不同桑樹品種響應(yīng)干旱脅迫的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

曾?！∪斡纭∑顐チ痢↑S仁維　李戀龍　李鑫鑫　王飛　趙比黑

摘要：【目的】發(fā)掘響應(yīng)干旱脅迫的關(guān)鍵抗旱基因，從轉(zhuǎn)錄水平上揭示桑樹的抗旱分子機(jī)制，為后續(xù)開展桑樹分子抗旱性育種工作提供科學(xué)依據(jù)。【方法】以干旱敏感性品種德果1號(hào)和耐旱性品種湖桑32號(hào)為研究對(duì)象，通過盆栽種植方式開展干旱脅迫及復(fù)水處理試驗(yàn)，采集24個(gè)桑葉樣本提取總RNA后構(gòu)建cDNA文庫，在Illumina HiSeqTM 4000測序平臺(tái)上進(jìn)行高通量測序，并結(jié)合生物信息學(xué)對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行注釋分析?！窘Y(jié)果】經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測序，各樣本的Clean reads范圍為45723096～67280168條，有效堿基數(shù)（Clean bases）集中在6.86～10.09 Gb，GC含量在44.84%～46.48%（平均為45.61%），Q30在90.36%～93.07%。差異表達(dá)基因（DEGs）篩選結(jié)果顯示，6個(gè)差異分組（A2 vs A1，B2 vs B1，A3 vs A1，B3 vs B1，A4 vs A1，B4 vs B1）分別篩選出3510、3399、5677、5507、5124和2734個(gè)差異表達(dá)基因;經(jīng)干旱脅迫處理后，桑葉功能組基因中呈下調(diào)表達(dá)的差異表達(dá)基因明顯多于呈上調(diào)表達(dá)的差異表達(dá)基因，說明桑樹在生長過程中存在不同的功能基因以控制桑葉生長發(fā)育。不同抗旱性桑葉轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中以涉及生物學(xué)過程的差異表達(dá)基因最多，且主要集中在小分子代謝過程（Small molecule metabolic process）、跨膜運(yùn)輸（Transmembrane transport）及碳水化合物代謝過程（Carbohydrate metabolic process）等方面;與分子功能相關(guān)的差異表達(dá)基因次之，主要涉及轉(zhuǎn)移酶活性（Transferase activity）和水解酶（Hydrolase activity）等。干旱脅迫下不同抗旱性桑葉差異表達(dá)基因主要富集到59條KEGG信號(hào)通路上，可劃分為代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過程和生物系統(tǒng)五大信號(hào)通路;其中，抗旱性桑樹品種通過提高能量代謝、碳水化合物代謝、增強(qiáng)光合作用及脂質(zhì)代謝來更好地適應(yīng)干旱脅迫。綜合GO功能注釋分析和KEGG信號(hào)通路富集分析，得到以下可能與干旱相關(guān)的基因：LOC21410404、LOC21404884、LOC21409623、LOC21401352、LOC21398977、LOC21388561、LOC21401447、LOC21398764、LOC21385254、LOC21384661、LOC-21410404及LOC21408971?！窘Y(jié)論】不同桑樹品種的耐旱性存在顯著差異，其中抗旱性桑樹品種是通過提高能量代謝、碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝及光合作用共同應(yīng)對(duì)干旱脅迫。

關(guān)鍵詞：桑樹;干旱脅迫;抗旱性;轉(zhuǎn)錄組;差異表達(dá)基因

中圖分類號(hào)： S888.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2022）03-0684-09

Comparative transcriptome analysis of drought stress responses in mulberries of differing drought resistances

ZENG Rui， REN Ying-hong QI Wei-liang， HUANG Ren-wei， LI Lian-long，

LI Xin-xin， WANG Fei， ZHAO Bi-hei

（College of Chemistry and Life Science， Chengdu Normal University， Chengdu， Sichuan? 611130， China）

Abstract：【Objective】To identify drought-resistance genes operating in mulberry under drought stress and reveal the molecular mechanism of drought resistance in mulberry at the transcriptional level， so as to provide a theoretical basis to support the breeding for and the selection of drought-resistance in mulberry. 【Method】The drought-sensitive mulberry variety of Deguo 1 and drought-tolerant mulberry variety Husang 32 were used as the research materials. The drought stress and the control group of rehydration treatment were carried out through pot cultivation. Total RNA was extracted from 24 mulberry leaf samples， cDNA libraries was constructed， and then subject to high-throughput sequencing on the Illumina HiSeqTM 4000 platform. Drought-related genes were annotated and analyzed in combination with bioinformatics. 【Result】The results showed that clean reads ranged from 45723096 to 67280168， with clean bases concentrated in 6.86 Gb to 10.09 Gb， with a GC content of 44.84%-46.48% （average 45.61%） and Q30 scores of 90.36%-93.07%. The number of differentially expressed genes （DEGs） between samples （A2 vs A1， B2 vs B1， A3 vs A1， B3 vs B1， A4 vs A1， B4 vs B1） were：3510，3399，5677，5507，5124 and 2734， respectively. There were a smaller number of up-regulated genes than down-regulated genes after drought stress treatment of mulberry. DEGs between the mulberries of differing drought resistance were most enriched in biological processes， consisting mainly of small molecule metabolic process， transmembrane transport and carbohydrate metabolic process. DEGs involved in molecular function were the second most enriched， consisting mainly of transferase activity and hydrolase activity. DEGs were enriched in 59 KEGG signaling pathways， which can be divided into five categories： metabolism， genetic information processing， environmental information processing， cellular processes and biological systems. Drought-resistant mulberry varieties could better adapt to drought stress by their increased expression of genes involved in energy metabolism， carbohydrate metabolism， photosynthesis and lipid meta-bolism. GO functional annotation and KEGG signal pathway enrichment analyses were combined to obtain the drought-resistance genes：LOC21410404，LOC21404884，LOC21409623，LOC21401352，LOC21398977，LOC21388561， LOC21401447， LOC21398764， LOC21385254， LOC21384661， LOC21410404 and LOC21408971. 【Conclusion】 The higher drought tolerance of the mulberry variety Husang 32 relative to the variety Deguo 1 involved significant differential expression of genes under drought stress related with enhancements in energy metabolism， carbohydrate metabolism， photosynthesis and lipid metabolism.D469D8A7-8DA9-4B0F-AA21-212FF56397DA

Key words： mulberry （Morus alba L.）; drought stress; drought-resistant; transcriptome; differentially expressed genes （DEGs）

Foundation items： Sichuan Science and Technology Project （2018JY0442）; Sichuan Higher Education Talent Cultivation Quality and Education Reform Project （JG2018-888，JG2018-885）; The University-level Innovation Project of Chengdu Normal University （CSCXTD2020A04）

0 引言

【研究意義】桑樹（Morus alba L.）隸屬于?？疲∕oraceae）桑屬（Morus），為典型的落葉型多年生深根性木本植物（杜偉等，2016，2017;劉丹等，2020）。桑樹的深根性決定其水分主要借助于自身強(qiáng)大的根群系統(tǒng)，一旦遇到水分缺乏則會(huì)嚴(yán)重影響桑樹的生長發(fā)育，尤其是在氣溫相對(duì)較高夏秋季。攀西地區(qū)是我國重要的蠶桑生產(chǎn)基地，蠶桑產(chǎn)業(yè)發(fā)展對(duì)促進(jìn)當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收及水土保持具有重要意義。但受制于攀西地區(qū)的特殊地理位置，常出現(xiàn)大規(guī)模、持續(xù)性的干旱，給桑樹的生長發(fā)育帶來嚴(yán)重威脅，進(jìn)而制約著蠶桑產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展（Liu et al.，2019c）。因此，深入全面開展桑樹干旱脅迫機(jī)理研究，不僅有利于促進(jìn)桑樹的育種創(chuàng)新，對(duì)保障我國蠶桑產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展也具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】大多數(shù)植物在遇到干旱或水分不足的情況下均會(huì)借助復(fù)雜的生理代謝和細(xì)胞過程以確保及維系自身生長發(fā)育（李捷等，2019;林艷華等，2019;徐瀾等，2020），其中存在大量的細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄，因此，基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)從整體角度對(duì)植物細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄及基因調(diào)控進(jìn)行系統(tǒng)研究，對(duì)深入了解干旱脅迫下的分子機(jī)制及挖掘抗旱基因具有重要意義，進(jìn)而為培育高抗逆性品種提供理論依據(jù)（Bokonon-Ganta et al.，2013）。已有研究針對(duì)馬鈴薯（Zhang et al.，2014）、小麥（Liu et al.，2015;Kumar et al.，2018）、油菜（Dong et al.，2017）、花生（Zhao et al.，2018）及玉米（姚啟倫等，2021）等作物在干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行深入分析，鑒定出相應(yīng)的干旱脅迫應(yīng)答基因，并證實(shí)這些差異表達(dá)基因主要富集在氧化磷酸化、光合作用和植物代謝途徑中，但有關(guān)轉(zhuǎn)錄組學(xué)在桑樹抗旱方面的研究報(bào)道較少。Wei等（2014）基于川?；蚪M數(shù)據(jù)庫的全基因組分析克隆了10個(gè)MnMAPK基因，結(jié)果表明MnMAPK基因可能參與桑樹的缺水脅迫途徑，但未發(fā)現(xiàn)干旱脅迫應(yīng)答的調(diào)控途徑;周宏（2017）以桑樹育71-1品種為材料，初步明確了桑樹trihelix、bZIP、MYB和ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員在干旱脅迫中的表達(dá)變化規(guī)律;Li等（2017）通過高通量測序技術(shù)研究桑樹抗旱的關(guān)聯(lián)miRNA及其靶基因，證實(shí)miR156、miR172和miR39家族靶基因在干旱脅迫下發(fā)揮重要作用。此外，有研究發(fā)現(xiàn)MRD22基因（Wang et al.，2014）、EIL3基因（Liu et al.，2019a）、PPO1基因（Liu et al.，2019b）等在桑樹干旱脅迫下的表達(dá)量有所改變。【本研究切入點(diǎn)】隨著川桑全基因組序列的公布，越來越多學(xué)者將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到桑樹抗性基因，有關(guān)桑樹耐旱分子機(jī)制的研究已有較多報(bào)道（劉丹等，2020），但鮮見基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對(duì)干旱脅迫下桑樹基因的表達(dá)水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)跟蹤分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于高通量測序?qū)ι涓珊得{迫及復(fù)水處理階段的基因表達(dá)模式進(jìn)行研究，發(fā)掘響應(yīng)干旱脅迫的關(guān)鍵抗旱基因，并結(jié)合生物信息學(xué)對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行注釋分析，從轉(zhuǎn)錄水平揭示桑樹抗旱的分子機(jī)制，為后續(xù)開展桑樹分子抗旱性育種工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試桑樹品種[干旱敏感性品種德果1號(hào)（GS），耐旱性品種湖桑32號(hào)（HS）]由成都師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院提供。試驗(yàn)試劑主要有TRIzol試劑盒（美國Invitrogen公司）及TruSeq RNA Sample Prep Kit v2（美國Illumina公司）。主要設(shè)備儀器：Agilent 2100生物分析儀（G2939AA），Illumina HiSeqTM 4000測序儀，Eppendorf Centrifuge 5418離心機(jī)。

1. 2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及取樣

采用10 L營養(yǎng)土塑料盆栽種植方式，每盆種植4株桑樹幼苗，于出苗后選取長勢一致的德果1號(hào)和湖桑32號(hào)各24盆（株高約45 cm）。試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理（表1），每處理重復(fù)6次，水分處理分別為對(duì)照處理（CK）（正常供水85%）、輕度干旱脅迫（土壤田間含水量為65%～75%）、重度干旱脅迫（土壤田間含水量為35%～40%）和復(fù)水處理。采用烘干稱重法測定含水量，每天晚上20：00取土樣，當(dāng)含水量達(dá)脅迫處理要求后，于次日上午8：00取植株樹冠同方位、同葉位的桑葉，經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｈ∩Ｈ~樣品進(jìn)行總RNA提取，重復(fù)3次。

1. 3 RNA提取與cDNA文庫構(gòu)建

所有桑葉樣品采用TRIzol試劑盒提取總RNA，具體過程參照其說明進(jìn)行操作。根據(jù)構(gòu)建cDNA文庫的要求進(jìn)行RNA樣品純度及質(zhì)量檢測，并精準(zhǔn)定量檢測RNA濃度及其完整性。檢測合格的RNA樣品使用Oligo（dT）磁珠對(duì)mRNA進(jìn)行富集，經(jīng)Fragmentation緩沖液隨機(jī)打斷后，以此為模板借助六核苷酸隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成雙鏈cDNA，并在DNA聚合酶I體系下以dNTPs為原料合成cDNA第二鏈。使用試劑盒純化雙鏈cDNA，經(jīng)末端修復(fù)和加poly（A）尾后連接測序接頭，采用AMPure XP Beads進(jìn)行片段篩選（250～300 bp），通過PCR擴(kuò)增富集構(gòu)建cDNA文庫。cDNA文庫質(zhì)量檢測合格后，在Illumina HiSeqTM 4000測序平臺(tái)上開展高通量測序工作。D469D8A7-8DA9-4B0F-AA21-212FF56397DA

1. 4 數(shù)據(jù)分析

原始序列（Raw reads）數(shù)據(jù)提交至NCBI序列讀取歸檔數(shù)據(jù)庫，根據(jù)比對(duì)效率（Mapped ratio）及有效序列（Clean reads）在參考基因組上分布情況進(jìn)行質(zhì)量審查;以確認(rèn)合格的Clean reads為生物信息學(xué)分析樣品，進(jìn)行新基因預(yù)測發(fā)掘及表達(dá)差異分析，基于GO和KEGG等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行差異表達(dá)基因（Diffe-rential expressed genes，DEGs）功能注釋分析，并以O(shè)rigin 2018制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量

以德果1號(hào)和湖桑32號(hào)的桑葉組織為基礎(chǔ)，選取18個(gè)干旱處理樣本及6個(gè)對(duì)照樣本的RNA，共同構(gòu)建cDNA文庫。對(duì)24個(gè)樣本的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示各樣本的Clean reads數(shù)量為45723096～67280168條，有效堿基數(shù)（Clean bases）集中在6.86～10.09 Gb，GC含量在44.84%～46.48%（平均45.61%），Q30在90.36%～93.07%。Clean reads與桑葉參考基因組樣本的對(duì)比結(jié)果顯示，二者的Mapped ratio超過75.00%，即轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可靠，能滿足后續(xù)研究的要求。

2. 2 干旱脅迫下不同抗旱性桑葉差異表達(dá)基因的表達(dá)情況

不同抗旱性桑葉響應(yīng)干旱脅迫的差異表達(dá)基因表達(dá)模式見圖1。與CK相比，德果1號(hào)在輕度干旱脅迫下的差異表達(dá)基因共有3399個(gè)，其中上調(diào)基因1675個(gè)、下調(diào)基因1724個(gè);在重度干旱脅迫下的差異表達(dá)基因共有5507個(gè)，其中上調(diào)基因2879個(gè)、下調(diào)基因2628個(gè);復(fù)水處理后共產(chǎn)生2734個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因1419個(gè)、下調(diào)基因1315個(gè)。與CK相比，湖桑32號(hào)在輕度干旱脅迫下的差異表達(dá)基因共有3510個(gè)，其中上調(diào)基因1546個(gè)、下調(diào)基因1964個(gè);重度干旱脅迫下的差異表達(dá)基因共有5677個(gè)，其中上調(diào)基因2674個(gè)、下調(diào)基因3003個(gè);復(fù)水后共產(chǎn)生5124個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因2374個(gè)、下調(diào)基因2750個(gè)。德果1號(hào)和湖桑32號(hào)在不同干旱脅迫下的基因表達(dá)水平存在明顯差異，輕度干旱脅迫與重度干旱脅迫相比，2個(gè)品種桑葉的上調(diào)基因和下調(diào)基因數(shù)量均呈上升趨勢，德果1號(hào)的上升幅度分別為41.82%和34.40%，湖桑32號(hào)對(duì)應(yīng)的上升幅度分別是42.18%和34.60%;重度干旱脅迫與復(fù)水相比，2個(gè)品種桑葉的上調(diào)基因和下調(diào)基因數(shù)量則呈明顯的下降趨勢，德果1號(hào)的下降幅度分別為50.71%和49.94%，湖桑32號(hào)對(duì)應(yīng)的下降幅度分別是11.22%和8.42%。經(jīng)干旱脅迫處理后，桑葉功能組基因中呈下調(diào)表達(dá)的差異表達(dá)基因明顯多于呈上調(diào)表達(dá)的差異表達(dá)基因，說明桑樹在生長過程中存在不同的功能基因以控制桑葉生長發(fā)育。所有桑樹幼苗在干旱環(huán)境下均呈現(xiàn)出萎蔫、發(fā)育遲緩等癥狀，以此應(yīng)對(duì)水分的缺乏。

2. 3 桑葉差異表達(dá)基因的GO功能注釋分析結(jié)果

GO功能注釋分析在于表現(xiàn)樣本體內(nèi)所有差異表達(dá)基因及其產(chǎn)物的表達(dá)情況和屬性，能真實(shí)反映6個(gè)比較組的生物學(xué)過程（Biological process）、分子功能（Molecular function）及細(xì)胞組分（Cellular component）三大功能。由圖2可知，A2 vs A1注釋到的差異表達(dá)基因共2141個(gè)，涉及生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞組分的差異表達(dá)基因分別為1074個(gè)（占50.16%）、828個(gè)（占38.67%）和239個(gè)（占11.16%）;A3 vs A1注釋到的差異表達(dá)基因共3191個(gè)，涉及生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞組分的差異表達(dá)基因分別為1665個(gè)（占52.18%）、1146個(gè)（占35.91%）和380個(gè)（占11.91%）;A4 vs A1注釋到的差異表達(dá)基因共3088個(gè)，涉及生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞組分的差異表達(dá)基因分別為1554個(gè)（占50.32%）、977個(gè)（占31.64%）和557（占18.04%）;B2 vs B1注釋到的差異表達(dá)基因共1836個(gè)，涉及生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞組分的差異表達(dá)基因分別為938個(gè)（占51.09%）、583個(gè)（占31.75%）和315個(gè)（占17.16%）;B3 vs B1注釋到的差異表達(dá)基因共2892個(gè)，涉及生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞組分的差異表達(dá)基因分別為1419個(gè)（占49.07%）、1034個(gè)（占35.75%）和439個(gè)（占15.18%）;B4 vs B1注釋到的差異表達(dá)基因共1523個(gè)，涉及生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞組分的差異表達(dá)基因分別為788個(gè)（占51.74%）、519個(gè)（占34.08%）和216個(gè)（占14.18%）?？梢?，不同抗旱性桑葉轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中以涉及生物學(xué)過程的差異表達(dá)基因最多，且主要集中在小分子代謝過程（Small molecule metabolic process）、跨膜運(yùn)輸（Transmembrane transport）及碳水化合物代謝過程（Carbohydrate metabolic process）等方面;與分子功能相關(guān)的差異表達(dá)基因次之，主要涉及轉(zhuǎn)移酶活性（Transferase activity）和水解酶（Hydrolase activity）等。

2. 4 桑葉差異表達(dá)基因KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果

KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果（表3）表明，不同抗旱性桑葉差異表達(dá)基因均富集到新陳代謝（Metabolism）、遺傳信息處理（Genetic information processing）、環(huán)境信息處理（Environmental information processing）、細(xì)胞過程（Cellular processes）和生物系統(tǒng)（Bidogcial system）五大信號(hào)通路上，主要涉及到碳水化合物代謝、運(yùn)輸和分解代謝、其他氨基酸代謝、次生代謝產(chǎn)物生物合成、能量代謝、糖的生物合成與代謝、脂質(zhì)代謝、輔助因子和維生素代謝、萜類和聚酮類化合物代謝、核苷酸代謝、環(huán)境適應(yīng)、轉(zhuǎn)錄及翻譯等。D469D8A7-8DA9-4B0F-AA21-212FF56397DA

干旱脅迫下不同抗旱性桑葉DEGs主要富集到59條KEGG信號(hào)通路上（圖3），表明干旱脅迫對(duì)桑葉的淀粉和蔗糖代謝（Starch and sucrose metabolism）、環(huán)境適應(yīng)（Environmental adaptation）、脂肪酸降解（Fatty acid degradation）、碳代謝（Carbon metabolism）、半乳糖代謝（Galactose metabolism）、α-亞麻酸代謝（Alpha-linolenic acid metabolism）、糖酵解/糖異生（Glycolysis/gluconeogenesis）、亞油酸代謝（Linoleic acid metabolism）、甘油脂代謝（Glycerolipid metabolism）、脂肪酸代謝（Fatty acid metabolism）、β-丙氨酸代謝（Beta-alanine metabolism）、磷酸戊糖途徑（Pentose phosphate pathway）、抗壞血酸和藻酸鹽代謝（Ascorbate and aldarate metabolism）、纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸降解（Valine/leucine/isoleucine degradation）、果糖和甘露糖代謝（Fructose and mannose metabolism）、丙酮酸代謝（Pyruvate metabolism）、不飽和脂肪酸生物合成（Biosynthesis of unsaturated fatty acids）、核糖體（Ribosome）、光合作用（Photosynthesis）、光合生物中的碳固定（Carbon fixation in photosynthetic organisms）、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Plant hormone signal transduction）、卟啉和葉綠素代謝（Porphyrin and chlorophyll metabolism）、乙醛酸和二元羧酸鹽代謝（Glyoxylic acid and dicarboxylate metabolism）等有明顯影響。與CK相比，輕度干旱脅迫下參與淀粉和蔗糖代謝的差異表達(dá)基因有36個(gè)，重度干旱脅迫下參與半乳糖代謝的差異表達(dá)基因有24個(gè)、參與糖酵解/糖異生的差異表達(dá)基因有39個(gè)、參與亞油酸代謝的差異表達(dá)基因有9個(gè)、參與甘油脂代謝的差異表達(dá)基因有26個(gè)、參與脂肪酸代謝的差異表達(dá)基因有27個(gè)、參與纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸降解的差異表達(dá)基因有20個(gè)、參與果糖和甘露糖代謝的差異表達(dá)基因有19個(gè)、參與丙酮酸代謝的差異表達(dá)基因有28個(gè)、參與不飽和脂肪酸生物合成的差異表達(dá)基因有10個(gè)。從差異表達(dá)基因在KEGG信號(hào)通路上的富集情況來看，抗旱性桑樹品種通過提高能量代謝、碳水化合物代謝、增強(qiáng)光合作用及脂質(zhì)代謝來更好地適應(yīng)干旱脅迫，在逆境中保持存活。綜合GO功能注釋分析和KEGG信號(hào)通路富集分析，得到以下可能與干旱相關(guān)的基因：LOC21410404、LOC21404884、LOC21409623、LOC21401352、LOC 21398977、LOC21388561、LOC21401447、LOC2139 8764、LOC21385254、LOC21384661、LOC21410404及LOC21408971。

3 討論

桑樹的生物學(xué)遺傳背景相當(dāng)復(fù)雜，但其分子學(xué)研究基礎(chǔ)還很薄弱。植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)涉及生理、生物化學(xué)和分子變化等復(fù)雜的生物學(xué)過程，桑樹根系發(fā)達(dá)，能在干旱的貧瘠環(huán)境下生長，究其原因是桑樹能借助次生代謝和光合作用強(qiáng)化、能量代謝水平提升、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)換等有效應(yīng)對(duì)干旱，但在實(shí)際種植過程中發(fā)現(xiàn)不同桑樹品種在抗旱機(jī)制上存在明顯差異。為此，本研究基于高通量測序?qū)ι涓珊得{迫及復(fù)水處理階段的基因表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果從6個(gè)差異分組（A2 vs A1，B2 vs B1，A3 vs A1，B3 vsB1，A4vsA1，B4 vs B1）分別篩選出3510、3399、5677、5507、5124和2734個(gè)差異表達(dá)基因，經(jīng)GO功能注釋分析后得到的差異表達(dá)基因分別為2141、3191、3088、1836、2892和1523個(gè)。此外，經(jīng)干旱脅迫處理的絕大多數(shù)桑葉功能基因呈下調(diào)表達(dá)趨勢，只有少數(shù)基因呈上調(diào)表達(dá)趨勢。說明桑樹在生長過程中存在不同的功能基因以控制桑葉生長發(fā)育。鞏檑等（2015）研究證實(shí)，基因表達(dá)上調(diào)是葉片對(duì)水分刺激的響應(yīng)，基因表達(dá)下調(diào)則是對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)。無論是動(dòng)物還是植物，其新陳代謝最核心的特征就是能量代謝，以植物為例主要集中在光合作用、氧化磷酸化及碳固定、氮代謝等方面。受干旱脅迫的影響，絕大多數(shù)植物的光合速率呈下降趨勢，進(jìn)而抑制光合作用和葉綠素生成。如干旱脅迫下楊樹葉片內(nèi)涉及PS I和PS II、電子傳遞鏈基因表達(dá)水平出現(xiàn)不同程度的下調(diào)，而導(dǎo)致三羧酸循環(huán)明顯降低（Jia et al.，2020）。本研究也發(fā)現(xiàn)桑葉在干旱脅迫環(huán)境下其光合作用及光合—觸角蛋白代謝通路呈現(xiàn)明顯的富集現(xiàn)象，表明光合器官受到損害，光合速率及對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物產(chǎn)出受到抑制，與李慧娟等（2019）對(duì)小麥干旱脅迫的研究結(jié)論相似。

植物的生長發(fā)育過程離不開以碳水化合物代謝為首的生化過程。本研究結(jié)果表明，測序篩選出的桑葉差異表達(dá)基因以參與碳水化合物代謝為主，其中又以涉及淀粉和蔗糖代謝的差異表達(dá)基因下調(diào)表達(dá)為主。究其原因是桑葉在干旱環(huán)境下將淀粉降解為葡萄糖以調(diào)控植物滲透調(diào)節(jié)，更好地應(yīng)對(duì)干旱脅迫（Liu et al.，2016）。脂質(zhì)是生物膜的重要成分，植物質(zhì)膜脂肪酸主要由棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸和亞麻酸組成，而膜脂組成成分的變化能反映植物對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)程度。已有研究表明，干旱脅迫會(huì)導(dǎo)致馬鈴薯葉片中細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的穩(wěn)定強(qiáng)化基因上調(diào)表達(dá)，包括纖維素合成酶、果膠泛酸酶及脂質(zhì)結(jié)合蛋白等編碼基因（Zhang et al.，2014）。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫會(huì)影響桑葉中與脂肪酸降解和α-亞麻酸代謝相關(guān)的基因表達(dá)，通過保護(hù)細(xì)胞膜的流動(dòng)性以緩解應(yīng)對(duì)干旱脅迫，與李東等（2018）的研究結(jié)果一致，即α-亞麻酸能通過提高種子萌發(fā)過程中的α-淀粉酶活性來緩解干旱脅迫。由于作物品種及脅迫方式的不同，基因所調(diào)節(jié)的途徑也各不相同。趙雅杰等（2022）研究發(fā)現(xiàn)，向日葵在干旱脅迫下其植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蔗糖與淀粉代謝、氨基酸代謝有明顯的富集現(xiàn)象。萬麗云等（2018）對(duì)花生苗期進(jìn)行干旱脅迫處理，KEGG信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn)花生是通過其發(fā)達(dá)根系系統(tǒng)、能量代謝、次生代謝和生長抑制等4個(gè)方面共同應(yīng)對(duì)干旱脅迫。可見，在逆境脅迫下植物會(huì)通過基因調(diào)控作用以改變相關(guān)的代謝途徑。D469D8A7-8DA9-4B0F-AA21-212FF56397DA

4 結(jié)論

不同桑樹品種的抗旱性存在明顯差異，其中抗旱性桑樹品種是通過提高能量代謝、碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝及光合作用共同應(yīng)對(duì)干旱脅迫。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）D469D8A7-8DA9-4B0F-AA21-212FF56397DA