β-葡聚糖聯(lián)合低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉在機體內(nèi)應(yīng)用的再生評價

方明星　吳偉東　王瑛等

中圖分類號：R622 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1004-4949（2022）02-0001-07

β-葡聚糖是一種天然的多糖類化合物，為水溶性或不溶性的顆粒，存在于細(xì)菌、真菌、植物等的細(xì)胞壁中[1，2]。研究發(fā)現(xiàn)[3-6]，β-葡聚糖具有多種生物學(xué)活性，如抗炎、降血糖血脂以及抗腫瘤等，且其代謝產(chǎn)物能夠調(diào)節(jié)膠原重組并刺激人Ⅰ型和Ⅲ型膠原再生等。β-葡聚糖注射進(jìn)入皮膚組織后會激活朗氏細(xì)胞，且能與人成纖維細(xì)胞上特異性葡聚糖受體結(jié)合，被激活的朗氏細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞能夠分泌一些因子，如血管內(nèi)皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子等的表達(dá)，這些因子能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖及皮膚基質(zhì)（例如膠原蛋白、蛋白聚糖、彈性蛋白等）的合成[7-9]，合成的成纖維細(xì)胞及膠原纖維等能夠?qū)ζ暇厶切纬砂?，形成Ⅰ型和Ⅲ型膠原，起到填充占位的效果。透明質(zhì)酸鈉是一種線性單鏈糖胺聚糖聚合物，由N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸組成，其分子結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，因此可在不冷藏的情況下儲存長達(dá)2年[10，11]。此外，由于其極強的親水性，可以為皮膚補充水份。研究表明[12]，HA相對寡糖降解產(chǎn)物能夠積極刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，并在延遲血運重建模型中誘導(dǎo)血管生成，且通過交聯(lián)的透明質(zhì)酸鈉具有較強的機械屬性，能夠在組織中維持更長的時間，進(jìn)而達(dá)到促進(jìn)組織再生的目的。透明質(zhì)酸鈉的粘彈性、生理活性和生物相容性使其成為藥理學(xué)應(yīng)用的理想材料，特別是在眼科和風(fēng)濕病學(xué)方面。此外，基于透明質(zhì)酸鈉分子化學(xué)修飾產(chǎn)生的生物相容性和可降解的生物材料被廣泛的應(yīng)用于傷口覆蓋、組織工程和醫(yī)療美容當(dāng)中。但外源性的透明質(zhì)酸在體內(nèi)容易被透明質(zhì)酸酶水解，且降解速度快，難以維持持久的效果[13]。因此，本研究主要探討β-葡聚糖聯(lián)合低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉在機體內(nèi)的安全性以及對新生血管及膠原生成的影響，現(xiàn)報道如下。

1.1實驗主要材料 注射材料主要包括β-葡聚糖（上海源葉，S24487）;注射用低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠（廣州小蠻腰醫(yī)療器械有限公司，國械注準(zhǔn)20153130014，規(guī)格：1.0ml/支×30g注射針2只）。β-葡聚糖和低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉配置方法：將3mlβ-葡聚糖溶液與1ml低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠在室溫下充分的混合至質(zhì)地均勻。

1.2實驗試劑的分組及配置 具體試劑組合及各組試劑成分見表1。

1.3實驗動物分組及處理方法 選用周齡在6周，體重（200±20）g的SPF級Wistar大鼠30只。將大鼠分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為室溫（25±2）℃，相對濕度（50±5）%，12h明暗交替，自由攝食、飲水。將Wistar大鼠按照實驗組合①～⑤分為低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組、交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉（大分子）組、β-葡聚糖組、β-葡聚糖+低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組、交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉（大分子）+低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組，每組6只。選取脊柱旁兩側(cè)1.5～2cm皮下組織為注射中心點，利用針頭刺入表皮至皮下組織層（深度約4mm），回抽無血液后進(jìn)行注射，每個部位注射材料劑量為1ml。以注射點為中心對周圍約1.5cm的范圍進(jìn)行標(biāo)注。各組大鼠注射材料后分別飼養(yǎng)7、14、28d，然后采用脊髓脫臼法處死各組的大鼠。剔除大鼠背部毛發(fā)，對馬克筆標(biāo)注的注射區(qū)域用手術(shù)刀切開皮膚全層，取下組織樣本，先用相機拍照，記錄整體形態(tài)。切取包括植入材料在內(nèi)的皮下組織，置于體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液中，固定48h后常規(guī)脫水、透明、浸潤、包埋、常規(guī)切片、切片厚度為3μm。本研究符合動物倫理要求，且經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.4觀察指標(biāo) 比較各組蘇木素-伊紅染色（HE）結(jié)果、膠原纖維含量面積百分比、HE染色切片中毛細(xì)血管及小血管數(shù)量。

1.4.1HE結(jié)果 在第7、14及28天處死大鼠，取植入材料在內(nèi)皮下組織制成病理切片，在光鏡下觀察各組大鼠皮下組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞浸潤情況、膠原纖維增生程度及新血管的生成情況等變化。

1.4.2膠原纖維含量面積百分比 參照相關(guān)文獻(xiàn)[14]，將制作好的病理切片用Canon450D數(shù)碼相機進(jìn)行拍照，將圖片導(dǎo)入計算機Photoshop軟件（版本：AdobePhotoshopCS4）測量出整張圖片的面積測量值，然后用魔術(shù)棒功能選中膠原纖維區(qū)域再次進(jìn)行測量記錄，分別測量切片中膠原纖維的面積測量值，計算膠原纖維含量百分比。膠原纖維含量百分比=膠原纖維面積測量值/整個圖片面積測量值×100%。

1.4.3HE染色切片中毛細(xì)血管及小血管數(shù)量 取注射部位皮下組織制作成HE染色切片，然后在顯微鏡下計數(shù)毛細(xì)血管密度，每個切片中取5個視野計數(shù)，然后取平均值作為毛細(xì)血管密度。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析。

計量資料以[n（%）]表示，組間比較分別采用H檢驗和SNK-q檢驗;計量資料以（x±s）表示，組間比較采用χ檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.1HE染色結(jié)果 低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組在第7天的HE染色切片中能夠看到少量的纖維組織增生并伴有炎細(xì)胞浸潤表現(xiàn);第14和28天的HE染色切片中能夠看到膠原纖維增生更加明顯并伴有巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤;第28天的HE染色切片中毛線血管及小血管數(shù)量明顯增多，見圖1。交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉（大分子）組在第7天的HE染色切片中能夠看到注射部位周圍有膠原纖維及纖維組織增生，增生的膠原纖維及纖維組織內(nèi)有較多的炎細(xì)胞浸潤;第14及28天的HE染色切片中可見膠原纖維及纖維組織增生明顯，增生的膠原纖維及纖維組織內(nèi)伴有新生毛線血管及較多炎細(xì)胞浸潤，炎性細(xì)胞包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，見圖2。β-葡聚糖組在第7天HE染色切片中可以看到注射部位有膠原纖維及纖維組織增生，增生的膠原纖維排列緊密期間伴有少量炎細(xì)胞浸潤，并且可以見到有少量新生毛細(xì);第14及28天的HE染色切片中仍可見到膠原纖維及纖維組織增生，但排列更加疏松并且伴有脂肪細(xì)胞浸潤，見圖3。β-葡聚糖+低交聯(lián)透明質(zhì)酸組在第7天的HE染色切片中見注射部位周圍膠原纖維及纖維組織增生伴炎細(xì)胞浸潤，例如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，增生的膠原纖維及纖維組織與周圍組織排列緊密;第14及28天的HE染色切片中可見膠原纖維及纖維組織增生更加顯著并且伴有毛細(xì)血管新生，增生的膠原纖維及纖維組織排列整齊，對注射部位的材料形成包裹，組織炎癥細(xì)胞浸潤較少，見圖4。交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉（大分子）+低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組在第7天的HE染色切片中見膠原纖維圍繞注射部位材料周圍及中間增生;第14天HE染色切片中可見膠原纖維及纖維組織增生較第7天明顯并且對注射部位形成包饒，增生的膠原纖維及纖維組織密度不均并伴有新生的毛細(xì)血管及微小血管，炎細(xì)胞浸潤明顯;第28天HE染色切片可見這種增生更加明顯并且密度不均勻、排列不整齊，見圖5。

圖1 低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組染色結(jié)果（HE×40）

圖2 交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組染色結(jié)果（HE×40）

圖3 β-葡聚糖組染色結(jié)果（HE×40）

圖4 β-葡聚糖+低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組染色結(jié)果（HE×40）

圖5 交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉+低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組染色結(jié)果（HE×40）

2.2各組大鼠膠原纖維含量面積比較 各組大鼠切片圖像膠原纖維含量面積比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中β-葡聚糖+低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組膠原纖維含量最高，其次是交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉+低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組，低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組、交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組和β-葡聚糖組膠原纖維含量低于前兩組，見表2。

2.3各組大鼠HE染色切片中毛細(xì)血管及小血管數(shù)量比較 交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組和β-葡聚糖+低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組的毛細(xì)血管及小血管數(shù)量高于低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組、β-葡聚糖組和交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉+低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組與β-葡聚糖+低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組的毛細(xì)血管及小血管數(shù)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組與β-葡聚糖組和交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉+低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組的毛細(xì)血管及小血管數(shù)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表3。

透明質(zhì)酸鈉又可稱為玻尿酸，因其含有大量的羥基和羧基，且能與水結(jié)合形成氫鍵，故具有很強的保水能力;能夠吸進(jìn)水分進(jìn)入細(xì)胞間隙并且與體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合形成蛋白凝膠，從而加快皮膚修復(fù)能力和傷口再生能力，目前已廣泛應(yīng)用于化妝品及組織工程中。但透明質(zhì)酸鈉易溶于水，且容易被透明質(zhì)酸酶水解，在化妝品及組織工程等實際應(yīng)用中難以維持持久的治療效果，因此減緩其在體內(nèi)的降解速度成為了研究重點。

近年來除了透明質(zhì)酸鈉外，具有修復(fù)功效的化妝品原料在也逐漸備受關(guān)注。繼蛋白質(zhì)、活性肽、氨基酸等修復(fù)成分之后，生物多糖成為了新的應(yīng)用熱點。葡聚糖就是一種典型的生物多糖，是以葡萄糖為單糖組成的的多糖且葡萄糖單元之間以糖苷鍵相連接，根據(jù)其糖苷鍵的類型可分為α-葡聚糖和β-葡聚糖。α-葡聚糖主要為機體供能而不具備生物活性功能，β-葡聚糖具有多種生物學(xué)功能，例如保濕、抗炎、抗過敏、降血糖、降血脂、增強免疫力等[15]。隨著臨床對葡聚糖不斷深入的研究[16]，發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖還能夠通過激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生表皮生長因子及膠原蛋白和血管生長因子，從而加速加速新血管測生成和皮膚再生能力。β-葡聚糖不僅能夠增加巨噬細(xì)胞吞噬作用和增殖活性[17-19]，而且能夠增加巨噬細(xì)胞在創(chuàng)傷區(qū)域的滲入、膠原沉積并且能夠增強傷口的抗?fàn)坷瓘姸萚20]。另有研究表明[21-24]，β-葡聚糖能夠刺激血管內(nèi)皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子等的表達(dá)。而血管內(nèi)皮生長因子在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、存活、增殖、分化及新血管生成中起關(guān)鍵作用[25-27]。盡管β-葡聚糖有諸多優(yōu)點，但β-葡聚糖在體內(nèi)通常難以降解并且降解時間較長，但有研究發(fā)現(xiàn)[28-30]，β-葡聚糖與透明質(zhì)酸鈉反應(yīng)后不僅能夠克服β-葡聚糖難以降解的缺點，還能夠克服透明質(zhì)酸鈉極易水解的缺點，聯(lián)合使用后能夠集兩者的生物活性為一體同時克服自身單獨使用的缺點。

本研究以不同分子量的透明質(zhì)酸鈉和β-葡聚糖為實驗試劑，通過不同的組合方式來評價β-葡聚糖和（或）透明質(zhì)酸鈉在體內(nèi)應(yīng)用的再生能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射β-葡聚糖+低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉的實驗方式相較于其他注射部位有更多的新生血管生成，鏡下膠原纖維密度更高，考慮與β-葡聚糖能夠增加巨噬細(xì)胞吞噬作用和增殖活性以及各種因子表達(dá)有關(guān)，從而促進(jìn)膠原纖維在局部的沉積及新血管的生成。交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組的膠原纖維增生及新生的毛細(xì)血管及小血管數(shù)量接近于β-葡聚糖+低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉組，考慮到與交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉分子結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，在體內(nèi)分解速度更慢，維持時間長有關(guān)，能夠在體內(nèi)維持長時間的再生效果。當(dāng)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉與低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉二者聯(lián)合應(yīng)用時，與β-葡聚糖+低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉在體內(nèi)的膠原纖維再生能力無明顯差異，交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉能夠在一定程度上彌補低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉在體內(nèi)被透明質(zhì)酸酶分解過快的缺點，這一特性與β-葡聚糖類似，因此兩種組合在體內(nèi)再生能力也無明顯差異。交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉+低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉與β-葡聚糖+低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉兩種組合在體內(nèi)再生效果雖然類似，但是在組織切片中交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉+低交聯(lián)透明質(zhì)酸注射材料周圍炎性細(xì)胞浸潤更為明顯，表明β-葡聚糖+低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉在體內(nèi)應(yīng)用時的組織相容性優(yōu)于交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉+低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉。低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉、β-葡聚糖二者單獨應(yīng)用在體內(nèi)再生效果類似，當(dāng)二者聯(lián)合應(yīng)用時體內(nèi)再生能力優(yōu)于二者單獨應(yīng)用。本實驗證明了β-葡聚糖聯(lián)合透明質(zhì)酸鈉皮下注射在體內(nèi)膠原纖維及毛細(xì)血管再生能力對比其他組合較強。在本實驗中注射β-葡聚糖+低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉的部位未見明顯的炎性包裹，提示β-葡聚糖與低交聯(lián)透明質(zhì)酸能夠二者互補并且克服自身單獨應(yīng)用的缺點。

綜上所述，β-葡聚糖聯(lián)合低交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉皮下注射具有良好的組織相容性，對新生血管生成及新生膠原具有明顯且較安全的作用。但目前關(guān)于β-葡聚糖聯(lián)合透明質(zhì)酸鈉的作用機制和理化性質(zhì)認(rèn)識較為有限，且二者聯(lián)合應(yīng)用的副作用研究甚少，如何制備出安全且而高效能的組合配方仍需進(jìn)一步研究。另外，本實驗并未對β-葡聚糖聯(lián)合透明質(zhì)酸鈉最佳配比進(jìn)行研究，且考慮到β-葡聚糖和交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉二者本身在體內(nèi)代謝時間長的問題，并未對著兩種試劑進(jìn)行組合。在后續(xù)的研究中，還需進(jìn)一步研究β-葡聚糖與透明質(zhì)酸鈉最優(yōu)配比及不同配比在體內(nèi)的再生評價。