丹瓜方對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織MCP-1和NF-κB p65表達的影響

馮春燕，余鋨香，曹俊昌，林 琳，黃蘇萍，衡先培

（1.福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院，福建福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院，福建福州 350004）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是由糖尿病導致的一種常見微血管疾病，其特征主要包括視網(wǎng)膜水腫、滲出、出血、新生血管及增殖膜改變等，臨床癥狀主要表現(xiàn)為視力進展性下降，甚至失明。流行病學數(shù)據(jù)顯示，DR 患病人數(shù)在糖尿病患者中的占比約為22.3%［1］。DR 患病率與致盲率目前呈現(xiàn)明顯的逐年上升的態(tài)勢，故探究DR 的病因病機與防治的形勢刻不容緩。恰如劉完素在《醫(yī)方精要宣明論》中所述：“消渴一證，可變?yōu)槿改炕騼?nèi)障”，近代醫(yī)家將DR 歸屬于中醫(yī)學“消渴目病”或“消渴內(nèi)障”范疇，病位主要在肺、脾、腎，病機主要是氣陰虧虛、脾腎兩虛、痰瘀阻絡(luò)［2］。丹瓜方是衡先培教授治療痰瘀互結(jié)型糖尿病及其并發(fā)癥的經(jīng)驗方，前期臨床研究與動物實驗證明，該方具有調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂、抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)控氧化應(yīng)激、改善糖尿病及其并發(fā)癥癥狀的功效［3-8］，但是其療效機制尚未完全明確，仍需深入探究。因此，本研究旨在觀察丹瓜方干預(yù)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）與核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）表達的變化，進一步探討丹瓜方防治DR 的作用機制，為課題的后續(xù)研究提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 13 周齡SPF 級自發(fā)性糖尿?。℅oto-Kakisaki，GK）雄性大鼠40只，體質(zhì)量309～412 g；Wistar 雄性大鼠10 只，體質(zhì)量345～383 g，由上海斯萊克實驗動物責任有限公司提供，合格證號：SCXK（滬）20070005。置于福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)。

1.2 實驗藥物 丹瓜方藥物組成：丹參15 g，瓜蔞15 g，薤白10 g，川芎10 g，赤芍10 g，郁金10 g，法半夏6 g，白僵蠶6 g，均購自福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院藥劑科。鹽酸二甲雙胍片（上海信誼藥廠有限公司，生產(chǎn)批號：091226B）；辛伐他汀片（廣州南欣制藥有限公司，生產(chǎn)批號：2117091）。

1.3 實驗試劑 MCP-1 抗體（博士德生物工程有限公司）；NF-κB p65 抗體（美國CST 公司）；小鼠GAPDH 抗體（上?？党缮锕こ逃邢薰荆?；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗小鼠（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；胰蛋白酶（美國BD 醫(yī)療器械有限公司）；破膜劑（美國Caltag 公司）。

1.4 實驗儀器 培養(yǎng)板、低溫高速離心機（美國Sigma-Aldrich 公司）；PVDF 膜（德國Millipore 公司）；ELX808 酶標儀（美國Bio-Tek 公司）；Model 680 及電泳凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；電泳儀和電泳槽（北京六一生物科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 造模與分組 大鼠自由攝食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)2 周后，測量記錄每只大鼠空腹狀態(tài)下體質(zhì)量，并檢測所有大鼠的尾靜脈隨機血糖。非同一日內(nèi)測2次每只GK 大鼠空腹血糖均≥11.1 mmol/L，40只成年雄性GK 大鼠均為糖尿病模型大鼠［4］。Wistar大鼠組隨機血糖4.6～6.0 mmol/L。采用隨機數(shù)字表法將GK 大鼠分為模型組、二甲雙胍組、辛伐他汀組、丹瓜方組，每組10 只，Wistar 大鼠作為正常組。

2.2 藥物干預(yù) 二甲雙胍組按125 mg/（kg·d）予二甲雙胍懸濁液灌胃，辛伐他汀組按1.7 mg/（kg·d）予辛伐他汀懸濁液灌胃，丹瓜方組按6.7 mg/（kg·d）予丹瓜方懸濁液灌胃，正常組與模型組予同體積無菌蒸餾水灌胃，各組每日9時灌胃，連續(xù)灌胃3個月。

2.3 Western blot 法檢測大鼠視網(wǎng)膜組織MCP-1 和NF-κB p65 蛋白表達 各組干預(yù)3 個月后剪取大鼠視網(wǎng)膜組織至研缽中，加入液氮，快速研磨至粉末，經(jīng)RIPA裂解液裂解，4 ℃、12 000 r/min下離心5 min，取上清，BCA 法測定蛋白濃度。配制分離膠、濃縮膠制成凝膠，將凝膠置于電泳槽中，加入電泳緩沖液后上樣，進行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，快速取出PVDF 膜，TBST 洗滌5 min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。取出膜，于搖床上TBST 洗膜5 min×3 次。孵育袋中加入TBST 稀釋的MCP-1（1∶400）、NF-κB p65（1∶1 000）和小鼠抗GAPDH（1∶2 000），4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜5 min×3 次，加辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔（1∶2 000）和辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗小鼠（1∶2 000），室溫孵育2 h。TBST 洗膜5 min×3 次，置于化學發(fā)光檢測試劑（試劑A∶試劑B＝1∶1）反應(yīng)2 min，取出膜，甩去多余的液體，用保鮮膜包好PVDF 膜，暗室中用X 膠片感光、顯影、定影。

2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件，計量資料符合正態(tài)分布以（xˉ±s）表示，采用單因素方差分析。

3 結(jié) 果

與正常組比較，模型組視網(wǎng)膜組織MCP-1、NF-κB p65 蛋白表達顯著提高（P＜0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組、辛伐他汀組和丹瓜方組MCP-1、NF-κB p65 蛋白表達均顯著下降（P＜0.01），見表1、圖1。

表1 5組視網(wǎng)膜組織MCP-1和NF-κB p65表達比較（xˉ±s）

圖1 5 組大鼠視網(wǎng)膜組織MCP-1 和NF-κB p65 蛋白電泳圖

3 討 論

糖尿病性微血管病變是糖尿病的特異性并發(fā)癥，常在糖尿病病程長和血糖控制不良的患者身上發(fā)現(xiàn)。消渴日久極易生痰、生瘀，痰瘀互結(jié)導致血行不暢，血脈瘀滯于眼底脈絡(luò)，神光不能發(fā)越，故見視物模糊癥狀；另一方面，痰瘀阻滯脈絡(luò)所致血行不暢、津液疏布失調(diào)，則消渴病變更甚。由此可見，消渴病與痰、瘀相互影響，痰、瘀會隨著消渴病的發(fā)展而產(chǎn)生，而隨著痰、瘀的加重，又會反過來使消渴病進一步發(fā)展，產(chǎn)生糖尿病微血管病變［9］。

丹瓜方由瓜蔞薤白半夏湯合新四物湯方化裁而來，方中丹參、川芎、赤芍、郁金等藥物活血祛瘀，瓜蔞、法半夏、薤白、白僵蠶等藥物化痰散結(jié)，活血祛瘀、化痰散結(jié)則血行通暢，津液輸布正常，從而使病情得到控制。根據(jù)前期的臨床研究，丹瓜方具有降低血糖、改善血液黏稠度的作用［10］，因此，重視“祛瘀化痰”法在治療消渴內(nèi)障方面具有重要的臨床意義。

MCP-1 也稱為趨化因子，來自趨化因子CC 亞家族，是最早發(fā)現(xiàn)和研究最廣泛的CC 趨化因子。在糖尿病的病程中，因為長期血糖控制不佳、血糖偏高所形成的糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）及糖尿病狀態(tài)均可使MCP-1 表達顯著增加，MCP-1 刺激炎癥產(chǎn)生加重動脈硬化的形成。大量研究已經(jīng)證明，MCP-1 具有調(diào)節(jié)動脈平滑肌細胞增殖和誘導視網(wǎng)膜新生血管的能力，故MCP-1 被認為是導致糖尿病血管并發(fā)癥的一個危險因子［11-14］。NF-κB 是一個轉(zhuǎn)錄因子家族，可在疾病中控制多個細胞過程，包括炎癥、增殖、血管生成等。NF-κB 可被糖尿病激活，隨著NF-κB 的激活可使AGEs 的產(chǎn)生增加，并可使黏附分子的表達增加，使單核細胞與血管內(nèi)皮細胞黏附，進而使血管硬化［15］。其中，由p65 亞單位形成的NF-κB p65 是目前研究發(fā)現(xiàn)的NF-κB 中作用最主要、分布最廣泛的組合形式，它參與機體免疫和炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)細胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)。KOWLURU 等［16］研 究發(fā) 現(xiàn)由Ras 相 關(guān)的C3 肉 毒素 底物1（Rac1）介導的視網(wǎng)膜中的NADPH 氧化酶2（Nox2）激活是糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病機制的早期事件，它導致線粒體損傷和毛細血管細胞凋亡的啟動。Rac1啟動子的結(jié)合位點之一是NF-κB，視網(wǎng)膜微血管系統(tǒng)中NF-κB 的p65 亞基與Rac1 啟動子的結(jié)合增加，導致Rac1 激活Nox2，由此可見NF-κB p65 是糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生的因素之一［16-17］。

本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組視網(wǎng)膜組織MCP-1、NF-κB p65 蛋白表達顯著提高（P＜0.01），說明MCP-1 和NF-κB p65 可能是DR 的影響因子，MCP-1 和NF-κB p65 可能與DR 的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。與模型組比較，二甲雙胍組、辛伐他汀組和丹瓜方組MCP-1、NF-κB p65 蛋白表達均顯著下降（P＜0.01），提示丹瓜方能有效改善糖脂代謝及預(yù)防視網(wǎng)膜動脈硬化的作用。綜上所述，丹瓜方可用于預(yù)防糖尿病患者并發(fā)DR，通過祛瘀化痰法治療消渴內(nèi)障方面具有重要的臨床意義。