大鼠自然戒斷和小鼠催促戒斷模型評(píng)價(jià)宣肺止嗽合劑的軀體依賴作用

宋月紅 陳 瑛 張晨熙 賈艷麗 董福天 韓 剛 董延生 宋敏平▲

1.甘肅普安制藥股份有限公司，甘肅武威 733006；2.國(guó)科賽賦河北醫(yī)藥技術(shù)有限公司，河北廊坊 065500

藥物依賴性是由于長(zhǎng)期或反復(fù)使用某種藥物，與機(jī)體相互作用而產(chǎn)生對(duì)個(gè)體精神和軀體上的依賴性[1]，反復(fù)用藥會(huì)使機(jī)體不斷進(jìn)行新陳代謝調(diào)整，以適應(yīng)藥物作用下的生理活動(dòng)，機(jī)體一旦適應(yīng)，中斷用藥后會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生不適或心理上的強(qiáng)烈需求，長(zhǎng)期處于強(qiáng)烈用藥欲望會(huì)使神經(jīng)細(xì)胞和腦機(jī)能受損，生理及代謝活動(dòng)發(fā)生嚴(yán)重絮亂或病理性改變，出現(xiàn)戒斷癥狀[2-4]。

宣肺止嗽合劑是臨床上比較常用的止咳中成藥，以宣肺止咳化痰為主[5]。其處方中的蜜罌粟殼含嗎啡等生物堿，而嗎啡是臨床上常用的可致依賴性的藥物[6-12]。本課題組前期研究（未發(fā)表）顯示，宣肺止嗽合劑（等效為人臨床擬用劑量的1、2、4 倍）在大鼠條件性位置偏愛模型上未表現(xiàn)出精神依賴性，為進(jìn)一步判斷其是否有軀體依賴隱患，根據(jù)《藥物非臨床依賴性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[13]相關(guān)要求，本實(shí)驗(yàn)以鹽酸嗎啡作為陽性對(duì)照藥物，考察了宣肺止嗽合劑的軀體依賴性，以期為臨床安全用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

自然戒斷實(shí)驗(yàn)：SPF 級(jí)SD 大鼠60 只，雌雄各半，5～7 周齡，體重160～230 g。催促戒斷實(shí)驗(yàn)：SPF 級(jí)Balb/c 小鼠60 只，雌雄各半，3～6 周齡，體重16～24 g，動(dòng)物均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（冀）2020-010。飼養(yǎng)環(huán)境：屏障動(dòng)物房，12 h/12 h 晝夜自然規(guī)律，通風(fēng)良好，溫度20～26℃，濕度40%～70%，飲水和飼料供動(dòng)物自由攝取。本研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)等遵循國(guó)科賽賦河北醫(yī)藥技術(shù)有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定。

1.2 藥品與儀器

宣肺止嗽合劑（甘肅普安制藥有限公司，批號(hào)：CP002200106，規(guī)格：200 ml/支，6 支/盒）；鹽酸嗎啡注射液（morphine hydrochloride injection，Mor）[東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司，批號(hào)：190202-1（有效期至2024-01-31），規(guī)格：10 mg/ml，購(gòu)自華潤(rùn)河北醫(yī)藥有限公司，藥品使用獲得河北省藥品監(jiān)督管理局審批]；氯化鈉注射液（河北天成藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：1150442，規(guī)格：100 ml/瓶）；電子天平（日本島津公司，型號(hào)：AEL-200，精密度0.1 mg）。

1.3 研究方法

1.3.1 大鼠自然戒斷試驗(yàn)

1.3.1.1 分組與給藥 根據(jù)體重隨機(jī)分為五組，每組12 只，分別為溶劑對(duì)照組，低、中、高劑量宣肺止嗽合劑組和鹽酸嗎啡組，本試驗(yàn)設(shè)置的低、中、高劑量宣肺止嗽合劑組根據(jù)原液中嗎啡實(shí)際濃度折算，分別為原液的1/5 倍、1/2 倍和1 倍，約與人臨床擬用劑量的2.4、6.0、12.0 倍等效[14]。給藥周期和頻率均為連續(xù)30 d，3 次/d。各組給藥途徑、劑量、制劑、濃度、體積見表1。

表1 大鼠自然戒斷模型評(píng)價(jià)宣肺止嗽合劑的軀體依賴作用劑量設(shè)計(jì)表

1.3.1.2 戒斷評(píng)分 從第31 天（即自然戒斷第1 天）開始，觀察末次給藥后12、18、36、42、60、66、84、108、132 及156 h 的癥狀，按照以下評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組大鼠的戒斷癥狀進(jìn)行評(píng)分。①跳躍、濕狗樣搖體、扭體、搖頭、打哈欠、掃尾。0 分=無；1 分=1～5 次；2 分=6～10 次；3 分>10 次。②齒顫、咀嚼（次與次之間至少間隔3 s）、舔生殖器。0 分=無；1 分=1～10 次；2 分=11～20 次；3 分>20 次。③流涎、流淚、豎毛、激惹、眼瞼下垂、腹瀉。0 分=無；1 分=輕度“+”；2 分=中度“++”；3 分=重度“+++”。將動(dòng)物放入戒斷觀察箱中觀察出現(xiàn)上述癥狀的次數(shù)或程度，根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)對(duì)相應(yīng)癥狀進(jìn)行評(píng)分，匯總所有癥狀的得分即為該動(dòng)物的戒斷癥狀評(píng)分[14-17]。

1.3.1.3 體重變化 自然戒斷第1～14 天每天測(cè)定1 次體重，體重變化為戒斷期間體重與末次給藥當(dāng)天體重的差值。

1.3.2 小鼠催促戒斷實(shí)驗(yàn)

將小鼠根據(jù)體重隨機(jī)分為五組，每組12 只，分別為溶劑對(duì)照組，低、中、高劑量宣肺止嗽合劑組和鹽酸嗎啡組。低、中、高劑量宣肺止嗽合劑組經(jīng)口灌胃給藥，連續(xù)給藥5 d，每天給藥3 次，給藥劑量根據(jù)原液中嗎啡實(shí)際濃度折算分別為宣肺止嗽合劑的1/5 倍、1/2 倍及1 倍，分別約等效為人臨床擬用劑量的2.4、6.1、12.2 倍[18]。各組給藥途徑、劑量、制劑、濃度、體積見表2。

表2 小鼠催促戒斷模型評(píng)價(jià)宣肺止嗽合劑的軀體依賴作用劑量設(shè)計(jì)表

于末次給藥6 h 內(nèi)，腹腔注射納洛酮2 mg/kg 進(jìn)行催促戒斷，觀察戒斷后30 min 內(nèi)小鼠的跳躍、扭體次數(shù)及戒斷前后約1 h 的體重變化，體重變化=給納洛酮后體重-給納洛酮前體重。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Stata/IC 15.0 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，偏態(tài)分布計(jì)量資料的描述以中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，比較采用Kruskal-Wallis H 秩和檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠自然戒斷試驗(yàn)

試驗(yàn)第26 天，溶劑對(duì)照組第2 次給藥后1 只動(dòng)物死亡，大體解剖觀察未見異常臟器改變，考慮由灌胃操作引起，因此溶劑對(duì)照組只數(shù)為11 只。

2.1.1 戒斷評(píng)分

與溶劑對(duì)照組比較，鹽酸嗎啡組戒斷評(píng)分升高，宣肺止嗽合劑低劑量組在12、18 h 的戒斷評(píng)分顯著升高，宣肺止嗽合劑中、高劑量組在12、18、36、66、84、108 h 的戒斷評(píng)分顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表3。

表3 自然戒斷期間各組SD 大鼠戒斷評(píng)分[分，M（P25，P75）]

2.1.2 大鼠體重變化

與溶劑對(duì)照組比較，鹽酸嗎啡組體重變化在自然戒斷第2～7 天顯著降低（P ＜0.05），自然戒斷第8～14 天兩組體重變化比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；低、中、高劑量宣肺止嗽合劑組在自然戒斷第1～14 天體重變化與溶劑對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖1。

圖1 自然戒斷期間各組SD 大鼠體重變化

2.2 小鼠催促戒斷試驗(yàn)

給藥第5 天，溶劑對(duì)照組給藥后1 只小鼠死亡，考慮因灌胃操作不當(dāng)所致，因此溶劑對(duì)照組只數(shù)為11 只。

與溶劑對(duì)照組比較，鹽酸嗎啡組小鼠跳躍次數(shù)、扭體次數(shù)升高，體重變化顯著降低（P ＜0.05），低、中、高劑量宣肺止嗽合劑組小鼠的跳躍、扭體次數(shù)和體重變化與溶劑對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見表4。

表4 催促戒斷期間各組Balb/c 小鼠戒斷指標(biāo)[M（P25，P75）]

3 討論

采用反復(fù)給予動(dòng)物依賴性藥物一段時(shí)間后，通過中斷給藥建立自然戒斷成癮模型，可根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)戒斷癥狀嚴(yán)重程度進(jìn)行定量評(píng)定[19-21]。跳躍次數(shù)、體重變化和扭體指標(biāo)是反映催促戒斷的主要指標(biāo)[22-24]，本研究以上述3 個(gè)指標(biāo)來評(píng)價(jià)宣肺止嗽合劑在小鼠催促戒斷模型上的軀體依賴作用，方法可靠。

本研究中大鼠自然戒斷結(jié)果示宣肺止嗽合劑出現(xiàn)了輕微的戒斷反應(yīng)，最低成癮劑量為0.732 mg/（kg·d）（按嗎啡實(shí)際濃度折算劑量計(jì)），約為60 kg 成人臨床用藥劑量的2.4 倍；小鼠催促戒斷結(jié)果顯示宣肺止嗽合劑組小鼠的跳躍次數(shù)、扭體次數(shù)和體重變化與溶劑對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），但是高劑量組編號(hào)為5F005 的小鼠跳躍32 次，考慮該動(dòng)物出現(xiàn)了輕微的戒斷反應(yīng)，同時(shí)本研究選用動(dòng)物數(shù)較少，因此不能排除該劑量下宣肺止嗽合劑不會(huì)引起戒斷癥狀出現(xiàn)，最低成癮劑量為9.15 mg/（kg·d）（按嗎啡實(shí)際濃度折算劑量計(jì)），約為60 kg 成人臨床用藥劑量的12.2 倍，而在成人臨床劑量6.1 倍下未表現(xiàn)出軀體依賴潛能。綜上，宣肺止嗽合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)活性成分實(shí)行定量檢測(cè)和嚴(yán)格控制，要求嗎啡含量在0.030～0.080 mg/ml 范圍內(nèi)，既保證了藥品有效性，又防止了因嗎啡含量過高而引起藥物成癮[25]?；颊咴诓∮那闆r下可自覺停止服藥，不會(huì)發(fā)生濫用現(xiàn)象和藥物依賴性。