基于PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路探討丹酚酸B對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合成的影響

張 鈴，黃雅娜，蔡巧燕，劉 菲，熊曉滿，林 珊，陳達(dá)鑫，林 煒*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)陳可冀學(xué)術(shù)思想傳承工作室，福建福州 350122）

內(nèi)皮細(xì)胞是血管系統(tǒng)的主要組成部分，其通過(guò)分泌、釋放血管舒張因子和血管收縮因子，對(duì)維持血管穩(wěn)態(tài)起重要作用。血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)中的關(guān)鍵活性物質(zhì)，它能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中一氧化氮（NO）的合成下降，從而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生功能障礙［1］。而內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生功能障礙時(shí)會(huì)引發(fā)一系列的不良反應(yīng)，包括血小板聚集增加、黏附分子表達(dá)升高和血管平滑肌增殖等［2-3］，最終導(dǎo)致血栓、炎癥、血管重構(gòu)和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路在此過(guò)程中起到重要的調(diào)控作用。相關(guān)研究顯示，Ang Ⅱ能顯著抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞中的PI3K/Akt 信號(hào)通路，從而導(dǎo)致內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）活性下調(diào)，NO 含量下降［1，4］。因此，提高內(nèi)皮細(xì)胞中NO 含量，從而減輕內(nèi)皮損傷對(duì)內(nèi)皮功能障礙所致的相關(guān)疾病的防治具有重要意義。

丹酚酸B（salvianolic acid B，SalB）是丹參中含量最為豐富的水溶性化合物，在心腦血管治療方面的藥理研究較為廣泛，且療效顯著［5-6］。SalB 具有抗氧化、抗心肌缺血再灌注損傷、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血糖、降血壓、抗腦缺血損傷和抗肝臟、腎臟、肺纖維化等作用［7］。但SalB 能否改善Ang Ⅱ誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙，還鮮有報(bào)道。因此，本課題利用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）作為研究對(duì)象，評(píng)估SalB 能否對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)下的內(nèi)皮細(xì)胞中PI3K/Akt/eNOS 信號(hào)通路及其下游NO 的含量具有調(diào)控作用，為擴(kuò)大SalB 的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）購(gòu)自于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 丹酚酸B（上海源葉生物科技有限公司）；DMEM-高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國(guó)Hyclone 公司）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT，北京索萊寶科技有限公司）；Ang Ⅱ粉末（美國(guó)Abcam 公司）；PI3K、Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS 抗體（美國(guó)CST 公司）；GAPDH 抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；NO 檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 CO2培養(yǎng)箱（Heal Force 公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備公司）；LX-800 酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-tek 公司）；熒光倒置顯微鏡系統(tǒng)（德國(guó)Leica公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Countstar 公司）；蛋白電泳儀、全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM-高糖完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素雙抗）中，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 SalB 配制 將SalB 粉末溶解于PBS 溶液中，配制成1 mmol/L 的母液，分裝后保存在-20 ℃。使用時(shí)，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基配成所需濃度。

2.3 MTT法檢測(cè)SalB對(duì)HUVEC細(xì)胞活力的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按1×104個(gè)/孔接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入0、25、50、100、200、400 μmol/L 的SalB 干預(yù)24 h。24 h 后去掉上清液，加入100 μL 的MTT（0.5 mg/mL）干預(yù)4 h。4 h 后去掉上清液，加入100 μL 的DMSO，室溫振蕩10 min 后，在570 nm 處測(cè)OD 值。

2.4 利用NO 檢測(cè)試劑盒測(cè)定HUVEC 細(xì)胞中NO含量 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按2×105個(gè)/孔接種于6 孔板中，待細(xì)胞貼壁后，去掉上清液，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h。①將細(xì)胞分為對(duì)照組、低劑量SalB 組、中劑量SalB 組和高劑量SalB 組，分別加入0、25、50、100 μmol/L 的SalB，干預(yù)12 h；②將細(xì)胞分為對(duì)照組、Ang Ⅱ組和干預(yù)組（Ang Ⅱ＋低劑量SalB 組、Ang Ⅱ＋中劑量SalB 組和Ang Ⅱ＋高劑量SalB 組），干預(yù)組分別加入25、50、100 μmol/L 的SalB 干預(yù)12 h，去掉上清液，Ang Ⅱ組和干預(yù)組加入1 μmol/L 的Ang Ⅱ干預(yù)12 h。上述條件干預(yù)結(jié)束后，去掉上清液，用PBS 洗滌2 次，加入500 μL 的DAF-FM DA（5 μmol/L）探針，37 ℃避光孵育30 min。30 min 后用PBS 洗滌3 次，每次5 min。加入2 mL的PBS，使用熒光顯微鏡觀察拍照。每個(gè)孔隨機(jī)選取6 個(gè)不同視野進(jìn)行拍照，應(yīng)用Image J 軟件分析熒光強(qiáng)度。

2.5 Western blot 法檢測(cè)HUVEC 細(xì)胞中PI3K/Akt/eNOS 信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按2×105個(gè)/孔接種于6 孔板中，待細(xì)胞貼壁后，去掉上清液，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h。將細(xì)胞分為對(duì)照組、Ang Ⅱ組和干預(yù)組（Ang Ⅱ＋低劑量SalB 組、Ang Ⅱ＋中劑量SalB 組、Ang Ⅱ＋高劑量SalB 組），干預(yù)組分別加入25、50、100 μmol/L的SalB 干預(yù)12 h。去掉上清液，Ang Ⅱ組和干預(yù)組分別加入1 μmol/L 的Ang Ⅱ干預(yù)15 min，檢測(cè)PI3K、p-Akt、Akt 蛋白表達(dá)；或分別加入1 μmol/L的Ang Ⅱ干預(yù)12 h，檢測(cè)p-eNOS、eNOS 蛋白表達(dá)。干預(yù)結(jié)束后，收集細(xì)胞，用RIPA 裂解液提取總蛋白，用BCA 法分析蛋白濃度，再進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，取出對(duì)應(yīng)條帶，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入PI3K（1∶1 000）、p-Akt（1∶1 000）、Akt（1∶2 000）、p-eNOS（1∶500）、eNOS（1∶500）、GAPDH（1∶5 000）一抗孵育過(guò)夜，TBS-T 漂洗3 次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫振蕩孵育1 h，TBS-T 漂洗3 次。加入ECL 化學(xué)發(fā)光試劑，用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（ChemiDoc XRS System）進(jìn)行顯影。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（xˉ±s）表示，采用單因素方差分析。

3 結(jié) 果

3.1 不同濃度SalB 對(duì)HUVEC 細(xì)胞活力的影響

25、50、100 μmol/L 的SalB 干預(yù)HUVEC 細(xì)胞24 h 后，其細(xì)胞活力與0 μmol/L 組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而200、400 μmol/L 的SalB 能顯著抑制HUVEC 細(xì)胞的活力（P＜0.05），表明在100 μmol/L 及以下濃度的SalB 對(duì)HUVEC 細(xì)胞無(wú)毒性。因此，選用25、50、100 μmol/L 的SalB 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干預(yù)濃度，見表1。

表1 不同濃度SalB 對(duì)HUVEC 細(xì)胞活力的影響（xˉ±s）

3.2 不同濃度SalB 對(duì)HUVEC 細(xì)胞中NO 含量的影響 經(jīng)25、50、100 μmol/L 的SalB 干預(yù)后，HUVEC細(xì)胞中的NO 含量明顯提高（P＜0.05），見圖1。

3.3 5 組HUVEC 細(xì)胞中NO 含量比較 與對(duì)照組比較，Ang Ⅱ組NO 含量明顯降低（P＜0.05）。經(jīng)25、50、100 μmol/L 的SalB 干預(yù)后，均能明顯提高Ang Ⅱ誘導(dǎo)下的HUVEC 細(xì)胞中NO 含量（P＜0.05），提示SalB 能明顯提高Ang Ⅱ誘導(dǎo)下HUVEC 細(xì)胞中NO 的含量，見圖2。

圖1 不同濃度SalB 對(duì)HUVEC 細(xì)胞中NO 含量的影響（×200）

圖2 5 組HUVEC 細(xì)胞中NO 含量比較（×200）

3.4 5 組HUVEC 細(xì)胞PI3K、Akt、p-Akt、eNOS、peNOS 蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，Ang Ⅱ組PI3K 蛋白表達(dá)和p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS 比值均明顯下降（P＜0.05）。經(jīng)25、50、100 μmol/L 的SalB干預(yù)后，Ang Ⅱ誘導(dǎo)下的HUVEC 細(xì)胞中PI3K 蛋白表達(dá)和p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS 比值明顯提高（P＜0.05），其中50、100 μmol/L 的SalB 在p-Akt/Akt 比值上提高程度最為明顯（P＜0.05），呈劑量依賴，表明SalB 促進(jìn)了Ang Ⅱ誘導(dǎo)下的HUVEC 細(xì)胞中PI3K/Akt/eNOS 信號(hào)通路的活化。見圖3。

圖3 5 組HUVEC 細(xì)胞PI3K、Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS 蛋白表達(dá)比較

4 討 論

內(nèi)皮損傷是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、冠狀動(dòng)脈疾病和心肌缺血發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵事件［8］。NO 是內(nèi)皮細(xì)胞中最重要的一種介質(zhì)，具有舒張血管和抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和改善血管重構(gòu)等作用［9］。NO 是在eNOS 的作用下，由L-精氨酸轉(zhuǎn)化而來(lái)，其合成的下降是引起內(nèi)皮功能障礙的主要原因，在諸如高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病中均存在NO 含量下降現(xiàn)象［10-12］。本研究通過(guò)Ang Ⅱ誘導(dǎo)HUVEC 細(xì)胞，建立了內(nèi)皮功能障礙模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Ang Ⅱ誘導(dǎo)下，NO 的含量顯著下降。SalB 在單獨(dú)給藥時(shí)已發(fā)現(xiàn)其能提高內(nèi)皮細(xì)胞中NO 含量，說(shuō)明SalB 具有潛在的改善內(nèi)皮功能障礙的療效。進(jìn)一步在Ang Ⅱ造成的內(nèi)皮損傷模型中，仍然發(fā)現(xiàn)SalB 能顯著逆轉(zhuǎn)Ang Ⅱ誘導(dǎo)下NO 含量的下降，該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了SalB 具有改善內(nèi)皮損傷的功效。

PI3K/Akt 信號(hào)通路參與了血管內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生、發(fā)展［13］。PI3K 可磷酸化磷酸肌醇，生成3，4二磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol-3，4-biphosphate，PI-3，4P2）及3，4，5 三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 3，4，5-trisphosphate，PI-3，4，5P3）。在磷脂酰肌醇依賴的蛋白激酶（phosphoinositidedependent protein kinase，PDK）作用下，PI-3，4P2 和PI-3，4，5P3 與Akt 結(jié)合，并促進(jìn)Akt 的磷酸化；而磷酸化后的Akt 會(huì)進(jìn)一步增加eNOS 活性，提高NO 合成［14-15］。儲(chǔ) 佳 佳 等［16］發(fā) 現(xiàn) 柚 皮 苷 能 通 過(guò) 調(diào) 控PI3K/Akt 信號(hào)通路減輕高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷；姜芳［17］發(fā)現(xiàn)芒果苷也可以通過(guò)調(diào)控PTEN/PI3K/Akt 信號(hào)通路，緩解高脂飲食誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷；毛竹君等［18］研究表明運(yùn)脾活血散結(jié)方通過(guò)上調(diào)PI3K/Akt/eNOS 信號(hào)通路抑制2 型糖尿病大鼠血管內(nèi)皮損傷。相關(guān)研究表明，SalB 通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt/Raf/MEK/ERK 級(jí)聯(lián)信號(hào)通路，減輕H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［19］；還能顯著抑制氧化應(yīng)激水平，改善Ang Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓小鼠的內(nèi)皮損傷［20］。

本研究結(jié)果顯示，在Ang Ⅱ誘導(dǎo)下，HUVEC 細(xì)胞中的PI3K/Akt 信號(hào)通路被顯著抑制，進(jìn)而導(dǎo)致其下游eNOS 的磷酸化水平下降，這是導(dǎo)致NO 合成下降的關(guān)鍵因素，且與實(shí)驗(yàn)中觀測(cè)到在Ang Ⅱ誘導(dǎo)下NO 含量下降是一致的。應(yīng)用SalB 干預(yù)后PI3K/Akt 信號(hào)通路顯著上調(diào)，且中、高劑量SalB 干預(yù)后Akt 的磷酸化水平較低劑量明顯提高，顯示出一定的劑量依賴性。在eNOS 的磷酸化水平上，SalB 低、中、高劑量均能顯著增加eNOS 的磷酸化水平，3 個(gè)劑量間不存在明顯的劑量依賴。但總體上，通過(guò)3個(gè)不同濃度的SalB 均已表明SalB 可通過(guò)上調(diào)PI3K/Akt/eNOS 信號(hào)通路，升高Ang Ⅱ誘導(dǎo)下NO 含量，從而減輕內(nèi)皮功能障礙。但SalB 是否對(duì)于其他誘導(dǎo)劑所致的內(nèi)皮損傷同樣具有保護(hù)功效，以及SalB能否通過(guò)調(diào)控其他信號(hào)通路，減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷，均需要進(jìn)行進(jìn)一步的探討。