蓮心堿體外吸收對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響

賈沛芝，林 珊，2，曾建偉，2，熊曉滿，劉 菲，王美玲，林 煒，2，陳達(dá)鑫，2*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350122）

高血壓是常見(jiàn)病之一，全國(guó)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，近年來(lái)我國(guó)成人高血壓患病率逐年上升［1］。高血壓引起的主要靶器官損害為血管、心臟、腦和腎臟損傷及其相關(guān)并發(fā)癥［2］，而血管的功能性病變伴隨著高血壓的發(fā)生和發(fā)展，幾乎是所有靶器官病理改變的使動(dòng)環(huán)節(jié)。因此，對(duì)高血壓血管病變的早期防治和藥物開(kāi)發(fā)，具有重要的理論意義和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。高血壓導(dǎo)致的血管病變包括血管內(nèi)皮損傷和血管重構(gòu)兩大方面。高血壓引起血管重構(gòu)的原因之一是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）激活引起的血管緊張素2（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）分泌異常時(shí)，血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）將發(fā)生增殖、遷移，由收縮型向合成型轉(zhuǎn)變的表型轉(zhuǎn)換，同時(shí)VSMCs 分泌胞外基質(zhì)引起膠原增生，使動(dòng)脈血管管腔內(nèi)徑狹窄，血管壁厚增加，動(dòng)脈僵硬，導(dǎo)致血管由功能性病變發(fā)展為結(jié)構(gòu)上的病理改變。VSMCs 表型轉(zhuǎn)換在促進(jìn)血管重構(gòu)中發(fā)揮重要作用，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）是最常用的表型轉(zhuǎn)換標(biāo)志物，收縮型與合成型相比，收縮型α-SMA 的含量較高。高血壓與血管功能損傷互為因果［3］。

清達(dá)顆粒由陳可冀院士治療肝腎陰虛肝陽(yáng)上亢型高血壓的經(jīng)驗(yàn)方清眩降壓湯化裁而來(lái)［4］，全方由黃芩、天麻、鉤藤、蓮子心組成，具有清熱瀉火、平肝潛陽(yáng)的作用。其中的蓮子心（Nelumbinis Plumula）是睡蓮科植物蓮（Nelumbo nucifera Gaertn.）成熟種子中的干燥幼葉及胚根，性寒、味苦，歸心、腎經(jīng)，可平上亢之肝陽(yáng)。《本草再新》中記載蓮子心有“清心火、平肝火、瀉脾火、降肺火。消暑除煩，生津止渴，治目紅腫”的功效。蓮子心的主要活性組分是蓮子心生物堿，包括蓮心堿、甲基蓮心堿、異蓮心堿、蓮心季銨堿、荷葉堿和原荷葉堿等?，F(xiàn)代藥理研究表明，蓮子心及其生物堿類成分具有降低血壓、抗心律失常等作用［5］。蓮心堿是蓮子心中主要的雙苯異喹啉類生物堿之一，具有抗癌、抗高血壓、抗心律失常、抗氧化和抗炎等作用［6］。由于蓮心堿水溶性不高，是否能通過(guò)磷脂雙分子層進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮其生物學(xué)作用的研究甚少。為了確定蓮心堿的作用途徑并進(jìn)一步討論蓮心堿對(duì)高血壓血管功能的保護(hù)作用，本研究通過(guò)超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF/MS）法測(cè)定不同濃度蓮心堿進(jìn)入A7R5 細(xì)胞的含量，并通過(guò)建立Ang Ⅱ誘導(dǎo)的A7R5 細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換模型，觀察蓮心堿對(duì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的影響，為進(jìn)一步闡述蓮心堿治療高血壓及靶器官損害的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 大鼠胸大動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（A7R5），購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號(hào)：CL-0316。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 Q-TOF/MS 飛行時(shí)間質(zhì)譜（德國(guó)布魯克公司）；Agilent1290 UPLC 超高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；雙轉(zhuǎn)盤(pán)活細(xì)胞共聚焦實(shí)時(shí)成像分析系統(tǒng)（美國(guó)PerkinElmer 公司）；AR2130 電子天平［奧豪斯儀器（上海）有限公司］；CP225D 電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；KQ-300DB 臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（上海睿鈺生物科技有限公司）；Infinite200 PRO多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）；倒置顯微鏡（日本尼康公司）；熒光倒置顯微鏡系統(tǒng)（德國(guó)徠卡儀器公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試藥 蓮心堿（C37H42N2O6）、MTT、臺(tái)盼藍(lán)染色液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：SL8100、M8180-250、C0040-100ML）；DMEM-高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、胰酶、PBS（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，貨號(hào)：C11995500BT、10099-141、SV30010、25200072、SH30256.01B）；α-SMA 抗體（美國(guó)CST 公司，貨號(hào)：D4K9N）；山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor?647）預(yù)吸附二抗（英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：ab150083）；乙腈（色譜純，德國(guó)MERCK 公司）；甲醇及甲酸均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 A7R5 細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%雙抗的高糖DMEM 培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 UPLC-Q-TOF/MS 法測(cè)定蓮心堿進(jìn)入細(xì)胞的含量 A7R5 細(xì)胞以1×105個(gè)/mL 的密度，接種于6 cm 培養(yǎng)皿中，每皿5 mL，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸取上清液，將細(xì)胞分為0、5、25、50、100、200 μg/mL 蓮心堿組，分別加入含0、5、25、50、100、200 μg/mL 蓮心堿的完全培養(yǎng)基，以0 μg/mL蓮心堿組作為空白對(duì)照，繼續(xù)孵育15 min 后消化收集細(xì)胞，經(jīng)過(guò)5 次PBS 清洗，另收集200 μg/mL 蓮心堿組最后1 次清洗的PBS 溶液（蓮心堿PBS 清洗液）待測(cè)，考察經(jīng)過(guò)清洗后的細(xì)胞外液中是否存在蓮心堿殘留；取50 μg/mL 的蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液設(shè)為蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)品組作為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照。用甲醇破碎細(xì)胞膜，沉淀細(xì)胞結(jié)構(gòu)，14 000 r/min 離心，棄沉淀，收集各組上清液為待測(cè)樣品。

UPLC-Q-TOF/MS分析應(yīng)用Agilent 1290 Infinity UPLC系統(tǒng)和micro TOF Ⅱ檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的蓮心堿含量。采用Agilent UPLC 300 Extend-C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）分析。流動(dòng)相由0.1%甲酸/水（流動(dòng)相A）和乙腈（流動(dòng)相B）組成，梯度程序?yàn)椋合疵撘篈 98%～98%，洗脫液B 2%～2%，洗脫時(shí)間為0～5 min；洗脫液A 98%～20%，洗脫液B 2%～80%，洗脫時(shí)間為5～30 min；洗脫液A 20%～2%，洗脫液B 80%～98%，洗脫時(shí)間為30～35 min，進(jìn)樣量2 μL，流速為0.2 mL/min，柱溫為30 ℃。質(zhì)譜測(cè)定采用負(fù)離子模式，離子源電壓3.0 kV；干燥氣流速6.0 L/min；噴霧干燥機(jī)溫度180 ℃；掃描范圍78～1 800 m/z，Bruker Anglysis 系統(tǒng)對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)和鑒定?；迳V圖（BPC）顯示樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的成分。

2.3 MTT 法測(cè)定不同濃度蓮心堿對(duì)A7R5 細(xì)胞活力的影響 A7R5 細(xì)胞以1×105個(gè)/mL 的密度接種于96孔板，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，吸取上清液，換成空白培養(yǎng)基孵育4h。吸去上清液后，將細(xì)胞分為0、5、25、50、100、200 μg/mL 蓮心堿組，分別加入含0、5、25、50、100、200 μg/mL 蓮心堿的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h 后，吸去上清液，每孔加入0.5 mg/mL MTT 溶液100 μL。37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加入100 μL 二甲基亞砜（DMSO）充分振蕩10 min 溶解結(jié)晶，用酶標(biāo)儀在490 nm 處測(cè)定吸光度。

2.4 免疫熒光法檢測(cè)A7R5 細(xì)胞中α-SMA 的蛋白表達(dá) 將A7R5 細(xì)胞以5×104個(gè)/mL 的密度接種至20 mm 直徑的共聚焦小皿中，接種培養(yǎng)體系為1 mL，細(xì)胞搖勻后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。12 h 后吸去上清液，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組（完全培養(yǎng)基）、Ang Ⅱ組（1×10-6mol/L Ang Ⅱ）、蓮心堿組（1×10-6mol/L Ang Ⅱ＋10 μg/mL 蓮心堿），繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，棄去皿中液體，PBS 清洗（5 min×3 次）。清洗后4%多聚甲醛固定20 min，棄上清，PBS 清洗（5 min×3 次）。使用0.1%Triton X-100 孵育5 min，棄液體，PBS 清洗（5 min×3 次）。之后每皿加入700 μL 封閉液，封閉1 h，封閉液中加入α-SMA 抗體（1∶100），4 ℃濕盒過(guò)夜。第2 天棄一抗，PBS 清洗（5 min×3 次）。結(jié)束后加入熒光二抗（封閉液1∶200 配置），避光常溫孵育1 h，棄二抗，PBS 清洗（5 min×3 次）。之后用即用型DAPI 染液染細(xì)胞核15 min，PBS 清洗（5 min×3 次），最后用PBS 浸泡細(xì)胞，雙轉(zhuǎn)盤(pán)活細(xì)胞共聚焦實(shí)時(shí)成像分析系統(tǒng)對(duì)α-SMA 表達(dá)與DAPI 的核定位照片進(jìn)行疊加（Merge），觀察細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換標(biāo)志物α-SMA 的表達(dá)與分布情況。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（xˉ±s）表示，采用單因素方差分析，若方差齊，采用T-test 法進(jìn)行各組間兩兩比較；若方差不齊，則采用Games-Howell 法進(jìn)行兩兩比較。

3 結(jié) 果

3.1 UPLC-Q-TOF/MS 法測(cè)定蓮心堿進(jìn)入A7R5 細(xì)胞的含量 UPLC-Q-TOF/MS 法測(cè)定不同蓮心堿濃度干預(yù)組（0、5、25、50、100、200 μg/mL）、最高濃度蓮心堿干預(yù)組末次細(xì)胞清洗液及50 μg/mL蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)品。結(jié)果顯示：測(cè)試樣品分子式分析C37H41N2O6得分為100，且出峰時(shí)間與蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)品一致，確定細(xì)胞破碎后在14.0 min 時(shí)出現(xiàn)色譜峰為蓮心堿，見(jiàn)圖1。通過(guò)各組樣品的峰面積及峰高計(jì)算蓮心堿15 min 的進(jìn)細(xì)胞效率。0 μg/mL蓮心堿組及蓮心堿PBS 清洗液組分析得出峰值為0，說(shuō)明清洗細(xì)胞后細(xì)胞外無(wú)蓮心堿殘留，見(jiàn)圖2；進(jìn)入細(xì)胞樣品率計(jì)算公式為：（50 μg 進(jìn)細(xì)胞樣品峰面積/50 μg 標(biāo)準(zhǔn)品峰面積）×100%，結(jié)果顯示15 min 蓮心堿進(jìn)細(xì)胞率為15.56%，見(jiàn)表1。根據(jù)測(cè)試樣品峰面積與蓮心堿濃度繪制曲線圖，結(jié)果顯示不同濃度蓮心堿進(jìn)入細(xì)胞的含量與蓮心堿的濃度呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)關(guān)系，說(shuō)明蓮心堿濃度越高，進(jìn)入細(xì)胞的含量越高且超過(guò)100 μg/mL后進(jìn)入濃度飽和階段，見(jiàn)圖3。

圖1 UPLC-Q-TOF/MS 鑒定A7R5 細(xì)胞液中蓮心堿成分

圖2 UPLC-Q-TOF/MS 法檢測(cè)各組基礎(chǔ)峰色譜圖

表1 使用蓮心堿濃度及細(xì)胞內(nèi)液成分的色譜峰表現(xiàn)

圖3 蓮心堿干預(yù)濃度與細(xì)胞內(nèi)液成分峰值曲線圖

3.2 不同濃度蓮心堿對(duì)A7R5 細(xì)胞活力的影響 為觀察蓮心堿對(duì)A7R5細(xì)胞株的毒性，使用MTT法檢測(cè)不同濃度蓮心堿對(duì)細(xì)胞活力的影響。5、25、50 μg/mL蓮心堿組細(xì)胞活力與0 μg/mL 蓮心堿組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），100、200 μg/mL 蓮心堿組細(xì)胞活力較0 μg/mL 蓮心堿組明顯下降（P＜0.05），說(shuō)明濃度為50 μg/mL 以下的蓮心堿在24 h內(nèi)對(duì)A7R5 細(xì)胞活力不存在影響，見(jiàn)圖4。因此，選擇＜50 μg/mL 的蓮心堿濃度，可用于后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的研究。

圖4 不同濃度蓮心堿對(duì)A7R5 細(xì)胞活力的影響

3.3 蓮心堿對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)A7R5 細(xì)胞α-SMA 的影響 與空白對(duì)照組比較，AngⅡ組A7R5 細(xì)胞中α-SMA 熒光強(qiáng)度明顯降低；與AngⅡ組比較，蓮心堿組α-SMA 熒光強(qiáng)度明顯上升，見(jiàn)圖5。

4 討 論

高血壓可引起多種靶器官與部位損害，血管重構(gòu)為諸多病變之一。研究表明，人體處于高血壓狀態(tài)時(shí)，血管中層的VSMCs 發(fā)生增殖、遷移、凋亡、由收縮型向合成型轉(zhuǎn)變的表型轉(zhuǎn)換、膠原沉積，由功能性改變到結(jié)構(gòu)性改變，從而產(chǎn)生血管重構(gòu)。AngⅡ引起的VSMCs 表型轉(zhuǎn)換在引起高血壓血管重構(gòu)中發(fā)揮重要作用。VSMCs 分為收縮型與合成型，收縮型主要功能為分布血流和調(diào)節(jié)血壓，合成型表現(xiàn)為高度增殖。成年動(dòng)物血管中膜里的VSMCs表現(xiàn)出正常的收縮表型，增殖率極低。處于高血壓等疾病狀態(tài)、胎兒期或血管生成過(guò)程中的VSMCs以合成表型存在［7］。合成型的VSMCs 可從中膜遷移至內(nèi)膜，并在內(nèi)膜中大量增殖，使血管管壁增厚、管腔變窄、血管順應(yīng)性下降、外周阻力增高，血壓升高，形成高血壓等疾?。?］。血管重構(gòu)加劇高血壓的發(fā)生，形成惡性循環(huán)。因此本研究將A7R5 細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過(guò)測(cè)定蓮心堿進(jìn)入細(xì)胞的含量及蓮心堿對(duì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的抑制，從而為蓮心堿的降壓作用及血管保護(hù)作用的研究奠定基礎(chǔ)。

圖5 3 組A7R5 細(xì)胞α-SMA 蛋白熒光免疫圖（×600）

蓮心總堿作為蓮子心的活性成分，具有降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓，通過(guò)RhoA/ROCK 通路改善高血壓大鼠腹主動(dòng)脈收縮力及血管重構(gòu)的作用［9］。而蓮心堿是蓮心總堿的主要成分之一，自1962 年被我國(guó)學(xué)者首先從蓮子心中分離得到后受到心血管領(lǐng)域研究工作者的關(guān)注［10-11］。對(duì)蓮心堿的藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，蓮心堿靜脈注射在大鼠體內(nèi)后可分布在心、腦、腎及脾等主要臟器，但是不能穿過(guò)血腦屏障，說(shuō)明蓮心堿可以進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮作用［12］。蓮心堿可有效降低腎性高血壓大鼠的血壓，還可治療心律失常，其機(jī)理是通過(guò)抑制鉀電流和鈣電流，使動(dòng)作電位時(shí)程適度延長(zhǎng)，從而提高了心律失常的治療效率，為治療室性心律失常的藥物提供了潛在的藥理學(xué)基礎(chǔ)，同時(shí)這也可能是蓮心堿降壓的機(jī)制［13-14］。此外蓮心堿可以抑制去甲腎上腺素誘導(dǎo)的依賴內(nèi)鈣釋放的兔子離體動(dòng)脈環(huán)收縮［15］，對(duì)組胺誘導(dǎo)的豬冠脈平滑肌細(xì)胞依賴內(nèi)鈣性收縮與氯化鈣誘導(dǎo)的依外鈣性收縮均具有抑制作用［16］，可以有效抑制KCl 誘導(dǎo)的離體腸系膜血管平滑?。╒SM）收縮［17］，這些研究表明蓮心堿可能是異常平滑肌收縮的潛在松弛劑。綜上所述，蓮心堿具有重要臨床研究意義，可降低血壓，起到血管保護(hù)的作用。但是目前由于蓮心堿不溶于水的特點(diǎn)及降壓、血管保護(hù)作用的機(jī)制尚不明確。

UPLC-Q-TOF/MS 因其高分辨率和精確的質(zhì)量測(cè)量，通過(guò)多級(jí)質(zhì)譜與參考化合物的比較，可以鑒別出未知成分，目前已成為國(guó)際公認(rèn)的藥物成分及藥代動(dòng)力學(xué)分析工具之一。本研究通過(guò)UPLCQ-TOF/MS 法測(cè)定蓮心堿進(jìn)入A7R5 細(xì)胞的含量，結(jié)果顯示蓮心堿在15 min 時(shí)進(jìn)入細(xì)胞的效率為15.56%，說(shuō)明蓮心堿水溶液可以經(jīng)過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞從而發(fā)揮作用；并且通過(guò)激光共聚焦顯微鏡的觀察，確定了蓮心堿能夠抑制AngⅡ引起的A7R5 細(xì)胞由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化，從而證明蓮心堿對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的保護(hù)作用，為后續(xù)研究蓮心堿防治高血壓，同時(shí)保護(hù)高血壓血管功能機(jī)制研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。