MALDI-TOF MS在耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌同源性分析的應(yīng)用研究

張杰 張金鑫 楚新旭 應(yīng)沖濤 郭普 汪華學(xué),*

(1 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，蚌埠 233004；2 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院疼痛科，蚌埠 233004；3 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，蚌埠 233004)

近年來(lái)隨著碳青霉烯類(lèi)藥物的廣泛及不合理應(yīng)用，引起耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌(CRKP)的檢出率不斷增長(zhǎng)，為臨床診療帶來(lái)了巨大的風(fēng)險(xiǎn)與挑戰(zhàn)[1-2]。通過(guò)分析CRKP的同源性，便于明確CRKP的流行病學(xué)分布和擴(kuò)散方式，為臨床感染防控及疾病診療提供依據(jù)。脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)作為現(xiàn)今最常用于鑒定細(xì)菌分型的分子生物學(xué)技術(shù)之一，通過(guò)分析菌株間的同源性，能夠有效識(shí)別院內(nèi)CRKP引起的感染流行與暴發(fā)規(guī)律，但由于操作復(fù)雜、耗時(shí)、實(shí)驗(yàn)條件苛刻等因素制約，常規(guī)醫(yī)療機(jī)構(gòu)少有開(kāi)展[3]。目前MALDI-TOF MS作為快速篩選菌株種屬的新工具，具有高通量、時(shí)效高、誤差小、性價(jià)比高等優(yōu)勢(shì)，為診療提供強(qiáng)大的技術(shù)支撐[4]。MALDI-TOF MS除用于種屬鑒定外，也可用于在同源性的分析比較，通過(guò)質(zhì)譜峰進(jìn)行聚類(lèi)分析便可快速監(jiān)測(cè)耐藥菌株的流行病學(xué)分布，為耐藥菌株的院內(nèi)感染控制提供指導(dǎo)意見(jiàn)[5]。本研究應(yīng)用MALDI-TOF MS采集CRKP菌株的質(zhì)譜圖，利用自帶的SARAMIS軟件分析菌株間的同源性，PFGE作為分組標(biāo)準(zhǔn)，旨在評(píng)價(jià)MALDITOF MS進(jìn)行同源性分析的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源

收取某院2018年9月—2020年10月在微生物室分離自痰、血液、尿液及胸水等標(biāo)本的肺炎克雷伯菌295株(除去同一病患相同部位的重復(fù)菌株)，其中分離自痰標(biāo)本130株，血液標(biāo)本62株，尿液標(biāo)本27株，胸水標(biāo)本31株，分泌物標(biāo)本33株，腦脊液標(biāo)本12株?？剖襾?lái)源見(jiàn)表1。質(zhì)譜質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC8739；標(biāo)準(zhǔn)菌株：大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705。菌株均保存于-80℃冰箱中。

表1 295株肺炎克雷伯菌的科室來(lái)源Tab.1 The department source of 295 Klebsiella pneumoniae strains

1.1.2 儀器與試劑

MALDI-TOF MS、48孔靶板及麥?zhǔn)媳葷醿x購(gòu)自法國(guó)Bio-Merieux公司，PFGE電泳儀及成像儀源自美國(guó)Bio-Rad公司；MH平板和哥倫比亞血瓊脂平板購(gòu)自合肥天達(dá)試劑公司，CHCA基質(zhì)液購(gòu)自法國(guó)Bio-Merieux公司；美羅培南(10 μg)及亞胺培南(10 μg)藥敏卡片購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；蛋白酶K和XbaI內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)及種屬鑒定

從-80℃冰箱選取保存的菌株，按三區(qū)劃線，接種至哥倫比亞血瓊脂平板上，放在37℃溫箱中過(guò)夜培養(yǎng)后，再次分純培養(yǎng)。挑取單一菌落，應(yīng)用甲酸提取法萃取出菌株蛋白，取1 μL上清液滴至48孔靶板上，一菌兩孔，最后挑取ATCC8739單一菌落，均勻涂抹在中間靶孔上，用于圖譜校準(zhǔn)。然后，分別加1 μL CHCA液覆蓋靶孔上，晾干后利用MALDITOF MS自帶的RUO系統(tǒng)，以線性、正離子模式，調(diào)整頻率50 Hz，在質(zhì)荷比2000～20000 Da內(nèi)收集圖譜。將得到的峰度與數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，重新鑒定至種水平。

1.2.2 耐藥表型分析

挑取單個(gè)純菌落，應(yīng)用麥?zhǔn)媳葷醿x配至0.5 CFU/mL的菌懸液，接種至MH平板，37℃溫箱中孵養(yǎng)16～18 h，結(jié)果參照2020版CLSI M100 30th藥敏標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，其中美羅培南或亞胺培南的抑菌圈直徑≤19 mm，篩選為CRKP。

1.2.3 PFGE分析

按照文獻(xiàn)[6]方法所述，將篩選出的CRKP菌株，挑取新鮮純菌落至緩沖液中，震蕩搖勻15s，制成4個(gè)麥?zhǔn)蠞岫鹊木海ㄟ^(guò)裂解、洗膠、酶切、上樣，接著電泳獲得圖像，最后利用BioNumerics軟件分析同源性。結(jié)果根據(jù)文獻(xiàn)[7]判讀：①條帶完全一樣為同一型；②1～3個(gè)條帶有差異為同一型的不同亞型，表示高度有關(guān)；③4～6個(gè)條帶有差異定為不同型別，表示可能有關(guān)；④≥7個(gè)條帶有差異定散發(fā)菌株，表示不相關(guān)。

以PFGE同源性分析作為分組標(biāo)準(zhǔn)：①高度同源組：相似性＞85%；②中度同源組：相似性介于70%～85%；③低度同源組：相似性＜70%。

1.2.4 MALDI-TOF MS分析同源性

參照“1.2.1”方法獲取待分析CRKP的質(zhì)譜圖，取2000～20000質(zhì)荷比為分析區(qū)間，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SARAMIS軟件中，應(yīng)用Taxonomy工具中的相似性分型和identical mass分型進(jìn)行圖譜的分析比較。

2 結(jié)果

2.1 PFGE結(jié)果

經(jīng)耐藥表型共篩選出55株CRKP；PFGE對(duì)其進(jìn)行聚類(lèi)分析，得出同源性分析樹(shù)狀圖(圖1)，PFGE的分型、檢出結(jié)果及菌株來(lái)源見(jiàn)表2。

表2 PFGE的分型、檢出結(jié)果及菌株來(lái)源Tab.2 Classification, detection results and source of PFGE

2.2 3組分析比較

2.2.1 高度同源組

本組大多數(shù)KPN菌株同源性高度集中，根據(jù)PFGE結(jié)果，相似性均＞85%(圖1)；采用SARAMIS軟件的identical mass分型(圖2A)，菌株大多集中分布于60%～80%，均屬于A型，且A1型identical mass部分高于80%(HF516、HF518、BY261、BY281),其中發(fā)現(xiàn)HF1676與同型KPN相比，在identical mass分型中差異性較大，對(duì)高度同源組造成了一定的影響。通過(guò)相似性分型發(fā)現(xiàn)(圖2B)，PFGE相似性大于85%的菌株同源性大多集中，大多A型菌株相似性＞80%，這與PFGE結(jié)果一致性較高，然而HF281和BY217為A型菌株，但在相似性分型卻小于70%，差異性較大。

2.2.2 中度同源組

該組PFGE同源性介于70%～85%之間，菌株分型主要屬于A型(圖1)，但菌株之間具有一定的差異。應(yīng)用identical mass分型(圖3A)和相似性分型(圖3B)發(fā)現(xiàn)，主要菌株之間的identical mass＞70%，相似性＞85%，表明KPN之間同源性較高，這與PFGE結(jié)果嚴(yán)重不符，存在較大差異。

2.2.3 低度同源組

此組PFGE分析差異性較大，均＜70%，分型各自不同，屬于散發(fā)性(圖1)。采用identical mass分型(圖4A)和相似性分型(圖4B)分析同源性，顯示KPN之間identical mass＜70%，相似性＜80%，與PFGE分析相似，能較好體現(xiàn)菌株間的差別。

3 討論

肺炎克雷伯菌是常見(jiàn)的腸桿菌科細(xì)菌，常導(dǎo)致肺部、腸道、甚至血流等感染[8]。β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物是治療肺炎克雷伯菌感染的首選抗菌藥物，而碳青霉烯類(lèi)抗生素被認(rèn)為是最后的選擇。但是，隨著臨床上抗生素的廣泛應(yīng)用及不合理使用，碳青霉烯類(lèi)的耐藥率呈上升趨勢(shì)[9]。CHINET監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)2005—2018年KPN對(duì)美羅培南和亞胺培南的耐藥率從2.9%和3.0%增加到26.3%和25.0%，13年來(lái)增加約9倍[10]。因此，及時(shí)發(fā)現(xiàn)、有效控制CRKP的流行趨勢(shì)與暴發(fā)至關(guān)重要。

現(xiàn)今，臨床微生物實(shí)驗(yàn)室在細(xì)菌同源性分析的方面主要以分子生物學(xué)分型居多，其中PFGE作為一直比較公認(rèn)的分型技術(shù)，具有較高的精確度和穩(wěn)定性[11-13]。但該技術(shù)由于操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用高等缺點(diǎn)，不作為臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)設(shè)備和技術(shù)手段。為了快速明確耐藥菌的分布與流行規(guī)律，醫(yī)院迫切需要一種能夠快速溯源、加強(qiáng)疾病防控的時(shí)效性和應(yīng)對(duì)能力的新技術(shù)。近年來(lái)，MALDI-TOF MS作為一種快速鑒定病原菌種屬的新技術(shù)，能通過(guò)分析菌株間蛋白豐度的細(xì)小差異，達(dá)到快速分析細(xì)菌同源性的目的，進(jìn)而追根溯源[14]。有研究發(fā)現(xiàn)[5]，利用MALDI-TOF MS篩選出CRKP的特征質(zhì)量峰，應(yīng)用自帶的Clinpro Tools 3.0軟件分析比較菌株間的特征質(zhì)量峰，作為其同源性分析的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。王璐等[15]研究利用MALDI-TOF MS收集臨床分離的CRKP菌株，通過(guò)自帶的SARAMIS軟件對(duì)待測(cè)菌株進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)40株CRKP以A型為主，占85%(34/40)，認(rèn)為該醫(yī)院存在以A型CRKP為主的流行傳播。在本研究中，運(yùn)用SARAMIS軟件的分型工具，高度同源組identical mass大多介于60%～80%之間，分布較為集中，相似性＞80%，與PFGE分析基本相似，這在菌株一致性和非一致這兩方面上，均能較好得反映院內(nèi)病原菌流行趨勢(shì)。然而，在中度同源組中，質(zhì)譜分析結(jié)果與PFGE分析具有較大差異，這表明MALDI-TOF MS在同源性分析上具有一定的不穩(wěn)定性。結(jié)果分析：PFGE的分型原理是通過(guò)電場(chǎng)的不斷變化，帶動(dòng)不同菌株基因組DNA序列的泳動(dòng)方向，形成電泳條帶，最終達(dá)到細(xì)菌分型的目的，其本質(zhì)是微觀變化的宏觀顯示，但對(duì)于分析含有復(fù)雜DNA序列的菌株，易受到相互影響，并且PFGE操作繁瑣、耗時(shí)，電泳條帶易受到緩沖液的配制、電泳時(shí)間、電壓、操作者的技術(shù)水平等因素受限，且常規(guī)醫(yī)院少有配置有關(guān)設(shè)備[11]；PFGE作為本實(shí)驗(yàn)研究目的的衡量標(biāo)準(zhǔn)，仍存在一定的局限性，后續(xù)實(shí)驗(yàn)仍需通過(guò)其他常用分型技術(shù)驗(yàn)證菌株分型結(jié)果的準(zhǔn)確性；MALDI-TOF MS分析菌株間的同源性是基于病原菌的蛋白質(zhì)表達(dá)豐度[16]，通過(guò)比對(duì)系統(tǒng)自帶的數(shù)據(jù)庫(kù)得出質(zhì)譜峰結(jié)果，從而得出同源性結(jié)果，其結(jié)果受到臨床菌株來(lái)源、抗生素選擇壓力、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、操作者的嫻熟水平及待測(cè)菌株活性等因素制約，某些菌體可能存在不表達(dá)或表達(dá)過(guò)多，導(dǎo)致SARAMIS軟件分析的準(zhǔn)確性不高。在中度同源組分析中，根據(jù)PFGE分型結(jié)果，顯示菌株之間分型大多不同，且根據(jù)圖1的同源性樹(shù)狀圖發(fā)現(xiàn)，本組同源性大多介于70%～85%；應(yīng)用SARAMIS軟件，identical mass分型分析同源性，只有編號(hào)HF6791、HF1285、HF2148這3個(gè)菌株介于70%～85%，而相似性分型大多＞85%，這與PFGE的同源性樹(shù)狀圖比較，不能較好顯示出不同亞型及型別之間的一致性和不同時(shí)期播散的差異性；對(duì)于同源性較高和較低的菌株，能大致進(jìn)行分型初篩。

本研究將臨床分離的55株CRKP劃分為3組菌株：在高度及低度同源組分析中，對(duì)于菌株間的暴發(fā)流行與散發(fā)性，SARAMIS軟件能進(jìn)行粗略的初篩；在中度同源組中，尚不適用；但該技術(shù)仍存在一定的不穩(wěn)定性。由于本研究樣本量不多，其中部分菌株來(lái)源于同一科室，不能排除CRKP小范圍克隆傳播的可能，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一定干擾性。并且，研究樣本的PFGE分型結(jié)果有限，僅限于監(jiān)測(cè)菌株來(lái)源的院內(nèi)流行趨勢(shì)，后續(xù)應(yīng)收集不同菌株型別，探究質(zhì)譜分析CRKP同源性的應(yīng)用價(jià)值。此外，MALDI-TOF MS采集的質(zhì)譜峰數(shù)量較多，部分存在不足，其中峰度干擾、噪聲、重復(fù)性低等因素均對(duì)分析結(jié)果造成一定的影響。因此，后續(xù)應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步增加研究對(duì)象的樣本量，擴(kuò)大CRKP的菌株來(lái)源，從而完善MALDI-TOF MS分析CRKP同源性的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

綜上所述，采用MALDI-TOF MS研究CRKP的同源性，在一定程度上能夠快速追根溯源，從而增強(qiáng)院內(nèi)病原菌流行防控的時(shí)效性，但對(duì)于同源性復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)菌株，穩(wěn)定性不高，其應(yīng)用價(jià)值需進(jìn)一步研究，仍需更準(zhǔn)確的同源性分析技術(shù)明確流行規(guī)律，從而采取適當(dāng)措施，嚴(yán)格控制進(jìn)一步的暴發(fā)。