性淋巴細(xì)胞白血病中發(fā)現(xiàn)了一種獨特現(xiàn)象，即在一個明顯的一次性細(xì)胞災(zāi)難中獲得了數(shù)十到數(shù)百個涉及局部基因組區(qū)域的染色體重排，他們將這種基因組災(zāi)難性事件產(chǎn)物稱之為染色體碎裂化（Chromothripsis）。染色體碎裂化的具體形成機(jī)制尚不清楚，其發(fā)生可能與藥物、環(huán)境電離輻射、氧化應(yīng)激和病毒感染等因素有關(guān)［2］。它的主要特點是染色體上出現(xiàn)大范圍的、成簇的基因重排現(xiàn)象，斷裂的DNA 末端隨意地進(jìn)行連接，基因頻頻出現(xiàn)缺失（圖1）［3］。經(jīng)過染色體碎裂化的細(xì)胞一般會死亡，僅極少數(shù)細(xì)胞幸存下來，可能是由于大規(guī)?；蚪M重排讓細(xì)胞有轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞的趨勢。這可能與染色體碎裂化產(chǎn)生的一系列后果相關(guān)，其中包括癌基因的擴(kuò)增、抑癌基因的丟失以及融合基因的形成等。染色體碎裂化并不是漸進(jìn)性的、連續(xù)性的遺傳變異積累，它可使癌癥基因組突然發(fā)生改變，同時影響多個基因的功能，是促進(jìn)癌癥發(fā)生的一類重要的基因組變異［1，4］。

圖1 染色體碎裂化原理圖

1 染色體碎裂化在腫瘤中的作用

CORTéS-CIRIANO I 等［5］使用全基因組分析了38 種癌癥類型的2 658 個腫瘤的染色體碎裂化模式，發(fā)現(xiàn)了染色體碎裂化在癌癥中普遍存在，在多種癌癥類型中發(fā)生率超過50%。迄今為止，大量文獻(xiàn)報道了各種類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展都與染色體碎裂化相關(guān)，比如多發(fā)性骨髓瘤［6］、乳腺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、神經(jīng)細(xì)胞瘤等［5］，其中以腦和骨腫瘤多見。染色體碎裂化對這些腫瘤的發(fā)生有極大的促進(jìn)作用，除此之外，還與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后等密切相關(guān)［7］。在腫瘤細(xì)胞里，染色體碎裂化可發(fā)生在一條或幾條染色體上，不同類型的腫瘤其出現(xiàn)的位置各不相同（表1）。

表1 染色體碎裂化與腫瘤臨床相關(guān)性及其在常見染色體上的位置

1.1 染色體碎裂化促進(jìn)腫瘤進(jìn)展機(jī)制目前為止，研究報道染色體碎裂化推動腫瘤進(jìn)展的分子機(jī)制主要有3種：癌基因擴(kuò)增、抑癌基因丟失以及融合基因形成。

1.1.1 癌基因擴(kuò)增基因擴(kuò)增是指某一個特定基因的拷貝數(shù)選擇性增加而其他基因的拷貝數(shù)并未按比例增加的過程。這在腫瘤中十分常見，癌基因可通過增加基因拷貝數(shù)促使腫瘤惡性轉(zhuǎn)化。染色體碎裂化會導(dǎo)致一條或幾條染色體被打碎，而這些

碎裂的片段最后去向有3 種：⑴依靠細(xì)胞內(nèi)DNA 修復(fù)，碎裂片段按照新的順序連接，衍生出一條或幾條新的染色體；⑵這些小的基因片段可能會被細(xì)胞內(nèi)丟失；⑶作為染色體外DNA（Extrachromosomal DNA，ecDNA）存在于細(xì)胞內(nèi)，碎裂的片段可被組裝到雙微體中［8］。雙微體是ecDNA 中的一種，是無著絲粒、可自我復(fù)制的環(huán)狀DNA［5］。在雙微體這種可高度擴(kuò)增的DNA 環(huán)狀結(jié)構(gòu)上往往存在癌基因，這就造成細(xì)胞內(nèi)癌基因的拷貝數(shù)不斷增加，促使腫瘤惡性發(fā)展。此外，雙微體不但能自我復(fù)制，其個別還能再重新整合到染色體上［9］。在骨肉瘤中，染色體碎裂化發(fā)生在5 號、12 號、17 號染色體上，5 號染色體上發(fā)現(xiàn)RICTOR 癌基因的增加，12 號染色體上可見CDK4 和MDM2 癌基因擴(kuò)增，17 號染色體出現(xiàn)COPS3癌基因擴(kuò)增［10］。

1.1.2 抑癌基因丟失抑癌基因是一類存在于正常細(xì)胞內(nèi)可抑制細(xì)胞生長并具有潛在抑癌作用的基因。當(dāng)這類基因在發(fā)生突變、缺失或失活時可引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生染色體碎裂化時，染色體碎裂片段重新排列，可出現(xiàn)部分片段丟失的現(xiàn)象，如果丟失的片段上存在有抑癌基因，就會造成細(xì)胞內(nèi)抑癌基因丟失，最終就可能引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。在脊索瘤和甲狀腺癌中，發(fā)現(xiàn)了由染色體碎裂化導(dǎo)致的CDKN2A基因缺失［1］。骨肉瘤患者上的17號染色體可檢測到抑癌基因TP53和NF1的缺失［11］。

1.1.3 融合基因形成染色體碎裂化可在細(xì)胞內(nèi)形成新的融合基因以及增加融合基因的數(shù)量，其形成也與基因重排相關(guān)［7］。部分形成的融合基因可成為癌癥的誘因，促進(jìn)癌癥的形成。C11ORF 95 和RELA 基因之間的基因融合是室管膜瘤形成的原因，C11ORF 95-RELA 融合基因是因為11 號染色體發(fā)生染色體碎裂化導(dǎo)致基因重排而形成的［12］。PERSSON M 等［13］報道了由染色體重排導(dǎo)致的高致癌性MYB-NFIB 基因融合，這種融合基因在頭頸部腺樣囊性癌中極為重要，可驅(qū)動腺樣囊性癌腫瘤發(fā)展。融合基因可激活原癌基因，還可產(chǎn)生新的調(diào)控蛋白，表達(dá)新的具有致癌作用的蛋白質(zhì)。LEE J J等［14］在研究非吸煙者中引起肺腺癌的突變過程中發(fā)現(xiàn)，EML4-ALK融合基因就具有此作用。

1.2 染色體碎裂化導(dǎo)致腫瘤耐藥的產(chǎn)生SHOSHANI O 等［8］對產(chǎn)生耐藥性的細(xì)胞進(jìn)行了全基因組測序，揭示了染色體碎裂化會促使攜帶抗腫瘤藥物基因的雙微體形成，從而產(chǎn)生抗腫瘤治療的耐藥性。染色體碎裂化將染色體內(nèi)擴(kuò)增轉(zhuǎn)化為染色體外擴(kuò)增，然后擴(kuò)增的雙微體可重新整合到染色體新的位置，以應(yīng)對化療或放療造成的DNA 損傷。在治療藥物濃度不斷增加的情況下，腫瘤細(xì)胞通過重復(fù)的染色體碎裂化來驅(qū)動初始雙微體的結(jié)構(gòu)不斷進(jìn)化，而新產(chǎn)生的雙微體則會通過增加目標(biāo)基因（即耐藥基因）的拷貝數(shù)來加強(qiáng)細(xì)胞的耐藥性［8］。現(xiàn)有研究報道，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中能觀察到由于染色體碎裂化導(dǎo)致的耐藥性克隆，該腫瘤產(chǎn)生耐藥的機(jī)制，跟染色體碎裂化產(chǎn)生雙微體有關(guān)［15］。此外，多發(fā)性骨髓瘤的耐藥性也與染色體碎裂化有關(guān)，在耐藥細(xì)胞中可見明顯的拷貝數(shù)改變［6］。

2 染色體碎裂化檢測技術(shù)

如果能準(zhǔn)確檢測出染色體碎裂化具體位置，對研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展將有很大幫助。染色體碎裂化檢測技術(shù)可分為常規(guī)檢測技術(shù)（表2）與高通量基因測序檢測技術(shù)（表3）兩大類。常規(guī)檢測技術(shù)包括有熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）、外周淋巴細(xì)胞G 顯帶核型分析和染色體微陣列技術(shù)（Chromosomal microarray analysis，CMA）。高通量基因測序檢測技術(shù)包括有下一代測序技術(shù)（Next generation sequencing，NGS）以及長讀長基因測序技術(shù)。在檢測染色體碎裂化技術(shù)上，長讀長基因測序技術(shù)占有更大的優(yōu)勢。

表2 染色體碎裂化常規(guī)檢測技術(shù)

表3 染色體碎裂化高通量基因測序檢測技術(shù)

2.1 常規(guī)檢測技術(shù)

2.1.1 熒光原位雜交FISH 是基因定位和描繪染色體畸變的重要工具，隨著該技術(shù)靈敏度、特異性和分辨率的提高，原始FISH技術(shù)逐漸多樣化［16］。在染色體碎裂化研究中，使用了不同的FISH 技術(shù)，每種技術(shù)都有針對衍生染色體結(jié)構(gòu)鑒定的特定優(yōu)點。多色FISH 分析（Multicolor FISH analysis，M-FISH）和光譜核型分析（Spectral karyotyping，SKY）用于不同熒光染料結(jié)合的全染色體探針，可識別參與復(fù)雜染色體重排的所有染色體［17］。SKY 和FISH 與基因座特異性探針的組合用于細(xì)胞發(fā)生染色體碎裂化時確定衍生染色體的結(jié)構(gòu)［1］。此外，M-FISH 可通過染色體的片段特異性條帶來確定異常染色體的結(jié)構(gòu)［17］。這些方法的優(yōu)勢是分析發(fā)生在單個細(xì)胞水平的染色體碎裂化時，既可檢測群體中的罕見畸變，又可評估異質(zhì)群體的核型；不足之處在于不能檢測到范圍小的染色體畸變與結(jié)構(gòu)倒置［17］。

2.1.2 染色體微陣列分析CMA也是一種在檢測染色體碎裂化方面比較有效的技術(shù)，目前，微陣列中的比較基因組雜交（Comparative genomic array hybridization，CGH）是應(yīng)用最廣泛的CMA技術(shù)，它也被稱為“虛擬核型分析”或“染色體微陣列分析”［2，18］。CGH基于兩個DNA樣本的直接比較，從而檢測基因組中拷貝數(shù)的變化。在分析過程中，測試DNA 與參考DNA 被切成小片段，然后用特定的染料標(biāo)記這些片段，標(biāo)記的DNA 在芯片上發(fā)生雜交，最后檢測每個點發(fā)出的熒光強(qiáng)度［19］。CGH 為自動化分析，檢測周期短，分辨率高，能檢出絕大多數(shù)染色體不平衡重排［20］。若將其與單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）陣列相結(jié)合，不僅可確定DNA拷貝數(shù)，還可確定研究樣本的雜合性［18］。SNP 陣列通過高分辨率評估整個染色體的異常，具有廣泛的異常檢測范圍［6］。在發(fā)生染色體碎裂化的染色體上，拷貝數(shù)最低的區(qū)域通常就會表現(xiàn)出雜合性的喪失［17］。然而，CGH 方法仍然有它的局限性，它不能檢測出平衡性染色體重排（倒位與平衡易位）［19］。

此外，還有分子倒置探針技術(shù)，它是指線性的單鏈DNA 序列探針與靶向序列基因組雜交形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，用來捕獲目標(biāo)序列的分子生物學(xué)技術(shù)［20-21］。分子倒置探針技術(shù)的探針是一段較長的單鏈DNA序列，該序列能與靶向序列互補(bǔ)形成含有一個核苷酸至幾百個核苷酸缺口的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。以4種游離的

核苷酸（dATP、dTTP、dGTP 和dCTP）為原料，在DNA聚合酶作用下以靶向序列為模板填補(bǔ)缺口。DNA連接酶催化探針兩端的3'，5'-磷酸二酯鍵，形成完整的環(huán)化探針；環(huán)化后，未使用的探針和基因組DNA 被核酸外切酶有效地從反應(yīng)中去除，只留下環(huán)化的探針。以滾環(huán)或線性方式擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物可與微陣列雜交，而后從與微陣列雜交信號中獲得拷貝數(shù)多少［20，22］。最后，將得到的拷貝數(shù)狀態(tài)，根據(jù)染色體碎裂化的推斷標(biāo)準(zhǔn)，得出是否存在染色體碎裂化［21］。CHEN H 等［21］在原發(fā)性乳腺癌中用分子倒置探針微陣列技術(shù)進(jìn)行了全基因組拷貝數(shù)變化的分析，根據(jù)染色體碎裂化推斷標(biāo)準(zhǔn)記錄染色體碎裂化模式狀態(tài)，檢測出了HER2 的擴(kuò)增與17q12 處的染色體碎裂化模式有關(guān)。

2.1.3 外周淋巴細(xì)胞G 顯帶核型分析臨床上檢測染色體碎裂化，可采用外周淋巴細(xì)胞G 顯帶核型分析方法。這種技術(shù)可識別染色體數(shù)量和結(jié)構(gòu)異常，包括易位和倒位［17］。這種方式也適用于單個細(xì)胞，但在分析具有染色體碎裂化細(xì)胞的情況下，染色體多重變化的復(fù)雜性可能限制了G顯帶核型分析的使用。為彌補(bǔ)這方面的缺陷，可考慮綜合多種遺傳分析方法對染色體碎裂化進(jìn)行檢測［17］。

2.2 高通量基因測序檢測技術(shù)

2.2.1 下一代基因測序技術(shù)NGS 主要是指第二代基因測序技術(shù)，基于二代測序技術(shù)形成了幾個分支技術(shù)：全基因組測序（Whole genome sequencing，WGS）、全 外 顯 子 測 序（Whole exon sequencing，WES）、RNA 測序（RNA sequencing，RNA-seq）、染色質(zhì)免疫共沉淀測序（Chromatin immunoprecipitation sequencing，Chip-seq）［23-24］。但用于檢測染色體碎裂化的NGS 的最佳選擇是WGS，因染色體碎片化是一種混亂的復(fù)雜重排，其中許多基因組片段被重排成衍生染色體。當(dāng)前分析染色體碎裂化的方法通常需要手動檢查以重建整個重排。復(fù)雜重排的檢測和重建方法需要從全基因組測序數(shù)據(jù)中表征致病變異，而其他測序技術(shù)可用數(shù)據(jù)可能不足以可靠地推斷出染色體碎裂化［25-26］。WGS基于對大量基因的短片段進(jìn)行擴(kuò)增，總體上覆蓋整個基因組，然后進(jìn)行測序［17］。隨后用獲得的數(shù)據(jù)通過程序軟件ShatterProof［27］、ShatterSeek［5］等處理，從而檢測出染色體碎裂化。CORTéS-CIRIANO I 等［5］基于全基因組測序數(shù)據(jù)去比較不同腫瘤類型的染色體碎裂化的發(fā)生率，使用了ShatterSeek分析2 543例腫瘤病例（共37種腫瘤類型），檢測腫瘤中是否存在染色體碎裂化，繼而得出不同腫瘤類型的染色體碎裂化發(fā)生率。此外，有文獻(xiàn)報道在研究食管腺癌的發(fā)生機(jī)制中，不僅用WGS在食管腺癌病例中檢測出染色體碎裂化，還可通過食管腺癌病例的WGS 結(jié)果，推斷出癌基因的擴(kuò)增是由于染色體碎裂化衍生的雙微體所致［28］。

NGS 采用全基因組分析，有比較高的分析精準(zhǔn)度，能準(zhǔn)確識別出斷點位置，并且獲得斷點的核酸序列數(shù)據(jù)［17］。盡管如此，NGS 仍然有它的局限性。NGS 多為高通量短讀測序檢測染色體異常，對于有高度相似的重復(fù)序列染色體碎裂化，短讀測序檢測就存在缺陷，在精確識別序列級變化方面存在困難［26］。此外，它的分析成本高，方法復(fù)雜，很難檢測出發(fā)生較大的染色體易位、刪除片段［17］。

2.2.2 長讀長基因測序技術(shù)長讀長基因測序技術(shù)主要指的是第三代基因測序技術(shù)，第三代基因測序技術(shù)是指單分子測序技術(shù)。DNA 測序時，不需經(jīng)過PCR 擴(kuò)增，實現(xiàn)了對每一條DNA 分子的單獨測序。目前的長讀長基因測序技術(shù)是以PacBio SMRT測序技術(shù)和ONT 長讀長測序技術(shù)為代表，它們都具有比NGS 長的讀取長度［29］，在檢測染色體結(jié)構(gòu)性變異上有很大優(yōu)勢［30］。

染色體碎裂化是一個發(fā)生在染色體上的大量基因重排事件，無論重排是以何種方式出現(xiàn)，結(jié)果都是重復(fù)、刪除、重新排序或重新定向片段［26］。所以，我們檢測染色體碎裂化，就需要先找到可與檢測基因片段作對照的參考基因組，確定它們之間的“等效”位置，對齊它們（圖2）［31］。具體來說，就是通過推斷每個讀取的基因片段來自參考基因組的哪一部分，將長片段的DNA 讀取與參考基因組進(jìn)行比較，將讀取片段準(zhǔn)確地分成一個或多個部分，并將每個部分與基因組對齊，找到任意重排，進(jìn)行比對，看是否有片段的丟失、重復(fù)、易位等改變，然后對重排的基因片段進(jìn)行排序和定向，以完全重建衍生染色體中的復(fù)雜重排［26，31］。在比對讀取基因片段與參考基因片段的過程中，需了解讀取和基因組之間的小插入、缺失和每種核苷酸替換的比率，計算每個堿基錯誤對齊的概率，找到最可能的劃分和對齊［31-32］。長讀長測序技術(shù)可精確檢測斷點，表現(xiàn)出破碎的碎片是如何排序和定向的，彌補(bǔ)了短讀長測序技術(shù)在檢測復(fù)雜重排上的缺陷［26］。

圖2 長讀長測序技術(shù)檢測染色體碎裂化

最近，由MITSUHASHI S 等［26］組成的研究團(tuán)隊使用納米孔長讀長測序儀PromethION對4例具有相互染色體易位患者的基因組DNA 進(jìn)行了測序，所選擇的這4例染色體易位患者均為難以通過包括微陣列和短讀長測序在內(nèi)的傳統(tǒng)方法確定精確的斷點。在使用納米孔長讀長測序的過程中，他們用新開發(fā)的軟件Dnarrange 查找相對于參考基因組具有重排的DNA 片段，以及重疊相同重排的基因組片段，從而發(fā)現(xiàn)這些患者的DNA 序列重排。然后，他們使用Lamassemble 將每個基因組的片段合并到一個共有序列中，并與參考基因組重新對齊，檢測出重排。當(dāng)存在復(fù)雜染色體重排時（即需要一組以上的參考基因組重排讀取了解重排的完整結(jié)構(gòu)），使用Dnarrange-link 推斷多個讀取基因組的順序和方向，以了解整個染色體的重排，重建衍生染色體［26］。此外，LEI M 等［33］也使用了PromethION 進(jìn)行納米孔長讀長測序，通過Dnarrange分析管道檢測出患者在生殖細(xì)胞中發(fā)生的復(fù)雜染色體碎裂化。

總之，高通量測序技術(shù)是目前應(yīng)用較廣泛的測序技術(shù)，其中長讀長測序方法優(yōu)于常規(guī)檢測方法和NGS，因它可檢測到準(zhǔn)確的斷點，識別較復(fù)雜重排，對碎裂片段及進(jìn)行排序和定向，以及檢測平衡的染色體重排［26］。

3 總結(jié)與展望

染色體碎裂化是促進(jìn)癌癥發(fā)生的一類重要的基因組變異，在經(jīng)過一次性數(shù)十個至數(shù)百個基因重排后，細(xì)胞一般會死亡，但也有幸存下來的細(xì)胞，這些細(xì)胞大概率會轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘?xì)胞。染色體碎裂化的發(fā)現(xiàn)，使我們對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有了一個新的認(rèn)識，為我們?nèi)蘸笱芯磕[瘤的發(fā)生機(jī)制以及臨床診斷治療及預(yù)后的判斷有一個新的方向。現(xiàn)已有數(shù)據(jù)表明染色體碎裂化對患者預(yù)后的影響，但還需更多的研究全面評估染色體碎裂化潛在的臨床價值。多發(fā)性骨髓瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤的報道分析表明，染色體碎裂化與臨床腫瘤不良預(yù)后有明顯的相關(guān)性［34-35］，可通過對活檢組織的基因分析檢測染色體碎裂化，從而評估臨床腫瘤患者的預(yù)后。分子靶向治療能利用染色體碎裂化產(chǎn)生腫瘤的機(jī)制，包括癌基因擴(kuò)增及融合基因的形成等，以腫瘤某些標(biāo)志物分子為靶點，選擇針對性的阻斷劑，干預(yù)該標(biāo)志性分子的調(diào)控，從而抑制腫瘤的進(jìn)展［36］。未來染色體碎裂化可能成為分子靶向治療腫瘤的新視角。

準(zhǔn)確檢測出染色體碎裂化，有利于腫瘤發(fā)生機(jī)制的研究。常規(guī)檢測技術(shù)中應(yīng)用較多的是通過微陣列與其他分子檢測技術(shù)相結(jié)合實現(xiàn)對染色體碎裂化的檢測，但高通量基因檢測技術(shù)的應(yīng)用有更為廣闊的應(yīng)用前景。第三代基因測序技術(shù)是以長讀長測序為特點。在檢測染色體碎裂化上，能彌補(bǔ)短讀長基因測序技術(shù)和一些常規(guī)的染色體碎裂化檢測技術(shù)的不足。在第三代基因測序技術(shù)中，納米孔單分子測序技術(shù)讀長更長，建庫方法靈活多樣，可作為日后測序技術(shù)的發(fā)展趨勢。盡管如此，長讀長測序技術(shù)對于更為復(fù)雜的較大染色體碎裂化的重排（例如著絲粒或端粒重復(fù)）仍不能有效檢測［27］，還需我們研發(fā)出更新的測序技術(shù)手段。