細(xì)菌整體代謝與新抗生素及抗生素增效劑靶標(biāo)

劉聰 馮佳妮 李瑋瑋 朱偉偉 薛云新 王岱 趙西林

(廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院分子疫苗學(xué)和分子診斷學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門 361102)

第二次世界大戰(zhàn)中青霉素的問世[1]，使得數(shù)以萬計(jì)的戰(zhàn)傷士兵免受傷口感染，抗菌素自此開始進(jìn)入人們的視線。隨著大量抗菌素被發(fā)現(xiàn)，抗菌素時(shí)代的帷幕由此掀開?？股厮坪醭蔀榱艘粋€(gè)被稱為“魔術(shù)子彈”的萬能靈藥而被大量使用甚至濫用，由此引發(fā)的細(xì)菌耐藥越來越嚴(yán)重，多重耐藥菌乃至廣泛耐藥超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn)使得現(xiàn)代抗感染治療無藥可用。在臨床耐藥分離株中，常見的大腸埃希菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)及鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)的比例大幅上升[2]。全世界的研究者試圖探明抗生素的殺菌機(jī)制，以找到對(duì)抗耐藥細(xì)菌的武器，然而抗生素殺菌機(jī)理的揭示遠(yuǎn)比發(fā)現(xiàn)抗生素本身的時(shí)間要晚：2007年《Cell》刊發(fā)的一篇論著首次提出了經(jīng)典抗生素普遍依靠活性氧(reactive oxygen species， ROS)來介導(dǎo)殺菌的觀點(diǎn)，該觀點(diǎn)過去十幾年里已獲得廣泛認(rèn)可并在隨后的研究里不斷被證實(shí)[3]。

鑒于ROS對(duì)抗生素殺菌具有重要作用，越來越多的研究聚焦于如何使細(xì)菌產(chǎn)生更多的ROS來促進(jìn)殺傷。本文主要綜述了細(xì)菌胞內(nèi)代謝節(jié)點(diǎn)的擾動(dòng)對(duì)中央碳代謝流量及下游ROS生成的影響，試圖從整體代謝的角度尋找潛在的抗生素靶標(biāo)或增效佐劑。

1 抗生素介導(dǎo)的細(xì)菌死亡與胞內(nèi)ROS的聯(lián)系

所有好氧生物都離不開氧氣，因?yàn)檫@些生物體內(nèi)的有氧代謝都依賴O2參與來生成生命所需的能量以及各種代謝產(chǎn)物，但同時(shí)伴隨ROS產(chǎn)生。ROS主要包括過氧化氫(H2O2)、有機(jī)氫過氧化物(ROOH)、超氧陰離子自由基(O2·?)、羥自由基(·OH)等；ROS有多種來源，包括有氧呼吸中的電子傳遞鏈、過渡金屬離子及一些外界因素刺激(如電離輻射、化學(xué)氧化劑)，由此可見，ROS的產(chǎn)生難以避免[4]。ROS同時(shí)是一把雙刃劍，既可作為多效信號(hào)分子調(diào)節(jié)代謝網(wǎng)絡(luò)，也可能導(dǎo)致生理毒性，例如，ROS能靶向磷酸酶、直接影響激酶信號(hào)傳導(dǎo)[5]，還能氧化破壞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA?？股氐臍⒕腔谶^量ROS對(duì)胞內(nèi)各種生物大分子的損傷，抗生素引發(fā)細(xì)菌累積的胞內(nèi)ROS、介導(dǎo)了細(xì)菌死亡的觀點(diǎn)目前已被廣泛認(rèn)同[6-9]。在結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)中，不同細(xì)胞亞群在抗生素作用下累積的胞內(nèi)ROS水平具有異質(zhì)性，從而具有不同的藥物敏感性：結(jié)核分枝桿菌會(huì)產(chǎn)生表型不同但遺傳一致的兩種亞群，分為短型菌(SC)和正常菌(NC)，通過密度梯度離心分離后，用異煙肼處理，結(jié)果表明NC亞群的胞內(nèi)ROS(羥基自由基和超氧化物)水平明顯低于SC亞群，與此對(duì)應(yīng)，NC亞群在藥物處理后的存活率明顯高于SC亞群；此外在藥物處理前將硫脲(ROS清除劑)添加至液體培養(yǎng)基，能夠抑制抗生素對(duì)細(xì)菌的殺傷作用[10](表1)。這些表明，抗生素介導(dǎo)產(chǎn)生的致死劑量ROS是殺菌的關(guān)鍵物質(zhì)。

表1 調(diào)節(jié)抗生素功效的小分子及其干擾的代謝途徑Tab.1 Small molecules regulating antibiotic efficacy by interfering metabolic events

一項(xiàng)針對(duì)抗生素誘導(dǎo)后胞內(nèi)代謝組的研究支持了上述觀點(diǎn)[11]。研究者采用3大類經(jīng)典抗生素(諾氟沙星、卡那霉素及氨芐西林)，使用不會(huì)使細(xì)胞裂解但又足夠產(chǎn)生高度損傷的抗生素濃度，分別處理細(xì)胞30、60和90 min，然后用高效液相色譜/氣相色譜/電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)胞內(nèi)代謝物的變化，層次聚類分析3類抗生素共同引起的變量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于未處理的細(xì)胞，經(jīng)抗生素處理的細(xì)胞培養(yǎng)物，三羧酸循環(huán)中檸檬酸鹽和琥珀酸鹽的濃度明顯增加，NAD+及其合成前體的含量升高，4-氨基嘧啶并咪唑的濃度也增加，由此說明氧化磷酸化水平的上升及三羧酸循環(huán)的加強(qiáng)；另外，核苷酸濃度下降、黃嘌呤增加，可能意味著DNA受損的程度增加；谷胱甘肽池也發(fā)生了改變，還原型的濃度部分升高，氧化型的則顯著增加，說明胞內(nèi)氧化應(yīng)激呈現(xiàn)較高水平；并且，一些有毒代謝產(chǎn)物的濃度上升，包括被金屬攻擊產(chǎn)生羰基化的蛋白、Fenton反應(yīng)產(chǎn)物參與情況下由脫氧核糖或亞油酸生成的丙二醛[12]、被ROS攻擊形成的8-氧代-7,8-二氫鳥嘌呤。綜上整個(gè)代謝組的數(shù)據(jù)可知，抗生素處理的細(xì)胞正在經(jīng)受大量的ROS攻擊。

無獨(dú)有偶，洪宇植等[13]發(fā)現(xiàn)，如果在ROS累積到促使細(xì)胞死亡的濃度閾值前、尋找到合適時(shí)間窗口及時(shí)將ROS清除，可以使帶有原始靶標(biāo)損傷的細(xì)胞避免死亡。研究者使用新鮮培養(yǎng)基將大腸埃希菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)前期，然后使用1×MIC(minimum inhibitory concentration)濃度的萘啶酸處理、誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生胞內(nèi)ROS，然后離心菌液，使用0.9%的生理鹽水重懸細(xì)胞，再次離心重懸，最后將洗去藥物的細(xì)胞分別鋪于LB瓊脂板和含有0.5×MIC聯(lián)吡啶(ROS清除劑)的LB瓊脂板，則后者瓊脂板上的細(xì)胞存活率提高了約30倍。由此可見，即便在移除了抗生素等原始致死壓力因子后，ROS介導(dǎo)的殺菌進(jìn)程仍能持續(xù)進(jìn)行；無論在抗生素治療中或在治療后，及時(shí)抑制ROS累積和清除過量ROS，都可能導(dǎo)致抗生素殺傷的失敗。

2 胞內(nèi)的氧化應(yīng)激系統(tǒng)

細(xì)菌胞內(nèi)的氧化應(yīng)激主要由OxyR和SoxRS兩個(gè)組分響應(yīng)調(diào)控，前者響應(yīng)來自過氧化氫的壓力，后者響應(yīng)來自超氧陰離子自由基的壓力[14]，另外一般壓力調(diào)節(jié)響應(yīng)因子RpoS及受其調(diào)控的下游相關(guān)蛋白也參與了氧化應(yīng)激[15-16]。MqsR/MqsA毒素/抗毒素系統(tǒng)參與調(diào)控氧化應(yīng)激時(shí)的RpoS水平，正常生理狀態(tài)下，MqsA結(jié)合至rpoS啟動(dòng)子區(qū)域，抑制其表達(dá)；而在受到氧化壓力后，Lon蛋白酶會(huì)切割MqsA，使rpoS啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，RpoS識(shí)別下游氧化應(yīng)激蛋白的啟動(dòng)子，招募RNA聚合酶，增強(qiáng)這些蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平[14]。RpoS調(diào)控的主要氧化應(yīng)激蛋白有Dps(DNA結(jié)合蛋白，可以氧化游離的亞鐵離子，生成水合三氧化二鐵，避免了Fenton反應(yīng)的發(fā)生)，KatE(過氧化氫酶II，負(fù)責(zé)清除過氧化氫)，XthA(核酸外切酶III，可以修復(fù)過氧化氫誘導(dǎo)的DNA斷裂)和SodC(超氧化物歧化酶C，負(fù)責(zé)將超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫和水)。

OxyR蛋白可呈現(xiàn)還原態(tài)和氧化態(tài)[17]，兩種狀態(tài)均能結(jié)合DNA，但還原態(tài)OxyR抑制靶基因轉(zhuǎn)錄，而氧化態(tài)則激活轉(zhuǎn)錄。在正常細(xì)胞生理狀態(tài)下，還原態(tài)OxyR結(jié)合于oxyR啟動(dòng)子區(qū)域，抑制自身轉(zhuǎn)錄；當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激時(shí)，OxyR轉(zhuǎn)為氧化形式，激活oxyR轉(zhuǎn)錄，大量OxyR表達(dá)后被氧化，進(jìn)而結(jié)合到下游氧化應(yīng)激基因的啟動(dòng)子區(qū)域，激活其轉(zhuǎn)錄。氧化態(tài)OxyR調(diào)控的主要氧化應(yīng)激蛋白有KatG(過氧化氫酶Ⅰ，負(fù)責(zé)清除過氧化氫)和AhpC(烷基過氧化氫還原酶，負(fù)責(zé)清除過氧化氫)。

SoxRS系統(tǒng)主要由SoxR、SoxS及其下游蛋白組成[18]，在正常細(xì)胞生理狀態(tài)下，SoxR處于還原態(tài)、并與soxS啟動(dòng)子結(jié)合，但無法激活該啟動(dòng)子，soxS此時(shí)處于微弱表達(dá)狀態(tài)以應(yīng)對(duì)正常代謝產(chǎn)生的低水平ROS。當(dāng)ROS水平和正常代謝的穩(wěn)態(tài)被打破，SoxR作為超氧陰離子自由基的感受器，被激活成相應(yīng)的氧化態(tài)，進(jìn)而激活soxS轉(zhuǎn)錄，隨后大量表達(dá)的SoxS結(jié)合到受其調(diào)控的系列下游基因啟動(dòng)子區(qū)域，包括Nfo(核酸內(nèi)切酶IV，具有嘌呤/嘧啶AP位點(diǎn)內(nèi)切活性)、SodA(超氧化物歧化酶A，能解毒超氧陰離子，減輕氧化損傷)和Zwf(6-磷酸葡萄糖脫氫酶，可以增強(qiáng)磷酸戊糖代謝通路，生成NADPH，逆轉(zhuǎn)胞內(nèi)過度氧化狀態(tài))。

3 整體代謝與氧化還原穩(wěn)態(tài)

3.1 氧化磷酸化與氧化應(yīng)激

ATP帶有高能磷酸鍵，水解時(shí)釋放能量，用以完成生物體的各種耗能過程，是生物活動(dòng)最直接的能量來源[19]。ATP合成通常有兩種方式，一是底物水平磷酸化，化合物在分解過程中生成高能代謝物，由其將能量傳遞到ADP生成ATP；二是氧化磷酸化，化合物在分解過程中將能量轉(zhuǎn)移至還原性輔酶，輔酶則通過電子傳遞鏈把電子傳遞給氧，同時(shí)逐步釋放能量生成ATP。輔酶中的電子傳遞到氧的過程稱為氧化，ADP生成ATP的過程則稱為磷酸化，這兩個(gè)過程相互耦連，合稱為氧化磷酸化[20]?？股嘏c細(xì)菌胞內(nèi)的靶標(biāo)相互作用，刺激三羧酸循環(huán)產(chǎn)生更多NADH和FADH2，NADH和FADH2則會(huì)過度活化電子傳遞鏈，導(dǎo)致胞內(nèi)生成過多的超氧陰離子，誘發(fā)產(chǎn)生超過胞內(nèi)氧化應(yīng)激體系所能承受的ROS水平，使ROS積累成為一種不可阻擋的級(jí)聯(lián)放大趨勢(shì)，最終氧化破壞胞內(nèi)多種重要大分子(DNA、蛋白質(zhì)、質(zhì)膜)，致使細(xì)菌死亡[21]。

在牛分枝桿菌的研究顯示[22]，異煙肼處理細(xì)菌后，胞內(nèi)ATP含量迅速上升，且與時(shí)間和藥物濃度正相關(guān)。ATP作為電子傳遞鏈狀態(tài)的生理指標(biāo)，其含量異常上升提示細(xì)菌被抗生素處理后電子傳遞鏈處于過度活化狀態(tài)，胞內(nèi)可能處于高度氧化應(yīng)激水平，這種猜測(cè)通過特異探針檢測(cè)胞內(nèi)ROS含量得以驗(yàn)證，藥物處理后確實(shí)引發(fā)了細(xì)菌胞內(nèi)ROS水平的迅速升高。如將異煙肼與靶向分枝桿菌電子傳遞鏈的藥物(Q203或苯達(dá)喹啉)聯(lián)合使用，則顯著削弱了異煙肼介導(dǎo)的ATP增強(qiáng)效應(yīng)，最終抑制了該藥物的殺菌活性(表1)，從而說明異煙肼正是通過靶向細(xì)菌胞內(nèi)氧化磷酸化的代謝途徑來介導(dǎo)殺菌效果。

例4.Shantou,then known as Swatow,was China’s third-largest port after Shanghai and Guangzhou and the port of departure of the Teochew diaspora...(China Daily,2018-05-23)(汕頭，廣州，潮州）

3.2 三羧酸循環(huán)與氧化應(yīng)激支

三羧酸循環(huán)是需氧生物普遍存在的代謝途徑，是糖類、脂質(zhì)、氨基酸的最終代謝途徑，同時(shí)也作為三者之間的樞紐將它們的代謝相互協(xié)同。一分子乙酰輔酶A完整歷經(jīng)三羧酸循環(huán)后會(huì)產(chǎn)生三分子NADH、一分子ATP和一分子FADH2，其中NADH和FADH2會(huì)在電子傳遞鏈釋放ATP，因此有氧呼吸能夠產(chǎn)生更多的能量供生物體進(jìn)行生命活動(dòng)[23]。作為三大類物質(zhì)的聯(lián)系樞紐，三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物草酰乙酸可進(jìn)入糖異生途徑，也可通過轉(zhuǎn)氨基作用生成氨基酸，此外乙酰輔酶A也能參與脂質(zhì)生成，甚至核苷酸代謝也與三羧酸循環(huán)相關(guān)。電子傳遞鏈作為能量代謝的樞紐，其活躍程度也與三羧酸循環(huán)緊密相關(guān)[24-25]。由此可見，三羧酸循環(huán)碳通量的流向也決定了胞內(nèi)氧化應(yīng)激的狀態(tài)。

Collins等[3]研究發(fā)現(xiàn)，使用3大類抗生素(喹諾酮類、氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類)對(duì)大腸埃希菌進(jìn)行藥物處理，胞內(nèi)NAD+/NADH比值相比處理前大幅上升，說明NADH消耗增加，這可能會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)出現(xiàn)較高的氧化應(yīng)激水平；并且，藥物處理后細(xì)胞培養(yǎng)物的胞內(nèi)羥基自由基水平確實(shí)大幅提高。此外，三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生NADH的關(guān)鍵基因敲除后，細(xì)菌能在一定程度抵抗抗生素的殺滅作用，進(jìn)一步說明了三羧酸循環(huán)與胞內(nèi)氧化應(yīng)激具有重要聯(lián)系。因此，“抗生素刺激三羧酸循環(huán)產(chǎn)生致死量的ROS，最終殺滅細(xì)菌”的殺菌機(jī)制被提出。

3.3 糖酵解與氧化應(yīng)激

糖酵解，也稱糖的無氧氧化，是所有利用葡萄糖作為能量物質(zhì)的生物體共有的代謝途徑。完整的糖酵解是以葡萄糖為底物最終生成丙酮酸的反應(yīng)過程，總共包含有7個(gè)可逆和3個(gè)不可逆步驟。一個(gè)葡萄糖分子歷經(jīng)糖酵解后生成2分子丙酮酸和2分子ATP，釋放的能量相對(duì)較少，是不完全的氧化過程[26]，但糖酵解的中間產(chǎn)物直接或間接地參與到胞內(nèi)的還原性物質(zhì)的生物合成途徑，其中包括磷酸戊糖途徑的衍生產(chǎn)物NADPH和谷氨酰胺分解的衍生產(chǎn)物還原型谷胱甘肽。此外，糖酵解的終產(chǎn)物丙酮酸在有氧情況下可以轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)，而三羧酸循環(huán)則是胞內(nèi)ROS的重要來源。由此可知，糖酵解流向是胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的重要決定因素[27]。此外6-磷酸果糖是糖酵解的中間產(chǎn)物，同時(shí)也是肽聚糖的合成前體，而肽聚糖作為細(xì)菌外膜的重要組分，其也是核心碳代謝的主要排放途徑之一。

枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)使用β-內(nèi)酰胺類抗生素(靶向青霉素結(jié)合蛋白，阻斷細(xì)胞壁生成)處理后，導(dǎo)致核心碳代謝傾向于糖酵解的通量增加，引起與之關(guān)聯(lián)的三羧酸循環(huán)的增強(qiáng)，進(jìn)而刺激電子傳遞鏈產(chǎn)生過量ROS、使細(xì)菌死亡；細(xì)菌在通過敲除糖酵解關(guān)鍵基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,gapA)抑制糖酵解途徑后，可以部分抵抗β-內(nèi)酰胺類抗生素的殺滅作用，與此類似，細(xì)菌在糖異生(糖酵解的逆向途徑)碳源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，也獲得了對(duì)藥物的耐受性[28](表1)。由此，研究者證明了糖酵解活性的抑制或逆向流動(dòng)可以補(bǔ)償β-內(nèi)酰胺類抗生素引發(fā)的代謝擾動(dòng)，減少胞內(nèi)的氧化損傷，從而抵抗其殺滅作用。此外，研究者發(fā)現(xiàn)糞腸球菌(Enterococcus faecium)能耐受β-內(nèi)酰胺類抗生素，是因?yàn)槠淙鄙俸粑溚?，即使在糖酵解通量較高的情況下仍不會(huì)產(chǎn)生較高的氧化損傷，從而佐證了上述提出的抗生素耐受原理。

3.4 長(zhǎng)鏈脂肪酸氧化與氧化應(yīng)激

長(zhǎng)鏈脂肪酸是兩性分子，通常由12～20個(gè)碳原子的脂肪烴鏈和一個(gè)末端羧基構(gòu)成，在細(xì)菌胞內(nèi)主要行使出種功能，一是作為能量物質(zhì)為細(xì)菌物質(zhì)代謝提供能量，二是作為細(xì)胞膜組分以磷脂的形式摻入細(xì)胞膜內(nèi)，三是作為信號(hào)分子為胞內(nèi)物質(zhì)代謝傳遞信息[29]。長(zhǎng)鏈脂肪酸是一種良好的儲(chǔ)能物質(zhì)，同等質(zhì)量下長(zhǎng)鏈脂肪酸徹底氧化提供的能量是糖類的兩倍。長(zhǎng)鏈脂肪酸在細(xì)菌胞內(nèi)被活化轉(zhuǎn)變?yōu)橹o-A后主要以β氧化的方式降解，在歷經(jīng)一輪β氧化后生成一分子的乙酰Co-A和少了兩個(gè)碳的新脂酰Co-A，乙酰Co-A進(jìn)入三羧酸循環(huán)為細(xì)胞供能，新脂酰Co-A則可繼續(xù)進(jìn)行新一輪的β氧化。一輪β氧化會(huì)產(chǎn)生一分子的FADH2和NADH，無論是進(jìn)入三羧酸循環(huán)還是β氧化產(chǎn)生的輔酶因子最終都會(huì)在電子傳遞鏈被氧化[30]，而這種能量利用的形式必然會(huì)給細(xì)菌產(chǎn)生氧化還原壓力。

一項(xiàng)大腸埃希菌中的研究顯示[31]，通過只添加脂肪酸作為碳源的培養(yǎng)基篩選獲得的突變株對(duì)脂肪酸具有更高利用率。突變株相較野生型表現(xiàn)出更低的ROS含量，推測(cè)可能是突變株中更低的氧化應(yīng)激水平能夠支持其利用更多的脂肪酸；全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)rpsA發(fā)生了突變，將這種突變導(dǎo)入到野生型細(xì)菌中，同樣導(dǎo)致較低的ROS含量和更高的脂肪酸利用率。此外，細(xì)菌在oxyR敲除后于油酸鈉作為唯一碳源的培養(yǎng)基中表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞生長(zhǎng)缺陷，與之相反，將硫脲(ROS清除劑)添加至培養(yǎng)基后，該突變菌對(duì)脂肪酸的利用率明顯提高。綜上所述，細(xì)菌利用脂肪酸作為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)代謝時(shí)會(huì)面臨較高的氧化應(yīng)激壓力。

3.5 磷酸戊糖途徑與氧化應(yīng)激

一項(xiàng)大腸埃希菌的研究證實(shí)了該觀點(diǎn)[41]，研究者在指數(shù)期大腸埃希菌中加入了1 mmol/L過氧化氫，并對(duì)30 min內(nèi)胞內(nèi)的代謝物水平進(jìn)行跟蹤測(cè)量，發(fā)現(xiàn)磷酸戊糖途徑在5 s內(nèi)就應(yīng)激加強(qiáng)，6-磷酸葡萄糖酸酯快速積累，糖酵解途徑響應(yīng)稍慢，在30 s內(nèi)1,6-二磷酸果糖和磷酸烯醇式丙酮酸物質(zhì)含量下降。這些數(shù)據(jù)表明，在胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平快速升高的時(shí)候，細(xì)菌會(huì)迅速增加糖酵解流向磷酸戊糖途徑的通量、并關(guān)閉糖酵解途徑，以產(chǎn)生更多的具有還原電勢(shì)的NADPH來應(yīng)對(duì)ROS。此外，研究者發(fā)現(xiàn)逐級(jí)抑制Zwf活性會(huì)使大腸埃希菌對(duì)過氧化氫敏感性逐步上升，這同樣佐證了磷酸戊糖代謝對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激的重要性。

3.6 丙氨酸代謝與氧化應(yīng)激

細(xì)菌的丙氨酸主要合成途徑一般由谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶催化轉(zhuǎn)移谷氨酸的氨基到丙酮酸，這是一個(gè)可逆反應(yīng)，丙氨酸同樣也可逆轉(zhuǎn)生成丙酮酸，然后經(jīng)由乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)被氧化成二氧化碳和水[42]。此外，丙氨酸也可藉由三羧酸循環(huán)中的草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸，然后逆轉(zhuǎn)糖酵解途徑生成3-磷酸甘油醛進(jìn)入磷酸戊糖途徑，而磷酸戊糖途徑中間產(chǎn)物5-磷酸核酮糖則是核黃素生物合成的前體之一[43]。因此，丙氨酸代謝實(shí)際上通過丙酮酸連接了三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑以及核黃素合成。

近期一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)[32](表1)，添加丙氨酸可以增強(qiáng)卡那霉素對(duì)耐藥細(xì)菌的殺滅作用，通過對(duì)添加丙氨酸處理的耐藥細(xì)菌的蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組綜合分析發(fā)現(xiàn)，三羧酸循環(huán)、碳代謝、氨基酸代謝和核黃素代謝均上調(diào)表達(dá)。核黃素是輔酶FAD的生物合成前體，其產(chǎn)量增加可能會(huì)刺激電子傳遞鏈產(chǎn)生更多ROS。轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn)，丙氨酸存在時(shí)轉(zhuǎn)化核黃素為FAD的相關(guān)基因ribB、ribC和ribF均上調(diào)表達(dá)。此外，外源丙氨酸的添加還下調(diào)了超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄水平，最后通過對(duì)細(xì)菌胞內(nèi)ROS含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)添加丙氨酸或卡那霉素均增加了氧自由基的產(chǎn)生，兩者聯(lián)合使用則顯著提升了ROS水平。由此可知，丙氨酸添加會(huì)抑制氧化應(yīng)激系統(tǒng)，并依次通過丙氨酸代謝、三羧酸循環(huán)、糖異生途徑、磷酸戊糖途徑、核黃素代謝來誘發(fā)細(xì)菌產(chǎn)生過多的ROS。

3.7 絲氨酸代謝與氧化應(yīng)激

細(xì)菌的L-絲氨酸生物合成是糖酵解的分支途徑。SerA負(fù)責(zé)催化從3-磷酸甘油酸到3-磷酸-羥基丙酮酸的反應(yīng)，同時(shí)生成一個(gè)NADPH分子，將葡萄糖酵解的流向介導(dǎo)至L-絲氨酸分支途徑[44]，再經(jīng)中間產(chǎn)物3-磷酸絲氨酸，即可合成目的產(chǎn)物L(fēng)-絲氨酸。絲氨酸代謝是細(xì)菌胞內(nèi)的重要生物途徑，絲氨酸能與甘氨酸、蘇氨酸等相互轉(zhuǎn)化，是胞內(nèi)很多化合物代謝的中間產(chǎn)物。L-絲氨酸的降解則是由三個(gè)L-絲氨酸脫氨酶催化完成，通過一步反應(yīng)脫去氨基生成丙酮酸鹽[45]，丙酮酸再分流到三羧酸循環(huán)中被氧化成二氧化碳和水。

L-絲氨酸可以提高大腸埃希菌對(duì)氟喹諾酮類抗生素的敏感性[33](表1)。外源添加的L-絲氨酸會(huì)被大腸埃希菌中的絲氨酸脫氫酶轉(zhuǎn)化成丙酮酸，然后進(jìn)入三羧酸循環(huán)，而三羧酸循環(huán)會(huì)消耗NAD+，產(chǎn)生NADH[46]。在與L-絲氨酸共同孵育的情況下，相比只含有氧氟沙星或莫西沙星的對(duì)照組，NAD+/NADH的比值提高了約2倍。三羧酸循環(huán)增強(qiáng)則加速電子傳遞鏈的活化，促進(jìn)超氧陰離子的生成，進(jìn)而破壞鐵硫簇，釋放游離鐵。使用比色鐵氧嗪法測(cè)定胞內(nèi)三價(jià)鐵的含量，數(shù)據(jù)顯示在與L-絲氨酸共同孵育的情況下，三價(jià)鐵含量明顯升高。三價(jià)鐵與二價(jià)鐵相互轉(zhuǎn)換，而游離的二價(jià)鐵能與過氧化氫發(fā)生Fenton反應(yīng)、產(chǎn)生具有更高氧化活性的羥基自由基，進(jìn)而誘發(fā)多種細(xì)胞損傷和其他ROS基團(tuán)的生成，形成一種惡性循環(huán)，讓ROS不斷積累[47]。通過ROS分析試劑盒測(cè)定胞內(nèi)ROS的含量發(fā)現(xiàn)，在與L-絲氨酸共同孵育的情況下，胞內(nèi)ROS的含量明顯升高。這些結(jié)果表明，外源絲氨酸的添加會(huì)通過自身代謝流入三羧酸循環(huán)，進(jìn)而刺激細(xì)菌產(chǎn)生更多的ROS。

3.8 核苷酸代謝與氧化應(yīng)激

DNA是生物遺傳信息的攜帶者，指導(dǎo)生物體在不同的生命周期完成相應(yīng)的生命活動(dòng)。細(xì)胞內(nèi)DNA的合成前體為4種脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，它們均由磷酸基團(tuán)、脫氧核糖和含氮堿基3種基本單元構(gòu)成。含氮堿基的從頭生物合成是高耗能的途徑，要消耗8分子ATP才能從1個(gè)葡萄糖分子合成1個(gè)腺嘌呤分子[48]。核苷酸合成代謝是一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的龐大網(wǎng)絡(luò)，生物體在合成少量核苷酸時(shí)，通過嘌呤、嘧啶的挽救途徑和物質(zhì)轉(zhuǎn)化來合成核苷酸的方式顯然更加合適，但在面對(duì)核苷酸大量需求時(shí)，從頭合成途徑也是重要的參與者。在抗生素處理下，DNA、嘌呤、嘧啶以及游離dNTP被細(xì)菌胞內(nèi)產(chǎn)生過量的ROS氧化破壞，需要合成大量的核苷酸進(jìn)行受損堿基的切除修復(fù)[49]。

外源添加腺嘌呤可以削弱3大類抗生素的殺傷作用[34](表1)。添加腺嘌呤后，細(xì)胞內(nèi)的腺嘌呤核苷酸出現(xiàn)累積富集，此外，三羧酸循環(huán)中琥珀脫氫酶的活性被抑制，琥珀酸含量增加，且伴隨有富馬酸含量減少。與之相對(duì)應(yīng)的是，補(bǔ)充腺嘌呤后，由抗生素誘發(fā)的細(xì)胞耗氧率增強(qiáng)效應(yīng)被削弱，腺苷酸能荷也適度下降，ATP合成相對(duì)減少?？股靥幚砗笠l(fā)了核苷酸氧化，刺激細(xì)胞合成大量ATP來滿足核苷酸從頭合成的能量需求，外源補(bǔ)充腺嘌呤可以通過嘌呤挽救途徑來降低細(xì)胞的能量需求，從而削弱了抗生素處理誘發(fā)的三羧酸循環(huán)增強(qiáng)效應(yīng)，避免了細(xì)胞產(chǎn)生致死性劑量的ROS。

4 結(jié)論和觀點(diǎn)

ROS是抗生素殺滅細(xì)菌的關(guān)鍵致死因子，胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平對(duì)抗生素的殺傷作用具有重要影響。ATP、糖類、氨基酸、脂質(zhì)以及核苷酸的代謝擾動(dòng)都會(huì)引發(fā)整體代謝的變化，進(jìn)而改變細(xì)菌胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)[50-51]。整體來說，這些代謝或歸屬核心碳代謝、或與其相互關(guān)聯(lián)，某個(gè)代謝節(jié)點(diǎn)的擾動(dòng)可能導(dǎo)致整體核心碳代謝的流向發(fā)生改變。核心碳代謝與細(xì)菌胞內(nèi)ROS存在密切聯(lián)系，所以從代謝全局出發(fā)，尋找干擾核心碳代謝流向的靶點(diǎn)、設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的藥物來殺滅細(xì)菌或增強(qiáng)抗生素功效，是一個(gè)良好的抗菌策略(圖1)。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，許多耐受細(xì)菌通過降低代謝強(qiáng)度甚至代謝停滯來抵御抗生素的殺傷[52]，究其原因，也是因?yàn)楹诵奶即x不活躍、避免了ROS過量產(chǎn)生。同樣，可從整體代謝出發(fā)尋找激活細(xì)菌細(xì)胞代謝的節(jié)點(diǎn)，使細(xì)菌重新呈現(xiàn)對(duì)抗生素殺菌敏感的表型。綜上所述，從整體代謝尋找抗生素靶標(biāo)或抗生素佐劑，可能是一個(gè)未來可期且行之有效的方法，值得進(jìn)一步深入探索。