耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌對多黏菌素B體外敏感性檢測方法的差異性研究

裘雪丹 李情操,* 吳巧萍 易澤源

(1 寧波大學醫(yī)學院，寧波 315040；2 寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院，寧波 315040)

肺炎克雷伯菌為條件致病菌，常寄居于腸道和上呼吸道，是醫(yī)院感染的重要致病菌之一，近年來碳青霉烯類抗生素大量使用，使得耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae, CRKP)比例逐年增加，CRKP已經(jīng)成為臨床嚴重感染主要原因之一，其可選擇的抗菌藥物有限，致病性強，可導致肺部感染、泌尿道感染、血流感染和化膿性腦膜炎等疾病，其中由CRKP引起的血流感染的病死率可高達50%～70%[1]，給臨床用藥和治療帶來了極大的挑戰(zhàn)[2-3]。臨床上CRKP對常用的抗生素如β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類等敏感性下降，而對多黏菌素有較高的敏感性[4]。目前實驗室檢測多黏菌素B的方法主要有微量肉湯稀釋法、儀器法、E-test法和紙片法。肉湯稀釋法作為參考方法，操作復雜，不適合批量檢測；儀器法操作簡單，目前已在實驗室大量開展；E-test法成本較高，紙片法成本低，但均易受MH瓊脂和紙片廠家影響，同時目前尚無關于肺炎克雷伯菌對多黏菌素B的K-B法直徑折點判斷標準。文本主要研究不同方法檢測在CRKP對多黏菌素B體外藥敏檢測中存在的差異，同時建立K-B法直徑和MIC值的回歸方程，為臨床治療和實驗室檢測提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 菌株來源

選擇2018年1月—2020年6月份寧波地區(qū)多中心醫(yī)院臨床非重復分離的CRKP菌株147株，作為實驗菌株，其標本來源包括痰液、血液、引流液、創(chuàng)面分泌物和中段尿等。本次研究用菌株經(jīng)肉湯稀釋法作碳青霉烯耐藥確認。本次實驗藥敏檢測質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853，購自衛(wèi)生部臨檢中心。

1.2 儀器和試劑

選擇法國梅里埃公司VITEK 2全自動細菌鑒定藥敏儀和中國定制藥敏卡N335，紙片擴散法(K-B)藥敏檢測紙片多黏菌素B(100/10μg/片)選自英國Oxiod公司，肉湯稀釋法和E-test法藥敏試劑選自溫州康泰公司，分離培養(yǎng)基哥倫比亞血瓊脂平板和藥敏培養(yǎng)基MH瓊脂平板均為法國生物梅里埃公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 儀器法

菌種的鑒定和藥敏按照VITEK 2型全自動微生物分析儀標準操作指南，先挑取待鑒定實驗菌株單個菌落，使用含4.5% NaCl的無菌水調(diào)制菌液至1.5×108CFU/mL，使用VITEK 2配套的細菌鑒定卡片GN、藥敏卡N335進行菌種鑒定和藥敏檢測。

1.3.2 肉湯稀釋法

挑取待鑒定實驗菌株單個菌落用無菌水調(diào)制至1.5×108CFU/mL，吸取上述調(diào)好的菌落加入液體藥敏試驗培養(yǎng)基中，菌液比例為1:200(如2 mL的培養(yǎng)基，加10 μL的菌液)，充分混勻后每孔加100 μL。35℃培養(yǎng)箱隔夜培養(yǎng)16～20 h后取出進行結(jié)果判讀?？變?nèi)培養(yǎng)液澄清表示不生長；反之，培養(yǎng)液變渾濁或顯色則表示生長。不生長孔為最低抑菌濃度(MIC)。如出現(xiàn)跳孔現(xiàn)象，排除污染情況下以最后一孔為準。CRKP對多黏菌素B的MIC折點按照2020年CLSI判斷標準為2～4 μg/mL。

1.3.3 E-test紙片法

用無菌棉簽取1.5×108CFU/mL菌懸液，于M-H培養(yǎng)基上均勻涂布，將紙片垂直插入培養(yǎng)基，插入后不再轉(zhuǎn)移。35℃培養(yǎng)箱隔夜培養(yǎng)16～20 h后取出進行結(jié)果判讀。培養(yǎng)基表面水滴狀抑菌圈環(huán)尖所指向的濃度值即為檢測菌的最低抑菌濃度(MIC)。抑菌圈環(huán)尖指向兩個齒輪之間或環(huán)尖指向有高低差時取較大的值。

1.3.4 K-B法

用無菌棉簽取1.5×108CFU/mL菌懸液，于M-H培養(yǎng)基上均勻涂布，貼好藥敏紙片35℃培養(yǎng)箱隔夜培養(yǎng)18～24 h后，量取紙片抑菌環(huán)直徑。采用大腸埃希菌 ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853對M-H培養(yǎng)基與藥敏紙片進行質(zhì)控監(jiān)測，檢測結(jié)果均在控。

1.3.5 藥敏結(jié)果分析

以標準方法肉湯稀釋法檢測結(jié)果為參考：①基本一致率(EA)：兩種方法檢測的MIC值相同或相差±1個稀釋度；②標準符合(CA)：按照相同折點標準，敏感、中介、耐藥一致的菌株百分比；③嚴重錯誤(VME)：參考方法藥敏結(jié)果為R，而被評估方法結(jié)果為S，即“假敏感”；④重大錯誤(ME)：參考方法藥敏結(jié)果為S，而被評估方法結(jié)果為R，即“假耐藥”；⑤小錯誤(mE)：參考方法結(jié)果為I，而被評估方法藥敏結(jié)果為S或R。按照CLSI文件要求，可接受的誤差范圍為：EA和CA≥90%，VME≤1.5%，ME≤3%，mE≤10%[5]。

1.4 統(tǒng)計學處理

應用WHONET5.6軟件和SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對臨床菌株的數(shù)據(jù)資料進行統(tǒng)計分析，兩種方法檢測MIC值比較使用wilcoxon符號秩和檢驗；兩種方法檢測抗菌藥物敏感性的比較使用卡方檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肉湯稀釋法、E-test法和儀器法檢測多黏菌素B藥敏結(jié)果

肉湯稀釋法、E-test法和儀器法檢測CRCP對多黏菌素B累計敏感率分別為97.3%、99.3%和98%。肉湯稀釋法和E-test法檢測CRCP對多黏菌素B MIC50和MIC90均為1 μg/mL，儀器法的MIC50和MIC90較微量肉湯稀釋法均低1個稀釋度(0.5μg/mL)(表1和圖1)。

表1 對CRKP的3種MIC檢測方法的結(jié)果分布(株)、累積率(%)及MIC50、MIC90值(μg/mL)Tab.1 Results distribution, cumulative rate (%) and MIC50,MIC90(μg/mL) by three testing methods of MIC for CRKP

2.2 肉湯稀釋法、E-test法和儀器法檢測多黏菌素B藥敏結(jié)果敏感性比較

微量肉湯稀釋法、E-test法和儀器法檢測多黏菌素B的敏感率分別為97.3%、99.3%和98.0%?？ǚ綑z驗結(jié)果P1、P2均大于0.05，顯示儀器法、E-test法與肉湯稀釋法相比敏感性無差異(表2)。

表2 對CRKP的3種MIC檢測方法的敏感性結(jié)果比較 [n(%)]Tab.2 Comparison of sensitivity results by three testing methods of MIC for CRKP[n(%)]

2.3 肉湯稀釋法、E-test法和儀器法檢測多黏菌素B MIC值結(jié)果比較

肉湯稀釋法、E-test法、儀器法的MIC值分別為(1.39±0.27)μg/mL、(1.02±0.06)μg/mL、(0.82±0.16)μg/mL。儀器法檢測CRKP對多黏菌素B的MIC值明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)(表3)。

表3 對CRKP的3種MIC檢測方法的MIC值結(jié)果比較(x_±s)Tab.3 Comparison of the MIC values by three testing methods of MIC for CRKP(x_±s)

2.4 E-test法和儀器法與肉湯稀釋法檢測多黏菌素B敏感性的方法學誤差比較

以肉湯稀釋法作為參考方法，按照FDA判斷標準，E-test法和儀器法的EA率為93.2%和95.2%，CA率分別為98.0%和99.3%，VME率分別為2.0%和0.7%；ME率和mE率均為0(表4)。

表4 E-test法和儀器法與肉湯稀釋法檢測多黏菌素B敏感性的方法學誤差比較(%)Tab.4 Incidence of errors between E-test method、instrument method and broth microdilution(%)

2.5 紙片法抑菌環(huán)直徑結(jié)果與肉湯稀釋法MIC結(jié)果回歸統(tǒng)計比較

KB法抑菌圈直徑和肉湯稀釋法KB值與肉湯稀釋法MIC值之間方差分析P＞0.05，故提示KB值與MIC值不存在線性關系(表5和圖2)。

表5 紙片法抑菌環(huán)直徑結(jié)果與肉湯稀釋法MIC檢測多黏菌素B藥敏結(jié)果回歸方程Tab.5 Regression equation between the results of the KB value and the MIC value of polymyxin

3 討論

近年來碳青霉烯類抗生素大量使用，使得耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)比例逐年增加，CRKP已經(jīng)成為臨床嚴重感染主要原因之一。CRKP耐藥性的獲得途徑有產(chǎn)碳青霉烯酶和外膜蛋白的缺失，膜通透性改變以及外排泵過表達等，這給臨床的抗感染治療帶來了巨大的難題[6]。多黏菌素B是一種多肽類抗生素，有其獨特的化學結(jié)構和作用機制，并擁有高效抗菌活性，已經(jīng)成為治療CRKP的重要選擇[7]。目前實驗室檢測多黏菌素B的方法主要有微量肉湯稀釋法、儀器法、E-test法。不同的藥敏檢測方法各有優(yōu)缺點，本文主要采用上述4種方法檢測多黏菌素B對寧波地區(qū)多中心醫(yī)院臨床非重復分離的CRKP的體外敏感性的差異性進行分析討論，為臨床治療和實驗室檢測提供依據(jù)。

不合理的用藥使得多黏菌素耐藥菌株也不斷出現(xiàn)[8]，微量肉湯稀釋法能夠經(jīng)濟有效準確的檢測出病原菌的最低抑菌濃度，是藥敏試驗的參考方法。本研究中微量稀釋法結(jié)果顯示，多黏菌素B對CRKP具有較高的抗菌活性，這與其他學者的研究[9-10]結(jié)果一致。E-test法和儀器法其累積敏感率均較高，與微量稀釋法結(jié)果較一致，有較高的可靠性，但在出現(xiàn)有疑問的藥敏結(jié)果或結(jié)果不相符合時，應盡量采用微量肉湯稀釋法復核。

準確的MIC值對于臨床抗生素敏感性指導治療更有意義[11]。肉湯稀釋法雖為參考方法，結(jié)果準確但操作復雜且成本較高，不適合臨床實驗室大量開展[12]。因此替代方法的準確性尤為重要。本實驗采用的是插入式E-test試紙條，不會產(chǎn)生氣泡等干擾因素，讀取結(jié)果更簡便[13]，以微量肉湯稀釋法MIC值作為參考方法進行比較，E-test法檢測CRKP對多黏菌素B的MIC值無明顯差異，故臨床實驗室可采用E-test法對多黏菌素B進行常規(guī)的敏感性檢測。儀器法檢測CRKP對多黏菌素B的MIC值顯著降低，這與335藥敏卡其他抗菌藥物報道類似[14]，所以此種方法報告的敏感結(jié)果應謹慎，必要時進行相關驗證和復核。

與肉湯稀釋法相比，E-test法和儀器法的EA和CA均＞90%，高于CLSI參考標準，無Me和me，但均存在VME，E-test法的VME＞1.5%，高于參考標準，其原因易受多種因素影響，如抗生素含量、其擴散能力、瓊脂厚度和成分以及人工操作可能的誤差，所以實驗人員應嚴格按照SOP規(guī)范進行藥敏操作。

目前國內(nèi)微生物實驗室主要使用儀器法和Etest法來檢測CRKP對多黏菌素B的MIC值，關于肺炎克雷伯菌對多黏菌素B的紙片擴散法的判斷折點CLSI尚無明確。但對于多重耐藥菌株的出現(xiàn)，尤其是CRKP，以多黏菌素B為主的聯(lián)合用藥是當下研究的重點[15]，紙片擴散法在聯(lián)合藥敏對多重耐藥菌的研究中極其重要。本研究為了明確K-B法檢測效果，采用紙片擴散法對147株CRKP的抑菌圈進行對比研究。與肉湯稀釋法對比發(fā)現(xiàn)，對于多黏菌素B耐藥或敏感CRKP菌株，其紙片抑菌圈直徑并沒有出現(xiàn)明顯減小或擴大。究其原因主要是多黏菌素B是多組分結(jié)構，分子量較大，故在瓊脂中不易擴散，此外還有其固有的陽離子特性等影響的因素[16]。所以，K-B法作為傳統(tǒng)檢測方法，并不適合于多黏菌素B的敏感性判斷，與參考方法測得MIC值回歸曲線的擬合程度也并不高。本研究受限于本次菌株數(shù)量原因，有待進一步的完善。