基于“LncRNA MALAT1-巨噬細(xì)胞焦亡”新視角探討加味四妙勇安湯促進(jìn)大鼠糖尿病足潰瘍愈合機(jī)制

王慶美， 徐鵬， 付媛媛， 潘銀燕

（1.山東省立第三醫(yī)院，山東濟(jì)南 250031；2.解放軍第九六〇醫(yī)院，山東濟(jì)南 250031）

最新系統(tǒng)回顧性分析表明，糖尿病病程超過(guò)10年的患者易并發(fā)糖尿病足，而糖尿病足患者常常同時(shí)合并局部組織感染、皮膚病變、神經(jīng)病變以及內(nèi)皮血管病變，因此臨床治療難度較大；如果不及時(shí)進(jìn)行妥善處理，則會(huì)加重患者病情，甚至導(dǎo)致截肢或者死亡[1-2]。但糖尿病及糖尿病足的病理機(jī)制至今尚未完全闡明。

隨著人類基因?qū)W研究技術(shù)的發(fā)展，長(zhǎng)鏈非編碼RNAs（Long non-coding RNAs，LncRNAs）逐漸進(jìn)入人們視野并且引起廣泛關(guān)注，被認(rèn)為是糖尿病發(fā)病各個(gè)環(huán)節(jié)的關(guān)鍵調(diào)控因子[3]。LncRNA肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（MALAT1）在機(jī)體多種組織內(nèi)廣泛表達(dá)，最初研究發(fā)現(xiàn)，MALAT1與腫瘤發(fā)展關(guān)系密切，近年研究表明，LncRNA MALAT1與糖尿病及糖尿病并發(fā)癥之間亦存在密切聯(lián)系。LncRNA MALAT1的沉默表達(dá)可以明顯緩解糖尿病誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管化、血管的滲漏與視網(wǎng)膜炎癥等[4]。由此推斷其在糖尿病潰瘍愈合中可能亦發(fā)揮重要作用。

細(xì)胞焦亡（pyroptosis）是一種由病原體感染或者內(nèi)源性損傷等引起的溶解性細(xì)胞死亡，可分泌多種炎癥細(xì)胞因子進(jìn)而引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[5]。對(duì)于感染性疾病，發(fā)生細(xì)胞焦亡是細(xì)胞自身的保護(hù)性反應(yīng)，但是過(guò)度的細(xì)胞焦亡往往會(huì)引發(fā)組織進(jìn)一步損傷及其他炎癥反應(yīng)，甚至導(dǎo)致機(jī)體死亡。最新的研究[6-7]表明，巨噬細(xì)胞焦亡可以引發(fā)糖尿病足白細(xì)胞介素（IL）-18、IL-1β的釋放，導(dǎo)致不可控炎癥反應(yīng)，促進(jìn)糖尿病足的病理發(fā)展。

糖尿病足歸屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”“脫疽”的范疇，致病機(jī)理不外乎氣虛、陰虛、氣血凝滯、火毒、濕熱等因素，常遵循去腐生肌、標(biāo)本兼治的原則[8-9]。加味四妙勇安湯具有活血止痛、清熱解毒的功效，已經(jīng)被證實(shí)在糖尿病足潰瘍愈合中起到積極作用。有學(xué)者指出，四妙勇安湯可以促進(jìn)糖尿病足潰瘍患者創(chuàng)面血管的新生，促進(jìn)創(chuàng)面愈合[10]；另外在常規(guī)內(nèi)科治療的基礎(chǔ)上，服用加味四妙勇安湯對(duì)于小面積的糖尿病足部潰瘍有較好的促愈合效果[11]。但目前關(guān)于加味四妙勇安湯促創(chuàng)面愈合僅僅體現(xiàn)在臨床效果評(píng)比，而對(duì)于其治療的內(nèi)在分子調(diào)控機(jī)制尚不明確。因此，本研究擬通過(guò)構(gòu)建糖尿病足潰瘍大鼠模型，探討加味四妙勇安湯對(duì)LncRNA MALAT1-巨噬細(xì)胞焦亡軸的影響，以期闡明其在糖尿病足潰瘍愈合中的分子作用機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 40只SPF級(jí)6周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量170～220 g，由山東省立第三醫(yī)院動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：110322211100491267。飼養(yǎng)環(huán)境：普通飼料單籠飼養(yǎng)，室溫控制在18～23℃，大鼠自由攝食、飲水。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案已獲得山東省立第三醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

1.2 藥物 加味四妙勇安湯組成：肉桂4.5 g，黃連8 g，薏苡仁27 g，土茯苓30 g，川牛膝13 g，丹參10 g，生甘草6 g，金銀花30 g，玄參10 g，當(dāng)歸10 g，蒲黃8 g，垂盆草30 g。所有中藥材均購(gòu)自山東省立第三醫(yī)院中醫(yī)藥藥房。將上述中藥材加水常規(guī)煮煎，取藥汁，備用。

1.3 試劑與儀器 LncRNA MALAT1敲除質(zhì)粒siLncRNA MALAT1（上海生工生物工程股份有限公司）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美國(guó)Sigma公司）；白細(xì)胞介素（IL）-18、IL-1β的酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司）；Nod樣受體家族含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3（NLRP3）抗體、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）抗體、CD206抗體、消皮素D（GSDMD）抗體、pro-Caspase-1抗體、核轉(zhuǎn)錄因子kappaB（NF-κB）p65抗體、磷酸甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（美國(guó)Sigma公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測(cè)定盒、十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）凝膠、電泳緩沖液、聚偏氟乙烯（PVDF）膜、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）顯影試劑盒（美國(guó)ABC公司）。血糖測(cè)試儀（美國(guó)強(qiáng)生公司）；RT-PCR測(cè)試儀、RT-100酶標(biāo)儀、Mini PRO型電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；臺(tái)式高速離心機(jī)、微量可調(diào)節(jié)儀器（美國(guó)Beckman公司）。

1.4 分組與造模[12-13]將40只SD大鼠隨機(jī)分為2組，正常組10只，2型糖尿病造模組30只。2組大鼠實(shí)驗(yàn)前均禁食24 h，2型糖尿病造模組大鼠于左下腹部一次性腹腔注射65.0 mg/kg STZ（由pH4.2檸檬酸鈉緩沖溶液配制成10 mg/mL溶液），正常組左下腹部一次性腹腔注射等體積檸檬酸鈉緩沖溶液。1周后，2型糖尿病造模組大鼠均出現(xiàn)多飲、多尿的現(xiàn)象，尾靜脈抽血檢測(cè)空腹血糖，若空腹血糖為12.0 mmol/L及以上則判斷2型糖尿病模型構(gòu)建成功。然后于上述符合要求的大鼠足背部切除一塊矩形區(qū)域的皮膚組織，建立糖尿病足潰瘍模型。最后將糖尿病足潰瘍模型大鼠分為模型組、siLncRNA MALAT1組、加味四妙勇安湯組，每組10只。

1.5 給藥 造模結(jié)束后開(kāi)始給藥。加味四妙勇安湯組大鼠給予加味四妙勇安湯20.0 g·kg-1·d-1[14]灌胃，每日1次，共8周；siLncRNA MALAT1組大鼠于足部潰瘍組織注射siLncRNA MALAT1慢病毒質(zhì)粒（2×1010pfu，0.5 mL/只），每日1次，連續(xù)注射1周；模型組與正常組給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，共8周。

1.6 觀察指標(biāo)與方法

1.6.1 觀察大鼠足潰瘍創(chuàng)面組織愈合情況 給藥前，給藥4、8周后，觀察大鼠足潰瘍創(chuàng)面組織血管、炎癥、面積等變化情況。

1.6.2 計(jì)算大鼠足潰瘍創(chuàng)面愈合面積百分比 給藥前、給藥8周后，采用計(jì)算機(jī)處理的透明膜適蹤法紀(jì)錄大鼠足潰瘍部位，測(cè)量創(chuàng)面面積，計(jì)算創(chuàng)面愈合面積百分比，創(chuàng)面愈合面積百分比=（創(chuàng)面初始面積-創(chuàng)面殘余面積）/創(chuàng)面初始面積×100%。

1.6.3 ELISA法檢測(cè)大鼠血清IL-18、IL-1β水平 給藥8周后12 h禁食，摘眼球取血，室溫下靜置2.5 h，4℃離心分離上清液。設(shè)定ELISA各孔位，按照試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行操作，應(yīng)用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔內(nèi)光密度（OD）值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血清中IL-18、IL-1β含量。

1.6.4 免疫熒光化學(xué)染色法檢測(cè)足部組織M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白（CD206）、ASC、NLRP3表達(dá) 取正常組大鼠足背部正常皮膚組織和其他各組大鼠足潰瘍創(chuàng)面組織，制備石蠟切片，脫蠟脫水，抗原修復(fù)，血清封閉。加入稀釋的CD206抗體（體積比1∶100）、ASC抗體（體積比1∶100）、NLRP3（體積比1∶100），4℃孵育過(guò)夜。用磷酸鹽-Tween-20緩沖液（PBST）沖洗后，滴加DAPI避光顯色5 min，沖洗后復(fù)染細(xì)胞核，用含抗熒光淬滅劑的封液進(jìn)行封片。在熒光顯微鏡下觀察采集的圖像，測(cè)量積分光密度（IOD）和面積（Area）并計(jì)算出平均光密度（AOD）值，AOD=IOD/Area。

1.6.5 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測(cè)足部組織LncRNA MALAT1表達(dá) 取正常組大鼠足背部正常皮膚組織和其他各組大鼠足潰瘍創(chuàng)面組織，采用TRIzol試劑盒抽提總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將RNA合成cDNA，按照qRT-PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書配制反應(yīng)體系，采用2-ΔΔCt值表示LncRNAMALAT1的表達(dá)水平。LncRNA MALAT1上游引物序列為5’-ATTGGGTCCTGGACCTGGAATG C-3’，下游引物序列為5’-ACTGGCTGGACCCTG GAAATCTG-3’；GAPDH上游引物序列為5’-TCG TGGACCTGACCTGGACCTGAAACTG-3’，下游引物序列為5’-ATCTCCTTCCTGGAACTGGACCTGG C-3’。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，循環(huán)1次；95℃變性15 s，60℃退火60 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)40次。

1.6.6 Western Blot法檢測(cè)足部組織細(xì)胞焦亡關(guān)鍵蛋白表達(dá) 取正常組大鼠足背部正常皮膚組織和其他各組大鼠足潰瘍創(chuàng)面組織，加入RIPA裂解液后進(jìn)行組織勻漿裂解，提取蛋白質(zhì)，定量、上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白，將檢測(cè)蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%的脫脂牛奶封閉2.5 h，TBST清洗3次；將PVDF膜與一抗在4℃孵育過(guò)夜，用TBST清洗3次；PVDF膜與熒光二抗孵育1.5 h，經(jīng)TBST清洗3次。采用紅外成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描，采用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。其中，一抗GSDMD稀釋體積比例為1∶1 000、NLRP3為1∶500、pro-Caspase-1為1∶500、NF-κBp65為1∶1 000、GAPDH為1∶1 000。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法 采用GraphPad Prism8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠足潰瘍創(chuàng)面愈合情況比較 圖1結(jié)果顯示：治療前，各組大鼠足潰瘍創(chuàng)面布滿充血血管，炎癥膿性反應(yīng)明顯；隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，各組大鼠創(chuàng)面面積減小，其中，siLncRNA MALAT1組、加味四妙勇安湯組大鼠創(chuàng)面面積較模型組減小。

圖1 各組大鼠治療前后足潰瘍創(chuàng)面愈合情況比較（×50）Figure 1 Comparison of wound healing of foot ulcers among various groups of rats before and after treatment（×50）

2.2 各組大鼠足潰瘍創(chuàng)面愈合面積百分比比較表1結(jié)果顯示：各組大鼠治療8周后，足潰瘍創(chuàng)面愈合面積百分比較治療4周后明顯升高（P＜0.05）；與模型組同期比較，siLncRNA MALAT1組、加味四妙勇安湯組大鼠足潰瘍創(chuàng)面愈合面積百分比升高（P＜0.05）；2個(gè)治療組間該指標(biāo)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠足潰瘍創(chuàng)面愈合面積百分比比較Table 1 Comparison of the percentage of wound healing area of foot ulcers among various groups of rats （±s，%）

表1 各組大鼠足潰瘍創(chuàng)面愈合面積百分比比較Table 1 Comparison of the percentage of wound healing area of foot ulcers among various groups of rats （±s，%）

注：①P＜0.05，與同組治療4周后比較；②P＜0.05，與模型組同期比較

組別模型組siLncRNAMALAT1組加味四妙勇安湯組鼠數(shù)/只10 10 10創(chuàng)面愈合面積百分比治療4周后24.78±2.34 43.68±3.24②47.08±3.78②治療8周后38.90±4.23①68.90±4.55①②75.46±8.63①②P值0.045 0.020 0.008

2.3 各組大鼠足部組織LncRNA MALAT1表達(dá)比較 表2結(jié)果顯示：與正常組足背部正常皮膚組織比較，模型組大鼠足潰瘍創(chuàng)面組織LncRNA MALAT1表達(dá)水平明顯上升（P＜0.05）；與模型組比較，siLncRNA MALAT1組、加味四妙勇安湯組LncRNA MALAT1表達(dá)水平均下降（P＜0.05）；2個(gè)治療組間該指標(biāo)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠足部組織LncRNA MALAT1表達(dá)比較Table 2 Comparison of tissue LncRNA MALAT1 expression in the feet among various groups of rats （±s）

表2 各組大鼠足部組織LncRNA MALAT1表達(dá)比較Table 2 Comparison of tissue LncRNA MALAT1 expression in the feet among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組siLncRNA MALAT1組加味四妙勇安湯組鼠數(shù)/只10 10 10 10 LncRNA MALAT1（2-ΔΔCt）0.428±0.017 1.344±0.233①0.785±0.150②0.640±0.102②

2.4 各組大鼠血清中IL-18、IL-1β水平比較 表3結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清IL-18、IL-1β水平顯著上升（P＜0.05）；與模型組比較，siLncRNA MALAT1組、加味四妙勇安湯組血清IL-18、IL-1β水平均下降（P＜0.05）；2個(gè)治療組間各指標(biāo)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠血清中白細(xì)胞介素（IL）-18、IL-1β水平比較Table 3 Comparison of IL-18 and IL-1βlevels in serum among various groups of rats （±s，ng·L-1）

表3 各組大鼠血清中白細(xì)胞介素（IL）-18、IL-1β水平比較Table 3 Comparison of IL-18 and IL-1βlevels in serum among various groups of rats （±s，ng·L-1）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組siLncRNAMALAT1組加味四妙勇安湯組鼠數(shù)/只10 10 10 10 IL-18 3.26±1.52 25.08±4.59①19.44±3.21②14.55±3.40②IL-1β 13.82±4.55 63.45±11.78①50.67±6.78②44.35±5.22②

2.5 各組大鼠足部組織M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白（CD206）、ASC、NLRP3表達(dá)水平比較 表4結(jié)果顯示：與正常組足背部正常皮膚組織比較，模型組大鼠足潰瘍創(chuàng)面組織ASC、NLRP3蛋白表達(dá)水平均明顯上升，CD206蛋白表達(dá)水平下降（均P＜0.05）；與模型組比較，siLncRNA MALAT1組、加味四妙勇安湯組ASC、NLRP3蛋白表達(dá)水平下降，CD206表達(dá)水平上升（P＜0.05）；2個(gè)治療組間各指標(biāo)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示LncRNA MALAT1敲除及加味四妙勇安湯灌胃均可以上調(diào)糖尿病大鼠足潰瘍創(chuàng)面組織M2型巨噬細(xì)胞比例，同時(shí)下調(diào)巨噬細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞焦亡關(guān)鍵因子的表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞焦亡能力。

表4 各組大鼠足部組織M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白（CD206）、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）、Nod樣受體家族含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3（NLRP3）平均光密度比較Table 4 Comparison of the average optical density of tissue M2 macrophage marker protein（CD206），ASC and NLRP3 in the feet among various groups of rats （±s）

表4 各組大鼠足部組織M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白（CD206）、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）、Nod樣受體家族含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3（NLRP3）平均光密度比較Table 4 Comparison of the average optical density of tissue M2 macrophage marker protein（CD206），ASC and NLRP3 in the feet among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組siLncRNA MALAT1組加味四妙勇安湯組鼠數(shù)/只10 10 10 10 CD206平均光密度0.254±0.012 0.012±0.002①0.155±0.014②0.187±0.019②ASC平均光密度0.023±0.003 0.438±0.017①0.245±0.010②0.203±0.016②NLRP3平均光密度0.014±0.003 0.489±0.021①0.288±0.012②0.187±0.018②

2.6 各組大鼠足部組織GSDMD、NLRP3、pro-Caspase-1、NF-κBp65蛋白表達(dá)比較 圖2結(jié)果顯示：與正常組足背部正常皮膚組織比較，模型組大鼠足潰瘍創(chuàng)面組織GSDMD、NLRP3、pro-Caspase-1、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平均明顯上升（P＜0.05）；與模型組比較，siLncRNA MALAT1組、加味四妙勇安湯組GSDMD、NLRP3、pro-Caspase-1、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平均下降（P＜0.05）；2個(gè)治療組間各指標(biāo)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示LncRNA MALAT1敲除及加味四妙勇安湯灌胃均可以下調(diào)大鼠足潰瘍創(chuàng)面組織內(nèi)細(xì)胞焦亡蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞焦亡的發(fā)生。

圖2 各組大鼠足部組織消皮素D（GSDMD）、Nod樣受體家族含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3（NLRP3）、pro-Caspase-1、核轉(zhuǎn)錄因子kappaB（NF-κB）p65蛋白表達(dá)比較Figure 2 Comparison of protein expressions of tissue GSDMD，NLRP3，pro-Caspase-1 and NF-κB p65 in the feet among various groups of rats

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，糖尿病足主要是由于消渴日久，氣陰兩虛，熱毒、瘀血積聚而導(dǎo)致脈絡(luò)氣血運(yùn)行不暢、肢端失養(yǎng)所致，祛腐生肌、化瘀通脈、清熱解毒以及標(biāo)本兼治為主要治療方法[15-17]。加味四妙勇安湯具有活血化瘀、清熱解毒的功效，方中：黃連、肉桂解毒止痛、助陽(yáng)，川牛膝可以直達(dá)病灶部位，消腫散結(jié)，丹參、蒲黃化瘀止痛，甘草、當(dāng)歸、金銀花、玄參活血止痛、清熱解毒，薏苡仁、土茯苓、垂盆草清熱除濕解毒。本研究結(jié)果表明，加味四妙勇安湯可有效促進(jìn)糖尿病大鼠足潰瘍創(chuàng)面愈合。

研究[18]表明，LncRNA MALAT1參與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程。糖尿病患者血清LncRNA MALAT1表達(dá)明顯升高[19]；內(nèi)皮細(xì)胞沉默LncRNA MALAT1后，其炎性因子IL-6、TNF-α及細(xì)胞黏附因子等水平均下降[20]；高血糖引起的視網(wǎng)膜病變內(nèi)皮細(xì)胞中LncRNA MALAT1表達(dá)亦明顯上升[21]。IL-18是活化的單核巨噬細(xì)胞分泌的一種前炎癥因子，在2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起中心介質(zhì)作用，在2型糖尿病前期即出現(xiàn)升高，可作為2型糖尿病發(fā)生、病情變化及預(yù)后的預(yù)測(cè)因子[22]。IL-1β是NLRP3炎性小體活化后產(chǎn)生的主要炎性分子。IL-1β在2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，被認(rèn)為是2型糖尿病的重要驅(qū)動(dòng)者。在慢性高血糖狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)IL-1β持續(xù)升高，其受體表達(dá)上調(diào)，既可引起β細(xì)胞凋亡及胰島素抵抗，又可和其他炎性因子如腫瘤壞死因子（TNF）等協(xié)同干擾體內(nèi)葡萄糖代謝平衡[23]。而糖代謝紊亂作為危險(xiǎn)信號(hào)，進(jìn)一步激活I(lǐng)L-1β的平臺(tái)NLRP3炎性小體[22]。本研究結(jié)果顯示，糖尿病大鼠足潰瘍創(chuàng)面組織LncRNA MALAT1表達(dá)升高，血清炎癥因子IL-18、IL-1β、NLRP3水平升高，而加味四妙勇安湯的干預(yù)可以明顯下調(diào)足潰瘍創(chuàng)面組織LncRNA MALAT1的表達(dá)，降低血清IL-18、IL-1β、NLRP3水平，表明足潰瘍創(chuàng)面組織存在明顯的炎癥反應(yīng)，加味四妙勇安湯抑制糖尿病足潰瘍大鼠創(chuàng)面炎癥反應(yīng)主要是通過(guò)抑制LncRNA MALAT1的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

適度的炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用，若炎癥反應(yīng)發(fā)生級(jí)聯(lián)放大出現(xiàn)失控，則會(huì)導(dǎo)致機(jī)體自身免疫系統(tǒng)的破壞，促進(jìn)疾病的發(fā)展。炎癥小體本質(zhì)上屬于多聚蛋白復(fù)合物，是控制炎癥反應(yīng)進(jìn)程和協(xié)調(diào)機(jī)體免疫功能的信號(hào)平臺(tái)，最新證據(jù)[24-25]表明，炎癥小體NLRP3所介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在糖尿病足發(fā)生及發(fā)展中扮演了重要的角色。在巨噬細(xì)胞焦亡過(guò)程中，炎癥小體活化是必要因素，諸多危險(xiǎn)性信號(hào)如內(nèi)毒素（LPS）、活性氧（ROS）產(chǎn)生、溶酶體破裂等均可以被巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)的感受器（NOD-like receptors，NLR）感知并且識(shí)別，進(jìn)而引起IκB發(fā)生磷酸化，調(diào)控下游的NF-κB入核，而NF-κB是誘導(dǎo)IL-1β和NLRP3蛋白合成的關(guān)鍵性因子，為進(jìn)一步炎癥小體的組裝提供原材料。ASC是一種由2個(gè)“死亡折疊”結(jié)構(gòu)域組成的蛋白，擁有上述結(jié)構(gòu)域的ASC可以作為接頭蛋白將通路上游的炎癥傳感器分子進(jìn)行組裝成完整的炎癥小體，參與細(xì)胞焦亡[25-26]。GSDMD蛋白是Caspase-1和細(xì)胞焦亡主要的底物成分之一，與細(xì)胞焦亡亦密切相關(guān)[27]。本研究結(jié)果顯示，糖尿病足潰瘍模型建立后，足潰瘍創(chuàng)面組織NF-κB p65、IL-1β、pro-Caspase-1、NLRP3、ASC、GSDMD等細(xì)胞焦亡關(guān)鍵因子表達(dá)均明顯上調(diào)，提示糖尿病足潰瘍的發(fā)病與巨噬細(xì)胞焦亡密切相關(guān)。而LncRNA MALAT1敲除及加味四妙勇安湯干預(yù)均可以抑制足潰瘍創(chuàng)面組織NF-κBp65、IL-1β、pro-Caspase-1、NLRP3、ASC、GSDMD等細(xì)胞焦亡關(guān)鍵因子上調(diào)的趨勢(shì)，下調(diào)其表達(dá)，提示LncRNA MALAT1參與糖尿病足潰瘍大鼠創(chuàng)面巨噬細(xì)胞焦亡過(guò)程，且受加味四妙勇安湯調(diào)控。

CD206是M2型巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，其表達(dá)量可以反映M2型巨噬細(xì)胞的組分及比例[28]。本研究結(jié)果顯示，糖尿病足潰瘍模型大鼠CD206表達(dá)較正常組明顯下降，表明模型建立后所蓄積的炎癥反應(yīng)可能是M2型巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化所致。M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量減少導(dǎo)致促炎性的NLRP3、NF-κB表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步招募ASC參與NLRP3的合成，這亦說(shuō)明，糖尿病足潰瘍模型大鼠創(chuàng)面組織巨噬細(xì)胞發(fā)生了焦亡反應(yīng)。給予加味四妙勇安湯干預(yù)后，創(chuàng)面組織LncMALAT1表達(dá)受到抑制，使得CD206表達(dá)比例提升，巨噬細(xì)胞向M2抗炎型轉(zhuǎn)化，NLRP3、NF-κB表達(dá)減弱，巨噬細(xì)胞焦亡比例降低，進(jìn)而減少炎性因子IL-18、IL-1β的釋放，最終促進(jìn)大鼠糖尿病足潰瘍創(chuàng)面的愈合。

綜上所述，加味四妙勇安湯可通過(guò)下調(diào)創(chuàng)面組織LncRNA MALAT1表達(dá)抑制巨噬細(xì)胞焦亡，從而促進(jìn)糖尿病足潰瘍的愈合，效果顯著，值得進(jìn)一步推廣應(yīng)用。