山茱萸多糖對D-半乳糖致衰老大鼠學習記憶能力及Klotho/Akt信號通路的影響

歐 芹， 張鵬霞， 范慧晗， 劉泰佐

(佳木斯大學基礎醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154007)

社會人口老齡化的進程促使對延緩衰老、提高老年人群生存質(zhì)量的研究不斷進行。對衰老相關(guān)基因研究發(fā)現(xiàn)，Klotho基因突變導致多個早衰樣表型出現(xiàn)，包括短壽命、動脈硬化等；而過表達可對小鼠壽命有明顯的延長[1-2]。盡管Klotho的遺傳突變導致多種衰老相關(guān)疾病[3-5]，但相關(guān)的研究都明確地顯示Klotho基因只在小鼠、大鼠和人類的有限組織中表達。Klotho的表達可受許多因素的調(diào)節(jié)，表達后在維持細胞代謝平衡等方面發(fā)揮作用。山茱萸多糖(cornel polysaccharid，COP)可顯著提高小鼠抗氧化能力、免疫力、增強細胞活力、影響細胞周期調(diào)控因子作用；還可改善衰老腦組織老化程度以及抗休克的作用[5-6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，含山茱萸多糖血清可調(diào)節(jié)細胞周期運行，發(fā)揮抗人二倍體成纖維細胞衰老作用；水煎劑和山茱萸多糖均可通過抗氧化、提高衰老大鼠學習記憶能力[7]。本實驗主要探究山茱萸多糖提高腦老化模型大鼠學習記憶能力是否與調(diào)節(jié)Klotho及其下游底物Akt、FoxO3a、Mn-SOD的表達有關(guān)，為腦老化的干預提供一個新的靶點和新的藥物。

1 材料與方法

1.1 動物 Wistar大鼠60只，清潔級，雌雄各半，體質(zhì)量220～240 g，購自佳木斯大學實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(黑)2013004。所有大鼠適應性喂養(yǎng)1周后進行實驗。

1.2 試劑與藥物 山茱萸多糖(寧波德康生物制品有限公司，批號20120110)，硫酸-苯酚法測定多糖含量為75.8%。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Klotho抗體、Mn-SOD抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；β-半乳糖苷酶活性試劑盒(上海潤裕生物科技有限公司)；D-半乳糖(上海澄紹生物科技公司)；Trizol、DEPC、RT-PCR試劑盒、DNA maker[寶生物工程 (大連) 有限公司]。

1.3 造模及分組 大鼠隨機分為2組，正常組10只，腦老化造模組50只，造模大鼠腹腔注射60 mg/kg 5%D-半乳糖氯化鈉溶液，連續(xù)6周，進行Y迷宮篩查，檢測15次，較正常組正確次數(shù)下降15%～30%的大鼠為造模成功。將造模成功的48只腦老化模型大鼠隨機分為4組，即模型組及山茱萸多糖低、中、高劑量組。

1.4 給藥 從第7周起，山茱萸多糖低、中、高劑量組分別灌胃給予山茱萸多糖水溶液50、100、200 mg/kg，正常組和模型組灌胃給予等容量蒸餾水，連續(xù)6周。

1.5 樣本采集 最后1次給藥后，次日用Morris水迷宮檢測大鼠定位航行和空間探索能力，結(jié)束后，乙醚麻醉后斷頭處死，取腦組織并分離海馬，用于檢測Klotho、Mn-SOD、Akt、FoxO3a表達；剩余腦組織制備成10%勻漿液，用于檢測β-半乳糖苷酶活性。

1.6 Morris水迷宮法檢測大鼠學習記憶能力 參考文獻[8]報道，第1～5天，Morris水迷宮水下1 cm放置圓形平臺，從遠離平臺象限處放下大鼠，記錄大鼠到達平臺時間，為逃避潛伏期。如果大鼠2 min沒有到達平臺，需放置于平臺30 s，系統(tǒng)自動跟蹤記錄大鼠活動軌跡，每天進行1次。第6天，進行空間探索實驗，撤除平臺，記錄120 s大鼠穿過原平臺的次數(shù)、原平臺象限游泳的時間和距離，反映記憶能力。

1.7 RT-PCR法檢測Klotho、Akt、FoxO3a、Mn-SODmRNA表達 根據(jù)試劑盒說明書進行操作，使用凝膠圖像成像系統(tǒng)(Tanon-2500R)分析mRNA表達，GAPDH作為內(nèi)參，以目的基因與內(nèi)參基因比值表示目的基因相對表達量。

1.8 免疫組化法檢測Klotho、Mn-SOD蛋白表達 海馬組織切片脫蠟至水，雙氧水處理阻斷內(nèi)源性過氧化物酶后，微波熱修復，山羊血清封閉，加入一抗、二抗，DAB顯色，棕黃色為陽性表達。采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析陽性染色區(qū)域光密度值。

1.9 鄰硝基苯法檢測β-半乳糖苷酶活性 根據(jù)試劑盒說明書檢測β-半乳糖苷酶活性，總蛋白質(zhì)檢測采用考馬斯亮藍法。

2 結(jié)果

2.1 山茱萸多糖對腦老化大鼠學習記憶能力的影響 與正常組比較，模型組和山茱萸多糖各劑量組大鼠學習第1天，逃避潛伏期延長(P<0.01)，隨著學習天數(shù)增加，大鼠逃避潛伏期縮短，但與正常組比較仍有顯著差異(P<0.05)；山茱萸多糖中、高劑量組大鼠逃避潛伏時間短于模型組(P<0.01)和低劑量組(P<0.05)，見圖1。給藥結(jié)束后，檢測各組大鼠的空間探索能力，以跨越平臺區(qū)次數(shù)、有效象限游泳時間比和有效象限游泳路程比代表空間探索能力，結(jié)果見表1，模型組大鼠空間探索能力低于正常組(P<0.01)；而各劑量山茱萸多糖均能提高腦老化大鼠空間探索能力(P<0.05，P<0.01)，中、高劑量效果優(yōu)于低劑量(P<0.05)。

表1 山茱萸多糖對腦老化大鼠空間探索能力的影響

2.2 山茱萸多糖對腦老化大鼠腦組織β-半乳糖苷酶活性的影響 與正常組比較，模型組大鼠腦組織β-半乳糖苷酶活性升高(P<0.01)；與模型組比較，山茱萸多糖各劑量組大鼠腦組織β-半乳糖苷酶活性均降低(P<0.05,P<0.01)，且中、高劑量效果優(yōu)于低劑量組(P<0.01)，見表2。

表2 山茱萸多糖對腦老化大鼠β-半乳糖苷酶活性的影響

2.3 山茱萸多糖對腦老化大鼠海馬Klotho、Akt、FoxO3a、Mn-SODmRNA表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠海馬Klotho、FoxO3a、Mn-SODmRNA表達降低(P<0.01)，AktmRNA表達升高(P<0.01)；與模型組比較，山茱萸多糖各劑量組大鼠海馬Klotho、FoxO3a、Mn-SODmRNA表達均升高(P<0.01)，山茱萸多糖中、高劑量組大鼠海馬AktmRNA表達降低(P<0.01)，且中、高劑量效果優(yōu)于低劑量(P<0.05，P<0.01)，見圖2、表3。

2.4 山茱萸多糖對腦老化大鼠海馬組織中Klotho、Mn-SOD蛋白表達的影響 如圖3、表4所示，與正常組比較，模型組大鼠海馬組織Klotho、Mn-SOD蛋白表達降低(P<0.01)；與模型組比較，山茱萸多糖各劑量組大鼠海馬組織Klotho、Mn-SOD蛋白表達升高(P<0.05，P<0.01)。

3 討論

腦功能的退行性改變是衰老的最重要變化之一，由于海馬與學習記憶功能密切相關(guān), 可作為衰老時腦功能退行性改變研究的較理想靶區(qū)。本研究中發(fā)現(xiàn)，腦老化模型大鼠海馬神經(jīng)細胞排列紊亂、細胞密度減少，細胞出現(xiàn)空泡等，模型大鼠出現(xiàn)學習記憶能力下降和衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶活性增強，模擬了腦老化的典型變化。Klotho在調(diào)控衰老及年齡相關(guān)性疾病的發(fā)展中有非常關(guān)鍵的作用，最近的研究已經(jīng)確定FoxO3a在腦、心臟、腎臟和脾臟中的水平尤為豐富，在調(diào)節(jié)機體衰老中發(fā)揮作用[9-10]。本研究結(jié)果表明，山茱萸多糖通過上調(diào)Klotho下游分子Mn-SOD的表達，改善腦細胞的功能。這種作用可能是腦衰老時，海馬組織中Klotho的表達減少，降低了其對Akt表達、FoxO3a磷酸化的抑制作用，而使衰老大鼠胞質(zhì)中的FoxO3a增多，影響了FoxO3a從細胞質(zhì)向胞核的轉(zhuǎn)位，從而使Mn-SOD表達降低，最終使過氧化產(chǎn)物增多并累積，導致腦功能紊亂和減退。雖然Klotho抑制衰老的具體機制目前尚不明確，但從INS/IGF-1通路的一系列關(guān)鍵下游靶點Akt、FoxO3a和Mn-SOD的表達結(jié)果來分析，衰老大鼠的學習記憶能力的減退與INS/IGF-1下游的Klotho、Akt、Fox3a和Mn-SOD的調(diào)節(jié)有關(guān)[11-12]。

圖2 各組大鼠海馬Klotho、Akt、FoxO3a、Mn-SOD mRNA的表達

表3 山茱萸多糖對腦老化大鼠海馬Klotho、Akt、FoxO3a、Mn-SOD mRNA表達的影響

表4 山茱萸多糖對腦老化大鼠海馬組織中Klotho、Mn-SOD蛋白表達的影響

本實驗研究結(jié)果表明，山茱萸多糖能夠改善衰老大鼠的學習記憶能力，而且這種改善與其對Klotho及其下游信號分子的調(diào)節(jié)有關(guān)。山茱萸多糖可通過上調(diào)Klotho的表達，增加其對Akt的抑制作用，減少FoxO3a的磷酸化，促使FoxO3a進入細胞核結(jié)合在SOD順式調(diào)節(jié)元件上，進而促進Mn-SOD的表達，提高超氧陰離子自由基的清除，使自由基及其連鎖反應產(chǎn)物造成的組織損傷降低，而改善腦老化造成的細胞功能障礙。但是，Klotho的作用只是衰老時學習記憶的減退機制的其中之一，山茱萸多糖改善學習記憶能力的其他途徑和機制還有待于不斷的完善和進一步的研究。