UV-C處理穿心蓮轉(zhuǎn)錄組分析及穿心蓮內(nèi)酯合成相關(guān)基因挖掘

孫銘陽　徐世強　李靜宇　顧艷　梅瑜　張聞婷　周芳　王繼華

摘要：【目的】對紫外線C（UV-C）處理的穿心蓮葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，挖掘穿心蓮內(nèi)酯合成相關(guān)基因，為深入探究穿心蓮內(nèi)酯合成相關(guān)基因的調(diào)控機制和生物學(xué)功能提供理論參考?！痉椒ā窟x用生長60 d的穿心蓮幼苗為材料，經(jīng)UV-C照射2 h后，利用Illumina HiSeq二代測序平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，并結(jié)合生物信息學(xué)軟件和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）對所得序列進(jìn)行功能注釋和相對表達(dá)水平驗證，挖掘響應(yīng)UV-C的穿心蓮內(nèi)酯合成相關(guān)基因?！窘Y(jié)果】共注釋到21545個穿心蓮基因，有2137個基因呈顯著差異表達(dá)模式，其中，1147個基因顯著上調(diào)表達(dá)，990個基因顯著下調(diào)表達(dá)。GO功能注釋結(jié)果顯示，UV-C處理造成了氧化脅迫，線粒體氧化磷酸化電子傳遞鏈的NADH脫氫酶基因上調(diào)表達(dá)。KEGG代謝通路富集結(jié)果顯示，二萜類物質(zhì)穿心蓮內(nèi)酯的前體（E，E，E）-香葉基香葉基二磷酸（GGPP）合成途徑[甲羥戊酸（MVA）途徑和2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）途徑]差異表達(dá)基因顯著富集。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測結(jié)果均顯示，MVA途徑的4種合成酶基因HMGS（CXN00016849）、HMGR（CXN00000058）、MVK（CXN00002900）和MVD（CXN00004398）及GGPP合成關(guān)鍵酶基因FPS的表達(dá)量顯著上調(diào);MEP途徑中，僅DXS（CXN00013302）的表達(dá)量顯著下調(diào)。蛋白互作預(yù)測結(jié)果顯示，2個途徑中的差異表達(dá)基因編碼蛋白之間存在互作，HMGS與CYP71家族成員之間，以及FPS1與UGT71、UGT73和UGT76之間的互作網(wǎng)絡(luò)豐富。【結(jié)論】UV-C照射調(diào)控穿心蓮重要生命進(jìn)程，其中，次生代謝、氧化磷酸化、光合作用等途徑基因轉(zhuǎn)錄本的相對表達(dá)量呈UV-C特異性響應(yīng)模式。合成穿心蓮內(nèi)酯前體GGPP的細(xì)胞質(zhì)MVA途徑基因顯著上調(diào)表達(dá)，推測UV-C誘導(dǎo)穿心蓮內(nèi)酯合成的主要場所為細(xì)胞質(zhì)。穿心蓮MVA途徑基因及CYP71、UGT71、UGT73和UGT76可作為穿心蓮內(nèi)酯合成途徑研究的候選分子靶標(biāo)。

關(guān)鍵詞： 穿心蓮;紫外線C（UV-C）;轉(zhuǎn)錄組分析;穿心蓮內(nèi)酯;基因挖掘;可變剪切;蛋白互作

中圖分類號： S567.239? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2022）03-0618-10

Transcriptome analysis and discovery of genes related to

andrographolide synthesis of Andrographis paniculata

under UV-C treatment

SUN Ming-yang XU Shi-qiang LI Jing-yu GU Yan MEI Yu ZHANG Wen-ting ZHOU Fang WANG Ji-hua

（1Crops Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Science/Guangdong Provincial Key Laboratory of Crops Genetics Improvement， Guangzhou， Guangdong? 510640， China; 2Guangdong Provincial Engineering and Technology Research Center for Conservation and Utilization of the Genuine Southern Medicinal Resources， Guangzhou，

Guangdong? 510640， China）

Abstract：【Objective】Transcriptome sequencing was performed on the leaves of Andrographis paniculata treated with ultraviolet C （UV-C）， and the genes related to andrographolide synthesis were excavated to provide reference for further exploring the regulatory mechanism and biological functions of andrographolide synthesis-related genes. 【Method】A.paniculata seedlings grown for 60 days were selected as experimental materials. After 2 h of UV-C irradiation， their transcriptome was sequenced using the 2nd-generation sequencing platform， andwith bioinformatics software and qRT-PCR，the sequence were evaluated by gene expression analysis and functional annotation to identify genes related to andrographolide synthesis in response to UV-C. 【Result】A total of 21545 A.paniculata genes were annotated， and 2137 genes showed significant differential expression （SDE） patterns. Among them， 1147 genes were significantly up-regulated and 990 genes were significantly down-regulated. GO annotation results showed that UV-C treatment caused oxidative stress， and the expression of NADH dehydrogenase genes in mitochondrial oxidative phosphorylation electron transport chain were significantly up-regulated. KEGG metabolic pathway enrichment analysis showed that the precursor of andrographolide（E，E，E）-geranylgeranyl diphosphate （GGPP） synthesis pathway （Mevalonate， MVA pathway and 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP pathway） SDE genes were significantly enriched. According to the results of RNA-seq and real-time quantitative PCR（qRT-PCR）， the expression of four synthase genes in the MVA pathway， HMGS （CXN00016849）， HMGR （CXN00000058）， MVK （CXN00002900） and MVD （CXN00004398）， as well as GGPP synthesis key enzyme FPS were significantly up-regulated. In the MEP pathway， only the expression of DXS （CXN00013302） was significantly down-regulated. The type of alternative splicing （AS） that commonly occurs in the genes of the two pathways was exon skipping （SE）. The protein interaction prediction showed that there were interactions between the differentially expressed genes （DEGs） of the two pathways， and the interaction networks between HMGS and CYP71 family members， and the ones among FPS1， UGT71， UGT73 and UGT76 were enriched. 【Conclusion】 UV-C irradiation regulates important life processes of A. paniculata. The relative expression of gene transcripts in secondary metabolism， oxidative phosphorylation， photosynthesis and other pathways show UV-C-specific response pattern. The expressions of cytoplasmic MVA pathway genes are significantly up-regulated. It is speculated that the main site of UV-C-induced andrographolide synthesis is the cytoplasm. A. paniculata MVA pathway genes，CYP71， UGT71， UGT73 and UGT76 can be used as candidate molecular targets for andrographolide synthesis pathway research.938D37B0-0BF6-4583-A58F-FB85E89CBAAF

Key words： Andrographis paniculata; UV-C; transcriptome analysis; andrographolide; gene mining; alternative splicing; protein interaction

Foundation items：Guangdong Special Funds for Science and Technology Innovation Strategy（R2019PY-JX003）;Guangdong Province Key Field Research and Development Project（2020B020221001）; Crop Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Improvement Open Research Fund （202101）

0 引言

【研究意義】穿心蓮（Andrographis paniculata）為唇形目爵床科穿心蓮屬植物，是傳統(tǒng)中藥材，廣泛分布于東南亞地區(qū)（Okhuarobo et al.，2014），自20世紀(jì)50年代引入我國后，已被多種復(fù)方所收錄（張曉等，2018）。穿心蓮的藥效強勁，有效地抑制了印度1919年爆發(fā)的大流感（Sun et al.，2018）。最新研究表明，穿心蓮可緩解新冠肺炎患者的發(fā)熱和咳嗽（Jalali et al.，2021）。穿心蓮內(nèi)酯（C₂₀H₃₀O₅）是穿心蓮發(fā)揮藥效的主要次生代謝活性成分，屬于二萜類內(nèi)酯，食味發(fā)苦（Abu-Ghefreh et al.，2009）。然而，穿心蓮內(nèi)酯的含量受不同品種、產(chǎn)地、栽培技術(shù)、收獲時間和加工技術(shù)等因素影響較大，很難滿足穿心蓮產(chǎn)品的市場化需求。因此，開展穿心蓮內(nèi)酯合成途徑相關(guān)基因的分子機制研究，對高效挖掘調(diào)控穿心蓮次生代謝的主效基因具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】2019年之前，由于穿心蓮缺少基因組信息，相關(guān)研究重點主要為臨床藥理活性和代謝產(chǎn)物分離等方面。2019年起，已陸續(xù)公開2個穿心蓮基因組數(shù)據(jù)庫，但仍存在基因功能注釋不全面和部分基因組位置組裝質(zhì)量不高等問題，導(dǎo)致穿心蓮二萜類物質(zhì)合成相關(guān)功能基因研究仍處于較淺層面。Wang等（2019）利用克隆技術(shù)獲得4個假定的穿心蓮二萜合成關(guān)鍵酶基因（ApGGPPS）的cDNA序列，并通過原核表達(dá)驗證了其中3個基因能夠表達(dá)目的蛋白。Srinath等（2020）對1個假定的穿心蓮MVA途徑限速酶基因（ApHMGR）的cDNA進(jìn)行分離，結(jié)合qRT-PCR和高效液相色譜技術(shù)證實了該基因的表達(dá)量與穿心蓮內(nèi)酯的含量呈正相關(guān)。目前，大量研究證實，紫外線C（UV-C，波長介于100～280 nm）照射可增強植物次生代謝產(chǎn)物的積累。該手段簡便且見效較快，在草藥、蔬菜和水果產(chǎn)業(yè)中得到廣泛應(yīng)用（Ma et al.，2019）。Xu等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，草莓（Fragaria ana-nassa Duchesne）經(jīng)UV-C照射后其萜類物質(zhì)含量上升26%。Alsoufi等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，UV-C處理的金盞花（Calendula officinalis）毛狀根中萜類物質(zhì)含量是未處理的8.5倍。然而，植物細(xì)胞過度暴露于UV-C下會誘導(dǎo)其產(chǎn)生活性氧（Reactive oxygen species，ROS），從而促進(jìn)光氧化，損害光系統(tǒng)（Photosystem II，PSII），導(dǎo)致光合活性降低（Darras et al.，2020）。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)能在RNA水平反映基因表達(dá)的時空特異性和脅迫應(yīng)激特異性，現(xiàn)已成為探索藥用植物次生代謝分子機制的重要手段（李鉑等，2020）。目前已超過50種傳統(tǒng)藥用植物實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)解析，包括穿心蓮、人參（Panax ginseng）和冬蟲夏草（Cordyceps）等（李慧等，2018）。Garg等（2015）利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對穿心蓮不同組織的二萜類物質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)水平進(jìn)行解析。Gao等（2019）利用茉莉酸甲酯處理的穿心蓮轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)評估了穿心蓮內(nèi)酯合成關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄本的可變剪切（Alternative splicing，AS）情況?！颈狙芯壳腥朦c】目前，鮮見有關(guān)UV-C處理穿心蓮的轉(zhuǎn)錄組測序的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對UV-C處理穿心蓮葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，并結(jié)合生物信息學(xué)軟件和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）對所得序列進(jìn)行功能注釋和相對表達(dá)水平驗證，重點挖掘響應(yīng)UV-C的穿心蓮內(nèi)酯合成相關(guān)基因，以期解析UV-C對穿心蓮內(nèi)酯合成的影響，為探究相關(guān)基因的調(diào)控機制提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

選用福建漳州生產(chǎn)用穿心蓮種，將其種植并培養(yǎng)于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所農(nóng)作物遺傳改良重點實驗室的光照培養(yǎng)箱（光照/黑暗：16 h/8 h;溫度：28 ℃）中，土壤為草炭土（HAWITA），培養(yǎng)期間保持土壤濕潤。幼苗培養(yǎng)60 d，生長時間為2020年4月25日—6月24日。主要試劑：RNA提取試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司;RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自諾唯贊生物科技股份有限公司;實時熒光定量PCR（qRT-PCR）擴增試劑盒購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司;引物由湖北擎科生物科技有限公司合成。主要設(shè)備儀器：GXZ智能型人工氣候箱（寧波江南儀器廠）、Illumina HiSeq二代轉(zhuǎn)錄組測序儀（上海仁科生物科技有限公司）、實時熒光定量PCR儀CFX96TM System（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）。

1. 2 樣品處理

將幼苗從培養(yǎng)箱中移出，分為2組，分別用白光（對照組，CK）和UV-C（處理組）照射2 h。利用UV-C照度計測得處理組幼苗接收的UV-C照度為3.80 W/m2。輻照2 h后，UV-C的總照射劑量為27.36 kJ/m2。隨后剪取處理組和對照組幼苗的倒三葉，迅速置于液氮速凍，用于RNA提取。對照組和處理組設(shè)3次獨立的生物學(xué)重復(fù)，共計6份樣品，分別表示為CK1、CK2、CK3和UV1、UV2、UV3。938D37B0-0BF6-4583-A58F-FB85E89CBAAF

1. 3 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析

利用RNAiso Plus試劑提取樣品的總RNA，利用Nano Photometer Spectrophotometer、Qubit 2.0 Fluorometer和Agilent 2100 Bioanalyzer精細(xì)檢測RNA的純度和完整性。高質(zhì)量RNA經(jīng)過去除核糖體RNA（rRNA）、反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA、cDNA末端修復(fù)及cDNA加接頭處理，所得產(chǎn)物于Illumina HiSeq二代測序平臺進(jìn)行文庫構(gòu)建。利用fastp對序列進(jìn)行質(zhì)控，得到Clean reads，并計算Q30值和GC含量（%）。利用bowtie2將Clean reads比對到穿心蓮rRNA數(shù)據(jù)庫，去除比對上的序列，剩余序列用于后續(xù)分析。利用HISAT2將序列進(jìn)行穿心蓮基因組比對，并計算基因比對區(qū)域。從NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term=Andrographis+paniculata）下載穿心蓮基因組數(shù)據(jù)。利用Stringtie重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本后，篩選出在本次測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)但未被參考基因組收錄的基因，定義為新基因。

利用RSEM計算每個樣本中所有基因的表達(dá)量。利用DESeq分析組間差異表達(dá)基因（Differentially expressed genes，DEGs）?；诓町惙治鼋Y(jié)果，篩選FDR<0.05，|log₂FC|>1的基因為顯著差異表達(dá)基因。利用NCBI中的BLASTx將轉(zhuǎn)錄本序列對應(yīng)的多肽序列比對到蛋白數(shù)據(jù)庫GO（Gene ontology）和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）中。利用rMATS檢測外顯子跳躍型（Skipping exon，SE）、外顯子互斥型（Mutually exons exclusively，MXE）、5′端或3′端可變型（Alternative 5′donor or 3′ acceptor sites，A5/A3SS）及內(nèi)含子保留型（Intron retention，IR）AS轉(zhuǎn)錄本。利用STRING蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫中的互作關(guān)系選項進(jìn)行差異表達(dá)基因編碼蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)分析，互作指數(shù)（0～1000）越高，蛋白間存在互作的可能性越大。本研究挑選互作指數(shù)超過500的差異表達(dá)基因，利用Cytoscape 3制作蛋白互作圖。利用TBtools將基因的FPKM值進(jìn)行l(wèi)og2后繪制表達(dá)水平熱圖。

1. 4 qRT-PCR檢測

提取處理組和對照組的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板對穿心蓮內(nèi)酯合成相關(guān)基因進(jìn)行qRT-PCR檢測。 反應(yīng)體系：TB Green Fast qPCR Mix（2×）10.0 μL，10 μmol/L上、下游引物0.8 μL，150 ng/μL cDNA模板 2 μL ，ddH₂O補充至20.0 μL。擴增程序：95 ℃? 30 s;95 ℃? 5 s，60 ℃ 10 s，進(jìn)行40個循環(huán)。以Actin（GenBank登錄號JX444056）基因作為內(nèi)參（Wang et al.，2019）。試驗所用引物如表1所示。

1. 5 統(tǒng)計分析

處理組和對照組均設(shè)3次獨立的生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)設(shè)3次技術(shù)重復(fù)，根據(jù)2^?ΔΔCt算法確定基因的相對表達(dá)量，數(shù)據(jù)用獨立生物學(xué)實驗的平均值±樣本標(biāo)準(zhǔn)誤差（SE）表示。利用Excel 2019進(jìn)行計算及數(shù)據(jù)整理。

2 結(jié)果與分析

2. 1 UV-C處理下穿心蓮轉(zhuǎn)錄組的測序質(zhì)量

原始數(shù)據(jù)經(jīng)過濾后得到Clean reads，其中，從CK1、CK2和CK3分別得到36156632、47112300和37869802條Clean reads，從UV1、UV2和UV3分別得到39754768、53187418和46009804條Clean reads。堿基質(zhì)量分析結(jié)果（表2）顯示，6份樣品的Q30值均超過93.00%，質(zhì)量較高。Clean reads的堿基組成越平衡，代表測序質(zhì)量越好。6份測序樣品的平均GC含量為51.28%，堿基含量趨于平均，說明測序質(zhì)量好，可用于后續(xù)研究。

雖然總RNA樣品中的rRNA已被去除，但為避免殘留，利用短reads比對工具將Clean reads與穿心蓮rRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。未比對到rRNA數(shù)據(jù)庫中的Unmapped reads用于后續(xù)功能分析。本研究中，UV-C處理組樣品的平均Unmapped reads數(shù)量為46317330條，占平均Clean reads數(shù)量的96.81%;對照組的平均Unmapped reads數(shù)量為40379578，占平均Clean reads數(shù)量的99.54%。將去除rRNA的Clean reads與穿心蓮基因組進(jìn)行比對，結(jié)果如表2所示。6份樣品的平均基因組比對率高達(dá)95.29%。將比對到基因組上的序列進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)UV-C處理使穿心蓮RNA來源呈現(xiàn)出由基因區(qū)向基因間區(qū)發(fā)展的趨勢，編碼蛋白的RNA含量降低，非編碼蛋白的RNA含量平均增加22.64%（表3）。

2. 2 差異基因篩選及表達(dá)分析結(jié)果

穿心蓮基因組共包含25428個基因的注釋信息（Sun et al.，2018）。本研究映射到其中的21545個（84.73%）基因，其原因可能為基因組組裝存在部分偏差、基因組和轉(zhuǎn)錄組送測樣品的生長時期、組織不同等，使轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的部分信息無法比對到基因組中。本研究對轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行重構(gòu)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)678個新基因，其中有476個得到GO或KEGG數(shù)據(jù)庫的功能注釋。

對處理組和對照組數(shù)據(jù)進(jìn)行基因表達(dá)量分析，結(jié)果顯示，共5193個基因上調(diào)表達(dá)，16989個基因下調(diào)表達(dá)。經(jīng)UV-C處理后，將表達(dá)量FDR<0.05且|log2FC|>1的基因作為顯著差異表達(dá)基因，結(jié)果如圖1所示。UV-C照射處理后共產(chǎn)生2137個顯著差異表達(dá)基因，顯著上調(diào)表達(dá)的基因有1147個，顯著下調(diào)表達(dá)的基因有990個。938D37B0-0BF6-4583-A58F-FB85E89CBAAF

2. 3 差異表達(dá)基因的GO功能注釋分析結(jié)果

GO是國際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類體系。將差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋，結(jié)果顯示，分別有1039、1069和1242個差異表達(dá)基因歸屬于細(xì)胞組成、分子功能和生物進(jìn)程三大類。由表4可知，UV-C照射穿心蓮后，差異表達(dá)基因主要參與的生物進(jìn)程為響應(yīng)有機氮化合物、響應(yīng)內(nèi)源性刺激及信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)和傳遞;主要分子功能為氧化磷酸化途徑的NADH脫氫酶活性及電子載流活性;功能發(fā)揮的主要位置為生物膜。

UV-C照射會刺激植物線粒體和葉綠體釋放ROS，破壞生物膜的功能及線粒體膜上的電子傳遞鏈，導(dǎo)致氧化脅迫（Darras et al.，2020）。GO功能注釋結(jié)果表明，UV-C照射處理對穿心蓮造成了氧化脅迫。NADH脫氫酶作為線粒體電子傳遞鏈中的第一個復(fù)合體，是線粒體氧化磷酸化的“入口酶”。細(xì)胞色素c（Cytochrome c，Cyt c）氧化酶是電子傳遞鏈的末端酶，是將H+由基質(zhì)抽提到膜間隙的質(zhì)子泵（Gao et al.，2008）。本研究發(fā)現(xiàn)，線粒體氧化磷酸化途徑的19個NADH脫氫酶基因、4個Cyt c氧化酶基因和5個F型ATP酶基因經(jīng)UV-C處理后顯著上調(diào)表達(dá)（圖2）。此外，生物膜的主要成分為不飽和脂肪酸，可維持生物膜的流動性，保證細(xì)胞正常的生理功能。本研究中有3個不飽和脂肪酸合成關(guān)鍵基因的積累量受明顯抑制，分別為CXN00015046（超長鏈3-氧代?；o酶A還原酶1，log₂FC=-1.03）、CXN00009378（超長鏈3R-3-羥?；o酶A脫水酶PASTICCINO2，log2FC=-1.45）和CXN00013503（超長鏈烯酰輔酶A還原酶，log2FC=-1.69）。

2. 4 差異表達(dá)基因的KEGG代謝通路富集分析結(jié)果

KEGG是生物代謝通路分類的數(shù)據(jù)庫。本研究差異表達(dá)基因共富集到111個通路中，顯著富集的前20個代謝通路如圖3所示。經(jīng)UV-C處理后，響應(yīng)環(huán)境變化的基礎(chǔ)生命進(jìn)程，如絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）級聯(lián)途徑、氧化磷酸化、光合作用和生物膜流動性等途徑的差異基因得到富集。同時，穿心蓮主要藥效次生代謝物為二萜類化合物。由圖3（標(biāo)紅處）可知，UV-C處理使穿心蓮二萜類物質(zhì)前體骨架合成相關(guān)基因得到顯著富集。

MAPK是一組能被不同的胞外刺激激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，是信號從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者。本研究發(fā)現(xiàn)，MAPK通路誘導(dǎo)過氧化氫、乙烯和植物抗毒素的合成，從而增強病原體抗性、促進(jìn)氣孔發(fā)育及維持活性氧穩(wěn)態(tài)。此外，光合作用產(chǎn)生的有機物是植物營養(yǎng)物質(zhì)的重要來源。KEGG代謝通路注釋結(jié)果顯示，UV-C照射使PS復(fù)合物中的4個反應(yīng)中心基因和5個葉綠素脫輔基基因上調(diào)表達(dá);接收光信號的光敏色素B6/f復(fù)合物中，2個光敏色素基因被誘導(dǎo)表達(dá)，但3個葉綠素合成途徑基因下調(diào)表達(dá)。

2. 5 穿心蓮二萜前體合成途徑基因的表達(dá)模式及AS分析結(jié)果

二萜類物質(zhì)的前體（E，E，E）-香葉基香葉基二磷酸[（E，E，E）-geranyl geranyl diphosphate，GGPP]的合成途徑為位于細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸（Mevalonate，MVA）途徑和位于質(zhì)體中的2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP）途徑。由圖4可知，經(jīng)UV-C處理后，MVA途徑的4種合成酶基因HMGS（CXN00016849）、HMGR（CXN00 000058）、MVK（CXN00002900）和MVD（CXN0000 4398）表達(dá)呈顯著上調(diào)。同時，GGPP合成關(guān)鍵酶基因FPS（CXN00005067）表達(dá)也顯著上調(diào)。而MEP途徑中，僅1個DXS（CXN00013302）基因呈顯著差異表達(dá)，且顯著下調(diào)。

AS是真核生物體內(nèi)普遍存在的基因調(diào)控形式，主要分為SE、MXE、A5/A3SS和IR。本研究共檢測到8881個基因發(fā)生SE，705個基因發(fā)生MXE，1429個基因發(fā)生A5SS，1829個基因發(fā)生A3SS，1532個基因發(fā)生IR。由圖4可知，經(jīng)UV-C處理后，12種萜類骨架合成途徑酶基因發(fā)生了AS事件，其中，SE發(fā)生的頻率最高（75%），其次為A3SS（58%）。

2. 6 二萜前體合成通路相關(guān)基因編碼的蛋白互作預(yù)測結(jié)果

為進(jìn)一步明確UV-C照射對穿心蓮內(nèi)酯合成途徑基因的影響，利用蛋白互作數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)基因進(jìn)行互作網(wǎng)絡(luò)分析（互作指數(shù)>500），結(jié)果如圖5所示。UV-C處理后，MVA途徑中顯著差異表達(dá)基因編碼的蛋白HMGS、HMGR、MVK、MVD、DXS和FPS之間存在互作。此外，二萜類物質(zhì)的前體GGPP形成后，經(jīng)一系列特異性催化修飾形成具有獨特藥理活性的終產(chǎn)物。UDP依賴型糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-dependent glycosyltransferases，UGT）家族的UGT71、UGT73、UGT76、UGT85和UGT88成員參與二萜類物質(zhì)的修飾（Sun et al.，2018）。本研究UV-C處理后發(fā)現(xiàn)，HMGS和MVK均與UGT71D13互作，GGPP合成關(guān)鍵酶FPS1與UGT71、UGT73、UGT76成員互作。細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450，CYP450）基因家族的CYP71和CYP76成員參與唇形目植物二萜類物質(zhì)的合成（Banerjee and Hamberger，2018）。UV-C處理下，穿心蓮HMGS與7種CYP71家族成員互作，MVK和DXS分別與CYP71AU50和CYP710A11互作。參與二萜生物合成的轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factor，TF）家族有AP2/ERF、bHLH和WRKY（Sun et al.，2018）。UV-C處理使穿心蓮HMGR與WRKY53互作。938D37B0-0BF6-4583-A58F-FB85E89CBAAF

2. 7 二萜前體合成通路基因的表達(dá)模式分析結(jié)果

利用qRT-PCR檢測2.5中顯著上調(diào)或顯著下調(diào)的基因HMGR（CXN00000058）、MVK（CXN0000 2900）、MVD（CXN00004398）、FPS（CXN00005067）、DXS（CXN00013302）和HMGS（CXN00016849）的相對表達(dá)量，再與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果如圖6所示。6個基因相對表達(dá)量的qRT-PCR檢測結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致，表明UV-C處理后的轉(zhuǎn)錄測序數(shù)據(jù)可信度較高。

3 討論

本研究利用UV-C對穿心蓮幼苗進(jìn)行照射處理，并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，測序結(jié)果堿基含量高度平衡，數(shù)據(jù)質(zhì)量高。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，UV-C處理使穿心蓮轉(zhuǎn)錄組更龐大，產(chǎn)生更多rRNA，其原因可能是植株響應(yīng)環(huán)境光變化，導(dǎo)致蛋白翻譯加速。轉(zhuǎn)錄本成分分析結(jié)果顯示，非編碼RNA在UV-C處理組中的占比大幅增加（平均含量增加22.64%），是穿心蓮響應(yīng)UV-C的主要RNA成分。同時，本研究UV-C處理使穿心蓮二萜合成途徑差異表達(dá)基因產(chǎn)生豐富的AS亞型，其中SE事件最為普遍，說明其可通過單個基因的AS事件作出高度協(xié)調(diào)UV-C照射的分子響應(yīng)。穿心蓮經(jīng)UV-C處理后，共產(chǎn)生1147個顯著上調(diào)基因和990個顯著下調(diào)基因，差異表達(dá)基因的數(shù)量明顯高于番茄（Lycopersicon esculentum）（劉長虹等，2012）、煙草（Nicotiana tabacum）（易小艷，2015）等植物，為穿心蓮次生代謝途徑基因研究打下基礎(chǔ)。

穿心蓮內(nèi)酯前體GGPP合成途徑分為胞質(zhì)MVA途徑和質(zhì)體MEP途徑。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果和qRT-PCR結(jié)果顯示，UV-C處理下，MVA途徑基因HMGS、HMGR、MVK和MVD以及GGPP合成必需基因FPS的轉(zhuǎn)錄本積累被顯著誘導(dǎo)，但大多數(shù)MEP途徑基因未呈差異表達(dá)，僅DXS基因呈顯著下調(diào)表達(dá)模式。表明UV-C處理后，穿心蓮主要依靠MVA途徑而非MEP途徑進(jìn)行二萜前體的合成，其原因可能為葉綠體是光合作用的主要場所，感應(yīng)環(huán)境光的變化，當(dāng)高劑量UV-C照射葉片時，以葉綠體為主的質(zhì)體完整性受到一定程度破壞，MEP途徑合成GGPP的效率受到抑制（Darras et al.，2020）。此外，MVA和MEP途徑的差異表達(dá)基因編碼的蛋白之間存在復(fù)雜的互作網(wǎng)絡(luò)，主要為HMGS、HMGR、MVK、MVD、DXS和FPS之間的互作。Zheng等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，葡萄VvHMGS、VvHMGR、VvMVK、VvMVD和VvFPS/GGPPS蛋白之間存在互作，與本研究結(jié)果相符。同時，CYPs和UGTs家族成員在調(diào)節(jié)萜類生物合成過程中發(fā)揮重要作用，其代表性成員為CYP71、 UGT71和UGT73（Liu et al.，2016;Cheng et al.，2020）。本研究UV-C處理后的穿心蓮CYP71與HMGS之間以及UGT71、UGT73和UGT76與FPS1之間也存在緊密的互作關(guān)系。

此外，當(dāng)植株長期暴露于UV-C下，過量產(chǎn)生的 ROS會使線粒體跨膜電位丟失，導(dǎo)致Cyt c釋放，造成氧化脅迫并觸發(fā)細(xì)胞程序性凋亡（Programmed cell death，PCD）（Gao et al.，2008）。本研究穿心蓮細(xì)胞通過上調(diào)Cyt c氧化酶基因和NADH脫氫酶基因表達(dá)抑制UV-C引起的Cyt c釋放并促進(jìn)膜電位重建，減緩PCD;穿心蓮MAPK級聯(lián)通路基因經(jīng)UV-C處理后顯著上調(diào)表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞生長、分化和應(yīng)激等多種重要生理過程相關(guān)基因的表達(dá)水平。此外，UV-C會損害植物細(xì)胞PSII的光合效率和CO2 的吸收能力，加速葉綠素a/b的降解（Rusaczonek et al.，2015）。本研究發(fā)現(xiàn)，UV-C使穿心蓮葉綠素合成相關(guān)基因的表達(dá)水平降低后，細(xì)胞試圖恢復(fù)光合效率而提高了光捕獲PS復(fù)合體基因的表達(dá)水平。本研究結(jié)果為穿心蓮生長發(fā)育和次生代謝機制的研究提供新思路，后續(xù)將通過高效液相色譜分析、基因克隆、轉(zhuǎn)基因植株培育等手段深入研究穿心蓮內(nèi)酯合成關(guān)鍵基因的分子功能。

4 結(jié)論

UV-C照射調(diào)控穿心蓮重要生命進(jìn)程，其中，次生代謝、氧化磷酸化、光合作用等途徑基因轉(zhuǎn)錄本的相對表達(dá)量呈UV-C特異性響應(yīng)模式。合成穿心蓮內(nèi)酯前體GGPP的細(xì)胞質(zhì)MVA途徑基因顯著上調(diào)表達(dá)，推測UV-C誘導(dǎo)穿心蓮內(nèi)酯合成的主要場所為細(xì)胞質(zhì)。穿心蓮MVA途徑基因及CYP71、UGT71、UGT73和UGT76可作為穿心蓮內(nèi)酯合成途徑研究的候選分子靶標(biāo)。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）938D37B0-0BF6-4583-A58F-FB85E89CBAAF