蓯蓉舒痙顆粒在正常與帕金森病大鼠中體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的比較

劉秀棉， 陳 丹*， 洪麗婷， 熊朝棟， 余文靜， 蔡 晶

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122)

帕金森病是一種因多巴胺能神經(jīng)元變性引起的錐體外系疾病[1-2]，肌強(qiáng)直為其主要臨床癥狀之一，中醫(yī)藥治療本病時(shí)大多通過(guò)整體施治來(lái)改善臨床癥狀，具有療效確切、不良反應(yīng)小等特點(diǎn)[3]。蓯蓉舒痙方由酒蓯蓉、酒黃精、丹參、赤芍、牡丹皮等藥材組成，是源于經(jīng)典方地黃飲子，結(jié)合實(shí)驗(yàn)和長(zhǎng)期臨床實(shí)踐的有效方劑，課題組前期以此方為基礎(chǔ)，研制出抗帕金森肌強(qiáng)直癥的顆粒劑，松果菊苷、芍藥苷、丹酚酸B、毛蕊花糖苷、丹參酮ⅡA等成分為該制劑特征效應(yīng)組分群[4]。

在中藥新藥研究過(guò)程中，考察藥效組分群的體內(nèi)生物利用度[5-6]和血藥濃度，了解它們?cè)谏矬w內(nèi)數(shù)量和質(zhì)量的變化及藥動(dòng)學(xué)特性，對(duì)安全合理使用中藥及正確評(píng)價(jià)其質(zhì)量具有重要意義[7]。本實(shí)驗(yàn)比較蓯蓉舒痙顆粒在正常與帕金森病大鼠中的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)，篩選藥代標(biāo)示物，以期為科學(xué)制訂該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、指導(dǎo)其臨床合理用藥奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 Waters ACQUITY UPLC TQD 超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配置自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、TQD檢測(cè)器三重四級(jí)桿、ESI電離源、四元高壓泵、在線脫氣機(jī)、Masslynx4.1工作站控制系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司)；TGL-18G-C高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；SK-1快速混勻器(常州國(guó)華電器有限公司)；XS205電子天平[十萬(wàn)分之一，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

1.2 試劑與藥物 蓯蓉舒痙顆粒(自制，批號(hào)20190411、20190412、20190413)；烏拉坦(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20180831)。蘆丁對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%，批號(hào)B20771)；松果菊苷對(duì)照品(成都埃法生物科技有限公司，純度>98%，批號(hào)AB0185-0020)；毛蕊花糖苷(批號(hào)S01675)、丹參酮ⅡA(批號(hào)S01209)、丹酚酸B(批號(hào)S01203)、芍藥苷(批號(hào)S01794)對(duì)照品(南京狄爾格醫(yī)藥科技有限公司，純度>98%)。甲醇、乙腈為色譜純(德國(guó)Merck公司)；水為超純水。

1.3 動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠24只，雄性，體質(zhì)量(250±20)g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2017-0005。大鼠在溫度(22±2)℃、相對(duì)濕度(55±5)%的條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，自由進(jìn)食飲水，保持室內(nèi)自然通風(fēng)，清潔級(jí)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(閩)2014-0005。大鼠處理方法符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 分組與造模 24只大鼠隨機(jī)分為正常組和模型組，每組12只，正常組大鼠皮下注射葵花油乳化液(1.5 mg/kg)，每天1次，共14 d；模型組大鼠皮下注射魚藤酮葵花油乳化液(1.5 mg/kg)，每給藥7 d休息1 d，共15 d。按表1評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[8]，發(fā)現(xiàn)14 d后模型組大鼠均出現(xiàn)2分及2分以上的行為學(xué)表現(xiàn)，提示造模成功。

表1 行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.2 空白血漿制備 取正常組、模型組大鼠各6只，禁食12 h，自由飲水，腹腔注射20%烏拉坦(5 mL/kg)麻醉，腹主動(dòng)脈采血，血液置于預(yù)先肝素化的離心管中，室溫靜置30 min，3 500 r/min離心10 min，取上清液，即得，置于-20 ℃冰箱中冷凍保存。

2.3 溶液制備

2.3.1 對(duì)照品溶液 精密稱取松果菊苷、毛蕊花糖苷對(duì)照品適量，50%甲醇超聲溶解，制成分別含兩者1.268、1.207 mg/mL的貯備液；精密稱取芍藥苷、丹參酮ⅡA對(duì)照品適量，甲醇超聲溶解，制成分別含兩者1.328、1.234 mg/mL的貯備液；精密稱取丹酚酸B對(duì)照品適量，甲醇-水(8∶2)超聲溶解，制成含1.282 mg/mL該成分的貯備液。取上述5種貯備液適量，50%甲醇制成分別含126 819 ng/mL松果菊苷、2 657 ng/mL芍藥苷、2 563 ng/mL丹酚酸B、603.5 ng/mL毛蕊花糖苷、137.1 ng/mL丹參酮ⅡA的對(duì)照品溶液，置于4 ℃冰箱中貯存，臨用前用甲醇稀釋成所需質(zhì)量濃度。

2.3.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取蘆丁對(duì)照品適量，置于100 mL量瓶中，甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到貯備液(質(zhì)量濃度0.305 mg/mL)，置于4 ℃冰箱中貯存，臨用前取150 μL，甲醇稀釋至100 mL，即得(每1 mL含457.5 ng蘆丁)。

2.4 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脫(0～1.5 min，14%～30%A；1.5～3.0 min，30%～70%A；3.0～5.0 min，70%～90%A；5.0～6.0 min，90%A；6～6.1 min，90%～14%A；6.1～7.0 min，14%A)；體積流量0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

2.5 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源(ESI)；毛細(xì)管電離電壓3.5 kV；離子源溫度110 ℃；去溶劑氣N2，體積流量800 L/h，溫度500 ℃；反吹氣N2，體積流量50 L/h；碰撞氣Ar，體積流量0.13 mL/min；質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及處理軟件采用Masslynx4.1工作站，多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)模式，質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 各成分質(zhì)譜參數(shù)

2.6 樣品前處理 取大鼠血漿200 μL，置于1.5 mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液30 μL、6 mol/L甲酸50 μL、乙腈600 μL，渦旋混合2 min，17 000 r/min離心15 min，精密吸取上清液800 μL至另一離心管中，45 ℃氮?dú)獯蹈桑瑲埩粑锛?0%甲醇80 μL，渦旋復(fù)溶，17 000 r/min離心15 min，取上清液。

2.7 給藥與取樣 取正常組、模型組大鼠各6只，給藥前12 h禁食，自由飲水，灌胃給予等劑量顆?；鞈乙?10 g/kg，生理鹽水配制，用時(shí)溫水浴加熱至37 ℃)，給藥后于0.083、0.167、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、12、24、36 h眼眶取血各約0.5 mL，置于預(yù)先肝素化的離心管中靜置30 min，3 500 r/min離心10 min，取上層血漿，置于-20 ℃冰箱中貯存，待測(cè)。

2.8 方法學(xué)考察

2.8.1 專屬性試驗(yàn) 取正常組大鼠空白血漿、模型組大鼠空白血漿、正常組大鼠空白血漿加對(duì)照品、模型組大鼠空白血漿加對(duì)照品、給藥后正常組大鼠血漿、給藥后模型組大鼠血漿各200 μL，按“2.6”項(xiàng)下方法處理，在“2.4”“2.5”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分色譜峰與內(nèi)標(biāo)色譜峰分離度良好，內(nèi)源性物質(zhì)無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

2.8.2 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液適量，甲醇稀釋至系列質(zhì)量濃度，分別精密吸取200 μL，置于1.5 mL離心管中，45 ℃氮?dú)獯蹈?，精密加入空白血漿200 μL，渦旋混合3 min，制得血漿對(duì)照品溶液，按“2.6”項(xiàng)下方法處理，在“2.4”“2.5”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，對(duì)照品、內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表3，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。再配制質(zhì)量濃度處于標(biāo)準(zhǔn)曲線低濃度端的血漿對(duì)照品溶液，并逐漸稀釋，平行5份，以S/N=10測(cè)定最低定量濃度，平行5次，以相對(duì)誤差<20%、準(zhǔn)確度在真實(shí)質(zhì)量濃度80%～120%范圍內(nèi)的質(zhì)量濃度為定量限，測(cè)得松果菊苷、毛蕊花糖苷、芍藥苷、丹酚酸B、丹參酮ⅡA其數(shù)值分別為140.9、0.670 5、2.953、2.847、0.152 3 ng/mL，可滿足檢測(cè)要求。

a.松果菊苷 b.毛蕊花糖苷 c.內(nèi)標(biāo)(蘆丁) d.芍藥苷 e.丹酚酸B f.丹參酮ⅡAa.echinacoside b.acteoside c.internal standard(rutin) d.paeoniflorin e.salvianolic acid B f.tanshinone IIA圖1 各成分MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of various constituents

表3 各成分線性關(guān)系(n=7)

2.8.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液適量，按“2.8.2”項(xiàng)下方法處理，制備高、中、低質(zhì)量濃度的含內(nèi)標(biāo)血漿對(duì)照品溶液，平行5份，同一天在“2.4”“2.5”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定3 d，每天1次，計(jì)算日間精密度。結(jié)果，各成分精密度RSD均小于11.0%，表明該方法精密度良好，符合生物樣品分析要求。

2.8.4 方法回收率試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液適量，按“2.8.2”項(xiàng)下方法處理，制備高、中、低質(zhì)量濃度的含內(nèi)標(biāo)血漿對(duì)照品溶液，平行5份，在“2.4”“2.5”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，將測(cè)定值與對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的理論值進(jìn)行比較，計(jì)算方法回收率，結(jié)果見表4，可知該方法準(zhǔn)確度良好，符合生物樣品分析要求。

2.8.5 提取回收率試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液適量，按“2.8.2”項(xiàng)下方法處理，制備高、中、低質(zhì)量濃度的含內(nèi)標(biāo)血漿對(duì)照品溶液，平行5份，在“2.4”“2.5”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，得峰面積A；另取空白血漿，按“2.6”項(xiàng)下方法處理，加入對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的含內(nèi)標(biāo)對(duì)照品溶液，平行5份，在“2.4”“2.5”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，得峰面積B，計(jì)算提取回收率，公式為提取回收率=(A/B)×100%，結(jié)果見表4，可知該方法提取回收率良好，符合生物樣品分析要求。

2.8.6 基質(zhì)效應(yīng)考察 取正常組、模型組大鼠空白血漿，按“2.6”項(xiàng)下方法處理，制備高、中、低質(zhì)量濃度的含內(nèi)標(biāo)對(duì)照品溶液，平行5份，在“2.4”“2.5”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，得峰面積C；另取對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的含內(nèi)標(biāo)對(duì)照品溶液，按“2.8.2”項(xiàng)下方法處理(以水代替空白血漿)，平行5份，在“2.4”“2.5”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，得峰面積D，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，公式為基質(zhì)效應(yīng)=(C/D)×100%，同法考察內(nèi)標(biāo)基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表4，可知各成分及內(nèi)標(biāo)無(wú)明顯離子抑制或增強(qiáng)作用，內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，符合生物樣品分析要求。

表4 各成分方法回收率、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.8.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液適量，按“2.8.2”項(xiàng)下方法處理，制備高、中、低質(zhì)量濃度的含內(nèi)標(biāo)血漿對(duì)照品溶液，平行5份，在“2.4”“2.5”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，分別考察室溫放置(8 h)、反復(fù)凍融(1周內(nèi)進(jìn)行5次)、長(zhǎng)期凍融(在-20 ℃下保存15 d)時(shí)的穩(wěn)定性，結(jié)果見表5，可知各成分在不同條件下均呈現(xiàn)良好的穩(wěn)定性。

表5 各成分穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.9 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究 采用DAS 2.0軟件處理藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)，并通過(guò)非房室模型進(jìn)行分析，結(jié)果見表6、圖2。由此可知，給藥后模型組芍藥苷Tmax短于正常組，其他成分均保持不變；各成分血藥濃度均在0.25 h達(dá)到最高，AUC均高于正常組；毛蕊花糖苷Cmax低于正常組，其他成分均高于正常組，提示在帕金森病狀態(tài)下蓯蓉舒痙顆粒口服吸收后進(jìn)入體循環(huán)的相對(duì)量更高，以丹酚酸B更明顯，而毛蕊花糖苷在不同生理狀態(tài)下的差異較??；各成分t1/2均短于正常組，以丹酚酸B更明顯；松果菊苷、丹酚酸B MRT短于正常組，芍藥苷、丹參酮ⅡA更長(zhǎng)，而毛蕊花糖苷無(wú)明顯變化；各成分消除速度快于正常組，以丹酚酸B更明顯，提示在帕金森病狀態(tài)下蓯蓉舒痙顆粒效應(yīng)組分群的半衰期縮短，消除速度提升，其原因可能是發(fā)病時(shí)產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)激內(nèi)源性物質(zhì)，提高細(xì)胞色素P450活性[9-11]，從而促進(jìn)特征效應(yīng)組分群的代謝和消除。

綜上所述，蓯蓉舒痙顆粒的藥動(dòng)學(xué)標(biāo)志物是松果菊苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、丹酚酸B、丹參酮ⅡA，即為體內(nèi)外共有組分群中的特征效應(yīng)組分，并且在帕金森病狀態(tài)下口服吸收后其血藥濃度、Cmax、生物利用度明顯提高，從而發(fā)揮更好的作用。

3 討論

預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選去蛋白方法時(shí)發(fā)現(xiàn)，溶劑沉淀法效果較優(yōu)。再比較了甲醇、乙腈、甲醇-乙腈(1∶2)，發(fā)現(xiàn)乙腈去除蛋白較徹底，而且樣品回收率較高，故以其為蛋白沉淀溶劑。

結(jié)果顯示，蓯蓉舒痙顆粒特征效應(yīng)組分群在帕金森病大鼠中的藥動(dòng)學(xué)產(chǎn)生一定變化，血藥濃度、達(dá)峰濃度、口服生物利用度升高，并且正常與帕金森病大鼠血漿中各成分吸收峰均呈單一峰。由于藥物口服生物利用度決定于胃腸道吸收量，而腸道轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和代謝酶又是決定藥物胃腸道吸收的重要因素，故腸道菌群的改變會(huì)導(dǎo)致藥物在體內(nèi)代謝產(chǎn)物、代謝途徑甚至藥動(dòng)學(xué)特征發(fā)生改變。文獻(xiàn)[12]報(bào)道，帕金森病小鼠腸道微生物呈現(xiàn)紊亂狀態(tài)，腸桿菌科細(xì)菌(如毛螺旋菌科、腔隙桿菌屬等)數(shù)量顯著增多；患者腸道中α-突觸核蛋白累積[13-14]會(huì)導(dǎo)致腸黏膜屏障通透性增加[15]。由此推測(cè)，在帕金森病狀態(tài)下可能由于小腸絨毛上皮細(xì)胞屏障通透性增加，腸道酶菌群系統(tǒng)排斥作用減弱，可提高蓯蓉舒痙顆粒中效應(yīng)組分群的吸收，從而使該制劑能更好地發(fā)揮藥效。

表6 各成分主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

圖2 各成分血藥濃度-時(shí)間曲線(n=6)Fig.2 Plasma concentration-time curves for various constituents (n=6)