基于氣相-離子遷移譜的不同干燥方式下金銀花揮發(fā)性成分分析

王 燕 ，盧 恒，張敏敏，王 曉，鄒曉菊，李麗麗*

1.云南中醫(yī)藥大學中藥學院，云南 昆明 650000

2.齊魯工業(yè)大學（山東省科學院），山東省分析測試中心，山東 濟南 250014

金銀花為忍冬科忍冬屬植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花，味甘性寒，氣味芳香，具有清熱解毒、疏散風熱等功效[1]。金銀花香氣濃郁，甜潤感十足，其濃郁的芳香氣味源自金銀花中揮發(fā)性成分[2]。這類成分約占金銀花總成分的1%，化學組成復(fù)雜，數(shù)目繁多，具有顯著的抗菌、抗病毒等作用[3]。以金銀花揮發(fā)性成分為基料制成的產(chǎn)品也越來越多，如金銀花露、金銀花尾酒釀造的風味食醋[4]、金銀花純化固態(tài)發(fā)酵酒等[5]。

金銀花揮發(fā)性成分研究多是采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）。王瑩等[6]采用GC-MS法分析金銀花與4個來源山金銀花揮發(fā)性成分的差異；郭向陽[7]采用GC-MS法分析金花、銀花以及葉片揮發(fā)性成分的異同；侯冬巖等[8]采用GC-MS法分析云南、山東、遼寧等不同產(chǎn)地金銀花揮發(fā)性成分的差異。GC-MS技術(shù)樣品提取過程耗時長、檢測費用高、譜圖解析復(fù)雜[9]。GC與IMS技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，這使得GC的選擇性與IMS的靈敏度協(xié)同作用。氣相離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GCIMS）具有高分離度、高靈敏度、譜圖直觀可視化的優(yōu)點且穩(wěn)定性好、響應(yīng)速度快、經(jīng)濟，特別適合于一些揮發(fā)性成分的痕量分析[10]。GC-IMS首先在氣相色譜中進行預(yù)分離，然后預(yù)分離后的產(chǎn)物離子再根據(jù)其在電場中遷移速度的差異進一步分離，得到保留時間、遷移時間、離子強度的三維矩陣，獲得更加豐富的化學信息[11]。

新鮮的金銀花水分含量高，容易發(fā)生褐變，不易保存。已報道的金銀花的干燥方式有陰干法、曬干法、低溫烘干法、蒸制殺青-烘干法等[12]。金銀花揮發(fā)性成分的種類和含量受干燥方式的影響，楊金平等[13]基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究了烘干對金銀花揮發(fā)性成分的影響，發(fā)現(xiàn)烘干后的金銀花中α-胡椒烯、6-十一醇等揮發(fā)性成分含量顯著降低。已有研究指出[14-15]，蒸制殺青-烘干后綠原酸、木犀草苷等非揮發(fā)性藥效成分含量明顯高于曬干法、陰干法和低溫烘干法。但基于GC-IMS的不同干燥方式下金銀花的揮發(fā)性成分研究尚未見報道。本實驗對金銀花鮮樣分別進行曬干、陰干、低溫烘干、蒸制殺青-烘干處理，通過GC-IMS對不同干燥方法下金銀花的揮發(fā)性成分進行分析，篩選不同干燥方式下的差異成分，為優(yōu)化金銀花干燥方式提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Flavour Spec?氣相離子遷移譜聯(lián)用儀，德國G.A.S.公司；CPA225D型十萬分之一電子分析天平，德國Sartorius公司；FW100型高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；FNO烘干脫水溫濕度自控儀，鄭州福農(nóng)達農(nóng)業(yè)科技有限公司；ZTXY-101快速水分測定儀，南寧眾思盛實驗設(shè)備有限公司。

1.2 材料

金銀花采自平邑金銀花標準化種植基地（鄭城鎮(zhèn)武城村），經(jīng)齊魯工業(yè)大學（山東科學院）王曉研究員鑒定為忍冬科忍冬屬植物忍冬L.japonicaThunb.的新鮮花蕾，品種為大毛花，采收時間為2021年5月19日（二白花期）。將新鮮金銀花分別進行曬干、陰干、低溫烘干、蒸制殺青-烘干處理，研磨成粉，過藥典四號篩，密封備用。不同干燥處理方式如下。

1.2.1 曬干 將新鮮金銀花均勻平鋪在干燥潔凈的竹編簸箕上，平鋪厚度約0.3 cm，放于陽光充足處進行自然干燥，自然曬至足干（達到安全含水量10%，含水量使用水分測定儀進行測量，下同），日曬時間共72 h。

1.2.2 陰干 將新鮮金銀花均勻平鋪在干燥潔凈的竹編簸箕上，平鋪厚度約0.3 cm，放于陰涼通風處進行干燥，晾至足干，陰干時間共140 h。

1.2.3 低溫烘干 將新鮮金銀花平攤至不銹鋼托盤內(nèi)，平鋪厚度約0.3 cm，使用FNO烘干脫水溫濕度自控儀器進行烘干。溫控參數(shù)設(shè)置[16]初始溫度為38 ℃，1 h內(nèi)線性升溫至41 ℃，恒溫1 h；然后1 h升溫至44 ℃，恒溫2 h；然后1 h內(nèi)線性升溫至47 ℃，恒溫1 h；然后1 h內(nèi)線性升溫至50 ℃，恒溫1 h；然后1 h內(nèi)線性升溫53 ℃，恒溫1 h；然后1 h內(nèi)線性升溫到57 ℃；再1 h內(nèi)線性升溫至66 ℃，；恒溫1 h，下同），烘干至足干，烘干時間共14 h。

1.2.4 蒸制殺青-烘干 將新鮮金銀花平鋪在蒸籠內(nèi)，平鋪厚度約0.3 cm，放到水浴鍋上加熱，以上汽時間計算，蒸制2 min[17]，然后再用FNO烘干脫水溫濕度自控儀器烘干，烘干至足干，烘干時間14 h。

2 方法

2.1 樣品制備

準確稱取100 mg金銀花粉末于頂空進樣瓶中，每種干燥方式平行6份。

2.2 GC-IMS分析條件

頂空進樣條件：頂空孵育溫度80 ℃，孵育時間15 min，孵育轉(zhuǎn)速500 r/min，進樣針溫度85 ℃，進樣體積200 μL。

GC-IMS條件：色譜柱（FS-SE-54-CB-1，15 m×0.53 mm×1 μm，德國G.A.S.公司）；柱溫45 ℃；載氣/漂移氣為高純氮氣（質(zhì)量分數(shù)≥99.999%）；IMS探測器溫度45 ℃；漂移氣體積流量為150 mL/min；氣相載氣體積流量設(shè)置為初始體積流量2 mL/min，維持2 min；然后23 min內(nèi)線性升至100 mL/min；再10 min內(nèi)線性升至150 mL/min，維持1 min；梯度洗脫時間共36 min。

2.3 數(shù)據(jù)處理

金銀花中揮發(fā)性成分，采用儀器配套的GC×IMS Library Search軟件，通過內(nèi)置的NIST氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫和IMS遷移時間數(shù)據(jù)庫進行定性分析。儀器配套的LAV（laboratory analytical viewer）軟件用于樣品圖譜的查看及主成分分析（principal component analysis，PCA），通過Reporter插件和Gallery Plot插件繪制不同樣品的差異圖譜和指紋圖譜，采用Mev軟件對數(shù)據(jù)進行非參數(shù)檢驗。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同干燥方式金銀花外觀性狀分析

金銀花鮮樣干燥后，外觀性狀發(fā)生了顯著變化，不同干燥方式金銀花的外觀性狀見圖1。曬干后的金銀花為黃棕色，陰干后的金銀花為黃色、綠色相間，低溫烘干后的金銀花為淡綠色，蒸制殺青-烘干的金銀花為黃色且明顯皺縮。相比較而言，低溫烘干法比其它干燥方式得到的金銀花樣品外觀性狀好。

圖1 不同干燥方式下金銀花的外觀性狀Fig.1 Appearance characters of LJF with different drying methods

3.2 金銀花中揮發(fā)性成分定性分析

在GC-IMS中，通過將揮發(fā)性成分的氣相保留時間和離子遷移時間與GC×IMS Library Search內(nèi)置的NIST數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫比對，共定性出48個化合物，包括14個醛類、10個醇類、5個酮類、6個吡嗪類、5個酯類、2個呋喃類、2個酸類、1個吡咯類和3個其他類成分，結(jié)果見表1和圖2。

圖2 金銀花中揮發(fā)性成分的GC-IMS圖 (數(shù)字代表定性出揮發(fā)性成分，白色代表含量較低，紅色代表含量較高)Fig.2 GC-IMS diagram of volatile compounds of LJF (number represents volatile compounds, white represents lower content and red represents higher content)

表1 金銀花中揮發(fā)性成分Table 1 Volatile compounds identified in LJF

3.3 不同干燥方式下金銀花揮發(fā)性成分差異性分析

續(xù)表1

通過LAV軟件中Reporter插件直接對比不同干燥方式下金銀花樣品的譜圖，見圖3。該譜圖直觀的反映了不同干燥方式下金銀花揮發(fā)性成分的種類和含量差異顯著。如圖3所示，曬干處理的金銀花樣品亮點多，揮發(fā)性成分更為豐富，部分成分的含量也較高。

圖3 不同干燥方式金銀花揮發(fā)性成分的GC-IMS對比圖Fig.3 GC-IMS comparison plot of volatile compounds of LJF with different drying methods

選取低溫烘干的金銀花樣品譜圖作為參比，其它干燥處理的譜圖扣減參比，得到不同干燥方式下金銀花的差異圖，見圖4?？蹨p后的譜圖中，相同含量物質(zhì)抵消為白色，紅色表示該物質(zhì)含量比低溫烘干后所得物質(zhì)含量高，藍色表示該物質(zhì)含量比低溫烘干后所得物質(zhì)含量低，顏色越深表示差異越大。從圖中可以看出同一干燥方式（低溫烘干樣品1和低溫烘干樣品2）扣減后的揮發(fā)性成分基本抵消為白色，而與其它干燥方式相比色差明顯。從圖4中可以看出，曬干法與低溫烘干法的差異最大，蒸制殺青-烘干法與低溫烘干法的差異次之，陰干法與低溫烘干法的差異最小。

圖4 不同干燥方式金銀花揮發(fā)性成分的GC-IMS差異圖Fig.4 GC-IMS difference plot of volatile compounds of LJF with different drying methods

使用LAV軟件對不同干燥方式下金銀花的揮發(fā)性成分進行PCA，使用PC1和PC2繪制得分圖（圖5），前2個主成分的累計貢獻率為76%。不同干燥方式處理的金銀花樣品在圖中有明顯的分離，蒸制殺青-烘干處理的金銀花樣品聚集在圖的左邊，陰干和低溫烘干的金銀花樣品在圖的右下方，曬干處理的金銀花樣品在圖的右上方。曬干法和蒸制殺青-烘干法的距離最遠，差異最大。陰干法和低溫烘干法距離最近，差異最小。

圖5 不同干燥方式金銀花揮發(fā)性成分的PCA得分圖Fig.5 PCA score diagram of volatile compounds of LJF with different drying methods

使用Mev軟件對不同干燥方式的金銀花樣品兩兩組別間進行非參數(shù)檢驗（Wilcoxon，Mann-Whitney test），并進行本杰明-霍克伯格校正（Benjamini-Hochberg Correction，F(xiàn)DR），同時計算兩兩組別之間的倍率。通過P（FDR）值＜0.01和倍率＞2篩選差異化合物。結(jié)果顯示曬干與蒸制殺青-烘干法、曬干與陰干法、曬干與低溫烘干法、低溫烘干與蒸制殺青-烘干法、陰干與蒸制殺青-烘干法、低溫烘干與陰干法分別含有24、6、11、18、20、5個差異揮發(fā)性成分。由此可以發(fā)現(xiàn)不同干燥方式下?lián)]發(fā)性成分差異顯著。其中曬干與蒸制殺青-烘干法，陰干與蒸制殺青-烘干法的差異較大，而曬干與陰干法、低溫烘干與陰干法之間差異較小。

3.4 不同干燥方式下金銀花GC-IMS指紋圖譜分析

為了進一步了解金銀花不同干燥方式下?lián)]發(fā)性成分的變化情況，通過Gallery Plot插件繪制了曬干、陰干、低溫烘干、蒸制殺青-烘干處理的金銀花揮發(fā)性成分的GC-IMS指紋圖譜，結(jié)果見圖6。每種干燥方式有6個平行樣，最右側(cè)為樣品名稱，底部為揮發(fā)性物質(zhì)的定性結(jié)果，未知但差異比較大的成分用數(shù)字編號（1～16），每個亮點的顏色越深代表化合物含量越大。

圖6 不同干燥方式下金銀花揮發(fā)性成分的指紋圖譜Fig.6 Fingerprint of volatile compounds of LJF by GC-IMS with different drying methods

從圖6可以看出，不同干燥方式下?lián)]發(fā)性成分組成存在明顯的差異，曬干的樣品中紅色亮點最多，含揮發(fā)性成分種類最豐富、部分成分含量較高；蒸制殺青-烘干的樣品中紅色亮點最少，含揮發(fā)性成分種類最少、大部分成分含量較低，2種干燥方式差異最大。將不同干燥方式下金銀花樣品的指紋圖譜分成A、B、C、D、E 5個部分。A區(qū)域為5種干燥方式下金銀花樣品共有的揮發(fā)性成分，包括3-甲基丁醛、反式-2-戊烯醛、壬醛、2,3-戊二酮、2-甲基-3-乙基吡嗪、乙酸乙酯等成分。B區(qū)域揮發(fā)性成分在曬干金銀花中含量較高，包括反式-2-辛烯醛、反式-2-庚烯醛、1-辛烯-3-酮、2-丁氧基乙醇、2-乙酰呋喃、2-戊基呋喃等成分，且2-乙酰呋喃和反式-2-辛烯醛在蒸制殺青-烘干樣品中未檢出。C區(qū)域揮發(fā)性成分在蒸制殺青-烘干這一干燥方式下含量較高，包括芳樟醇、2,4-庚二烯醛、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、γ-丁內(nèi)酯等成分。除了A和C區(qū)域，蒸制殺青-烘干在B、D、E區(qū)域的揮發(fā)性成分含量非常低。D區(qū)域揮發(fā)性成分在低溫烘干金銀花中含量較高，包括乙酸甲酯、乙酸己酯、2-甲基丁醇等成分。E區(qū)域揮發(fā)性成分在陰干金銀花中下含量較高，包括苯甲醛、2,3-二乙基-5-甲基吡嗪、2-庚酮、α-蒎烯等成分，而且α-蒎烯在蒸制殺青-烘干樣品中未檢出。由此可見，揮發(fā)性成分的種類和含量可以作為區(qū)分金銀花不同干燥方式的重要指征[18-19]。

3.5 不同干燥方式下金銀花揮發(fā)性成分的變化

基于特征揮發(fā)性成分的峰體積，比較不同揮發(fā)性成分在不同干燥方式金銀花樣品中的含量。通過GC-IMS技術(shù)從不同干燥方式下金銀花中一共定性出48個化合物，篩選出34種差異性成分，包括2個呋喃類、1個吡咯類、4個吡嗪類、5個酮類、8個醛類、7個醇類、4個酯類、1個酸類和2個其他類成分。

呋喃類物質(zhì)具有一種令人愉悅的果香味、甜味[20]，2-乙酰呋喃和2-戊基呋喃在不同干燥方式下的含量次序均為曬干法＞陰干法＞低溫烘干法＞蒸制殺青-烘干法。曬干法中2-乙酰呋喃的含量為陰干法、低溫烘干法、蒸制殺青-烘干法的2.47、4.19、9.40倍，2-戊基呋喃的含量為陰干法、低溫烘干法的1.42、1.83倍，而2-乙酰呋喃蒸制殺青-烘干后未檢出。

吡咯類物質(zhì)具有花香味[21]，2-乙酰吡咯在不同干燥方式下的含量次序為曬干法＞低溫烘干法＞陰干法＞蒸制殺青-烘干法，其在曬干法中的含量為陰干法、低溫烘干法、蒸制殺青-烘干法的1.36、1.46、4.34倍。

吡嗪類物質(zhì)具有烤香、堅果香、咖啡香等香味[22]，2-甲基-3-乙基吡嗪和甲基吡嗪均以曬干法含量最高，蒸制殺青-烘干法含量最低，其在曬干法中的含量分別是蒸制殺青-烘干法的3.71、2.04倍。2,3-二乙基-5-甲基吡嗪在不同干燥方式下的含量次序為陰干法＞低溫烘干法＞曬干法＞蒸制殺青-烘干法，陰干法中2,3-二乙基-5-甲基吡嗪的含量為曬干法、陰干法、低溫烘干法、蒸制殺青-烘干法的1.79、1.53、6.93倍。以上3種吡嗪類物質(zhì)均在蒸制殺青-烘干法中含量最低，但是2-乙基-3,5-二甲基吡嗪在蒸制殺青-烘干法中含量最高，其在蒸制殺青-烘干法中的含量約為曬干法、陰干法、低溫烘干法的1.41、5.14、2.23倍。

1-辛烯-3-酮具有藥香味，反式-2-辛烯醛具有青香、脂肪味[23-24]，兩者均以曬干法含量最高，蒸制殺青-烘干法含量最低。曬干法中1-辛烯-3-酮的含量為蒸制殺青的2.73倍，而反式-2-辛烯醛在蒸制殺青-烘干后未檢出。依據(jù)Pei等[25]關(guān)于C8化合物在熱降解過程中降解的報道，推測1-辛烯-3-酮、反式-2-辛烯醛在蒸制殺青過程中熱降解導(dǎo)致含量大幅度下降。2,3-丁二酮具有奶油味[26]，在不同干燥方式下的含量次序為曬干法＞陰干法＞蒸制殺青-烘干法＞低溫烘干法，其在曬干法中的含量為陰干法、蒸制殺青-烘干法、低溫烘干法的1.55、2.18、2.06倍。

己醛具有青草香、果香[27]，在不同干燥方式下含量次序為曬干法＞蒸制殺青-烘干法＞低溫烘干法＞陰干法，其在曬干法中的含量為陰干法、低溫烘干法、蒸制殺青-烘干法的1.53、2.06、1.29倍。反式2-庚烯醛具有果香味[28]，在不同干燥方式下含量次序為曬干法＞陰干法＞蒸制殺青-烘干法＞低溫烘干法，其在曬干法中的含量為陰干法、蒸制殺青-烘干法、低溫烘干法的1.86、2.91、2.71倍。

2-庚醇具有藥草香、青香[29]，在不同干燥方式下的含量次序為曬干法＞陰干法＞低溫烘干法＞蒸制殺青-烘干法，其在曬干法中的含量為陰干法、低溫烘干法、蒸制殺青-烘干法的1.17、1.43、2.49倍。芳樟醇具有花香、青香及木香[30]，對細菌和真菌具有顯著的抑制作用[31]，在不同干燥方式下的含量次序為蒸制殺青-烘干法＞曬干法＞低溫烘干法＞陰干法，其在蒸制殺青-烘干法中的含量為曬干法、陰干法、低溫烘干法的1.66、2.12、1.99倍。2-甲基丁醇[32]具有葡萄味、果味，在不同干燥方式下含量次序為低溫烘干法＞曬干法＞陰干法＞蒸制殺青-烘干法，其在低溫烘干法中的含量為曬干法、陰干法、蒸制殺青-烘干法的1.31、1.72、6.38倍。

酯類物質(zhì)具有典型的果香和花香[33]，醋酸乙酯、乙酸己酯、乙酸甲酯均在低溫烘干法中含量最高，曬干法中含量次之，陰干法與蒸制殺青-烘干法中含量較低。乙酸乙酯還具有抗炎、抗血栓、保護急性肝損傷等作用[34]。α-蒎烯具有樹脂香、松香[35]，在不同干燥方式下含量次序為陰干法＞曬干法＞低溫烘干法＞蒸制殺青-烘干法，其在陰干法中的含量為曬干法、低溫烘干法、蒸制殺青-烘干法的2.70、3.88、15.52倍。

4 討論

本研究首次將GC-IMS技術(shù)應(yīng)用于不同干燥方式下金銀花的揮發(fā)性成分分析?；贕C-IMS技術(shù)可以快速、準確的對金銀花不同干燥方式下?lián)]發(fā)性成分進行鑒別，本研究在金銀花中共鑒別出48種成分，包括醛類、醇類、酮類、吡嗪類、吡咯類、呋喃類、酯類、酸類。GC-IMS指紋圖譜直觀的看出不同干燥方式下?lián)]發(fā)性成分的差異。

GC-IMS技術(shù)可以對揮發(fā)性成分進行定性定量分析，揮發(fā)性成分的變化與金銀花的風味和藥效密切相關(guān)。呋喃類成分具有果香、甜味，吡咯類成分具有花香，吡嗪類成分具有烤香、堅果香、咖啡香，酮類成分具有青香、藥香，醛類成分具有果香、花香及青香，醇類成分具有花香、青香、藥草香，酯類成分具有花香和果香[36-38]。

通過對不同干燥方式下差異揮發(fā)性成分的含量對比分析，發(fā)現(xiàn)高溫蒸制殺青處理的金銀花中醛類、醇類、吡嗪類、呋喃類、吡咯類、酯類揮發(fā)性成分種類減少、含量大幅度降低，風味明顯變淡。造成此現(xiàn)象的原因一方面可能是熱敏感、易降解的成分經(jīng)高溫蒸制殺青后損失；另一方面可能是高溫蒸制過程抑制了金銀花風味物質(zhì)合成酶的活性[39-40]。曬干法中金銀花揮發(fā)性成分種類較多，總體含量較高，保留風味最佳，因此，曬干法是將金銀花用于香精調(diào)制或者卷煙、食醋等日化品加香的最佳干燥方式[41-42]。通過差異分析發(fā)現(xiàn)陰干與低溫烘干法之間差異較小，這2種方法保留風味物質(zhì)的能力優(yōu)于蒸制殺青-烘干法，但次于曬干法。

綜上所述，本研究建立了不同干燥方式下金銀花揮發(fā)性成分的GC-IMS快速分析方法，通過綜合比較不同干燥方式對金銀花揮發(fā)性成分種類、含量以及外觀形態(tài)的影響，確定曬干法最適合保留金銀花的風味，是將金銀花制作芳香健康功效的食品、香料的最佳干燥方式。本研究為金銀花干燥方式的優(yōu)化、芳香健康功效及風味品質(zhì)的研究提供科學理論指導(dǎo)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突