補(bǔ)腎生血藥對化療早期骨髓細(xì)胞的影響

巫 蓉 祝 微 王文娟 遲 莉 賈春蓉 岳竹君

1.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院中醫(yī)科，北京 100051；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院病理科，北京 100069

化療后骨髓抑制患者易出現(xiàn)感染、出血及貧血，不僅影響化療進(jìn)程，甚至威脅其生命[1-2]。因此，防治骨髓抑制是腫瘤治療的重要內(nèi)容。有研究表明，中醫(yī)藥在改善骨髓抑制方面優(yōu)勢明顯[3]。既往研究中，中藥干預(yù)結(jié)束時(shí)間多集中在環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）造模后1～2 周[4-6]，此時(shí)骨髓已進(jìn)入恢復(fù)期。研究顯示，CTX 化療早期（化療后5 d 內(nèi)）外周血白細(xì)胞數(shù)明顯下降，骨髓有核細(xì)胞數(shù)明顯減少[7-8]。中藥能否對化療早期骨髓細(xì)胞產(chǎn)生影響，目前報(bào)道較少。補(bǔ)腎生血藥為左歸丸與當(dāng)歸補(bǔ)血湯合方，前期證實(shí)化療后應(yīng)用該藥9～14 d 可明顯促進(jìn)骨髓細(xì)胞增殖，改善骨髓抑制[9-10]。本研究擬觀察補(bǔ)腎生血藥對化療早期骨髓細(xì)胞的影響，以期為臨床用藥提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級雄性BALB/c 小鼠65 只，6～8 周齡，體重（20±2）g，由北京維通利華技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006，使用許可證號：SYXK（京）2018-0003。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（AEEI-2018-054）。

1.2 試劑與儀器

補(bǔ)腎生血藥顆粒劑（北京康仁堂藥業(yè)有限公司）；JAK 激酶2（JAK kinase 2，JAK2）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子5（signal transduction and activator of transcription 5，STAT5）、磷酸化STAT5（phosphorylated-STAT5，P-STAT5）兔抗小鼠抗體（美國CST，貨號：0011、0004、0015）；β-actin 兔抗小鼠抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：TA-09、ZB-2301）；小鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒（北京金?？朴缟锟萍及l(fā)展有限公司，批號：20190901）；CTX（江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司，批號：18020825）；重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte colony stimulating factor，rhG-CSF）（廈門特寶生物工程股份有限公司，批號：201705B06）；RIPA 裂解液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號：201907258620）；Trizol（美國Invitrogen）；cDNA 第一鏈合成試劑盒（康為世紀(jì)，批號：CW2569）；SYBR FAST qPCR 試劑盒（美國KAPA Biosystems）。

1.3 研究方法

1.3.1 分組及干預(yù) 65 只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、陽性對照組、補(bǔ)腎生血藥高劑量組、補(bǔ)腎生血藥低劑量組，每組13 只。預(yù)防給藥5 d，補(bǔ)腎生血藥高、低劑量組采用臨床等效劑量的補(bǔ)腎生血藥（47.0、23.5 g/kg）灌胃，其余組灌胃等量蒸餾水[10]。預(yù)防給藥結(jié)束后，模型組、陽性對照組、補(bǔ)腎生血藥高及低劑量組均腹腔注射環(huán)磷酰胺（100 mg/kg），空白組腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)3 d[10]。同時(shí)進(jìn)行干預(yù)用藥，陽性對照組皮下注射rhG-CSF（30 μg/kg），其余組與預(yù)防給藥階段相同，連續(xù)5 d[10]。以外周血白細(xì)胞數(shù)降低為造模成功[11]。干預(yù)結(jié)束后，頸椎脫臼處死小鼠，收集骨髓細(xì)胞[7]。

1.3.2 骨髓細(xì)胞形態(tài)觀察 取各組100 μl 骨髓細(xì)胞懸液（約1×107個(gè)細(xì)胞），除去上清液后用2.5%戊二醛固定，再經(jīng)1%鋨酸固定，制作超薄切片，透射電子顯微鏡下觀察骨髓細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。因透射電子顯微鏡樣本觀察批次及機(jī)器型號差異，不同組圖片放大倍數(shù)稍有差異。

1.3.3 TNF-α、TGF-β、IFN-γ 含量檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測，各組骨髓細(xì)胞懸液取上清，標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品50 μl，樣本孔中加入待測樣本10 μl 及40 μl 稀釋液；加入抗體100 μl，封閉并孵育1 h；重復(fù)洗滌5 次；加入底物A、B 各50 μl，避光孵育15 min 加入50 μl 終止液。采用酶標(biāo)儀于450 nm 處測定OD 值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本中TNF-α、TGF-β、IFN-γ 含量。

1.3.4 JAK2、STAT5 的mRNA 表達(dá)情況檢測 取各組骨髓細(xì)胞懸液1 ml，除去上清液后加入Trizol 吹打混勻。按試劑盒說明書操作，提取總RNA，測定RNA 濃度及純度，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)體系共20 μl，條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s、59℃退火延伸60 s，共45 個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。β-actin 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法分析JAK2、STAT5 的mRNA 表達(dá)情況。

表1 引物序列

1.3.5 JAK2、STAT5 及P-STAT5 蛋白表達(dá)情況檢測采用蛋白質(zhì)印跡法，取各組骨髓細(xì)胞懸液1 ml，除去上清液加入RIPA 裂解液（含蛋白磷酸酶抑制劑）混勻，離心提取總蛋白，測定蛋白濃度。將樣品加熱變性，每孔上樣量30 μg，依次進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗（β-actin 1∶5000，JAK2、STAT5、PSTAT5 均1∶1000）和二抗（IgG 1∶5000）孵育、顯影、曝光。β-actin 為內(nèi)參，采用Image J 軟件分析JAK2、STAT5及P-STAT5 蛋白表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)；多組計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 五組骨髓細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

空白組骨髓有核細(xì)胞分布密集，核膜、胞膜完整，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰。模型組有核細(xì)胞稀少，見大量細(xì)胞碎片，其余各組有核細(xì)胞數(shù)不同程度增多，胞體減小，細(xì)胞器尚好。見圖1。

圖1 五組骨髓細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

2.2 五組骨髓細(xì)胞TNF-α、TGF-β、IFN-γ 含量比較

模型組TNF-α、TGF-β、IFN-γ 含量高于空白組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。補(bǔ)腎生血藥高、低劑量組TNF-α、TGF-β、IFN-γ 含量低于模型組，補(bǔ)腎生血藥高劑量組TGF-β、IFN-γ 含量低于補(bǔ)腎生血藥低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見圖2。

圖2 五組骨髓細(xì)胞TNF-α、TGF-β、IFN-γ 含量比較

2.3 五組骨髓細(xì)胞JAK2、STAT5 的mRNA 表達(dá)水平比較

與空白組比較，模型組JAK2、STAT5 mRNA 表達(dá)下調(diào)；與模型組比較，補(bǔ)腎生血藥高、低劑量組STAT5 mRNA 表達(dá)上調(diào)；與補(bǔ)腎生血藥低劑量組比較，補(bǔ)腎生血藥高劑量組JAK2 mRNA 表達(dá)下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見圖3。

圖3 五組骨髓細(xì)胞JAK2、STAT5 的mRNA 表達(dá)比較

2.4 五組骨髓細(xì)胞JAK2、P-STAT5、STAT5 蛋白表達(dá)水平比較

模型組JAK2、P-STAT5、STAT5 蛋白表達(dá)水平低于空白組，補(bǔ)腎生血藥高、低劑量組JAK2、P-STAT5蛋白表達(dá)水平高于模型組，補(bǔ)腎生血藥高劑量組P-STAT5 蛋白表達(dá)水平低于補(bǔ)腎生血藥低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見圖4～5。

圖4 五組骨髓細(xì)胞JAK2、P-STAT5、STAT5 蛋白條帶圖

3 討論

TNF-α、TGF-β、IFN-γ 為造血負(fù)調(diào)控因子，能通過多途徑抑制骨髓造血，加速造血細(xì)胞凋亡[12-15]。TNF-α 直接抑制骨髓細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)其凋亡；TGF-β 可于G1期阻斷造血干細(xì)胞（hemopoietic stem cell，HSCs），抑制其增殖分化，誘導(dǎo)其凋亡；IFN-γ 與HSCs 受體結(jié)合，可抑制HSCs 自我更新和增殖。研究報(bào)道，化療藥可促進(jìn)TNF-α、IFN-γ、TGF-β 分泌，抑制造血細(xì)胞增殖分化[16-17]，與本研究結(jié)果一致。JAK2-STAT5 通路能介導(dǎo)多種造血因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與造血細(xì)胞增殖、分化、凋亡，在骨髓造血、免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要作用[18-19]。JAK2 與紅細(xì)胞生成相關(guān)；STAT5 活化后具有促細(xì)胞增生、抑制凋亡的作用。有研究報(bào)道，CTX 可下調(diào)骨髓細(xì)胞JAK2、STAT5 蛋白表達(dá)[20]。本研究結(jié)果顯示，CTX 可下調(diào)JAK2、STAT5 mRNA 表達(dá)，提示化療后JAK2-STAT5 通路抑制明顯。本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)腎生血藥能減輕骨髓細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，降低骨髓中造血負(fù)調(diào)控因子含量，上調(diào)JAK2-STAT5 通路分子表達(dá)，提示補(bǔ)腎生血藥能減輕化療早期骨髓細(xì)胞損傷，機(jī)制與降低造血負(fù)調(diào)控因子含量，正調(diào)控JAK2-STAT5 通路相關(guān)。

圖5 五組骨髓細(xì)胞JAK2、P-STAT5、STAT5 蛋白表達(dá)比較（n=13）