野生甘草內(nèi)生真菌的分離及其次級代謝產(chǎn)物活性研究

賈志鵬，張新國*，郭廣君，魏亞茹，謝棟棟，范曉英，張 繼，黃麗娜，王鄧拓，朱建寧

（1 蘭州理工大學生命科學與工程學院 甘肅省中藏藥篩選評價及深加工重點實驗室 蘭州 730050 2 西北師范大學生命科學院 蘭州 730060 3 甘肅省食品藥品監(jiān)督管理局審評認證中心 蘭州 730070）

植物內(nèi)生菌，是指定殖于健康植物組織，在植物不同生長階段與植物和諧共生的一類微生物[1]。研究顯示，植物內(nèi)生菌不僅對植物生長發(fā)育起到積極的調(diào)節(jié)作用，有些植物內(nèi)生菌還能產(chǎn)生與宿主相同或相似活性的物質(zhì)[2-3]。近年來，研究人員從不同植物內(nèi)生菌次級代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了很多具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤等生物活性的物質(zhì)，植物內(nèi)生菌作為一個亟待開發(fā)的重要資源，正在被越來越多的研究人員所關注[4]。

甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）為豆科甘草屬多年生草本植物，具有“補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和諸藥之功效”。作為最常用的大宗藥材，甘草素有“十方九草”和“藥之國老”的美譽[5]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，甘草的有效成分以黃酮類和三萜皂苷成分為主[6-8]，還包括香豆素類、生物堿類、多糖等化合物[9-11]，具有抗?jié)儭⒖鼓[瘤、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和治療心血管疾病等功效[10]。

從植物中分離篩選出具有生理活性的內(nèi)生菌并獲得其次生代謝產(chǎn)物，是藥用植物資源替代的重要嘗試，對于在一定程度上解決我國甘草野生資源的匱乏具有著重要的意義。研究顯示[12-13]，不同培養(yǎng)基對內(nèi)生真菌的分離的種類會產(chǎn)生一定的影響，不同培養(yǎng)基分離所得內(nèi)生真菌的多樣性也明顯不同。甘草主要分布于我國東北、西北及華北等地區(qū)，其中又以寧夏、甘肅、內(nèi)蒙和新疆等地所產(chǎn)的道地藥材品質(zhì)最佳，是我國在種植和應用上最為廣泛的植物資源[14]。本研究采用9 種分離培養(yǎng)基對甘肅本地野生甘草不同組織中內(nèi)生真菌進行分離，并采用不同的方法評價其代謝產(chǎn)物的抗氧化和抑菌活性，以期增加甘草內(nèi)生菌的豐度并篩選出活性良好的菌株，為甘草深層次應用提供技術資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘草為采集自甘肅省慶城縣野生全株，經(jīng)蘭州理工大學生命科學與工程學院楊林副教授鑒定確系為該種藥材。

標準供試菌使用兩種革蘭氏陰性菌綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、大腸桿菌（Escherichia coli） 和3 種革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），以上菌株均由蘭州理工大學生命科學與工程學院實驗中心提供。

二苯代苦味?；杂苫鵇PPH（96%）、抗壞血酸（VC，99%），購自阿拉丁生化科技股份有限公司；水楊酸，鐵氰化鉀，硫酸亞鐵，三氯乙酸等，購自天津福晨化學試劑有限公司，且均為分析純級。

1.2 儀器與設備

UV2102PC 型紫外-可見分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司）；SPX-100B-Z 生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 甘草內(nèi)生真菌的分離純化 取新鮮甘草根、莖、葉清水沖凈泥土，再依次用無菌水清洗、75%酒精消毒、2%次氯酸鈉溶液消毒，最后用無菌水沖洗3 次并保存最后一次沖洗液作為空白對照[15]。采用Gary 等[16]報道的組織塊法將表面消毒過的植物組織剪成10 mm 長的小段，分別接種在表1所示I～IX 共9 種固體培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)5～10 d，然后挑取初步分離得到的菌株轉(zhuǎn)接至新的培養(yǎng)基上劃線分離，連續(xù)轉(zhuǎn)接4～5 次，直至得到單菌落然后對菌種進行編號和保藏。

表1 試驗用培養(yǎng)基及成分Table 1 Experimental medium and ingredients

1.3.2 甘草內(nèi)生真菌分子生物學鑒定 將已分離純化的甘草內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)接至相應固體培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)觀察記錄菌株生長狀況、菌落整體形態(tài)、質(zhì)地，菌絲顏色、長短及基質(zhì)顏色等，將部分形態(tài)特異的菌株送至西安一棵樹生物科技公司進行18S rDNA 基因測序，將測序結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行序列比對，獲取菌種注冊號，并用MEGA 7.0 軟件繪制系統(tǒng)進化樹。

1.3.3 甘草內(nèi)生真菌的發(fā)酵及次級代謝產(chǎn)物的制備 菌株在相應液體培養(yǎng)基28 ℃發(fā)酵培養(yǎng)7 d。過濾分離發(fā)酵液和菌絲體，取濾液用等體積乙酸乙酯萃取3 次，合并有機相，55 ℃減壓濃縮蒸干得發(fā)酵液供試樣品；菌絲體用甲醇冷凝回流3 次，合并有機相減壓濃縮蒸干得菌絲體供試樣品。所得樣品均置于冰箱4 ℃保藏備用。

1.3.4 甘草內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物抗氧化活性的評價

1.3.4.1 清除DPPH 自由基活性的測定 清除DPPH 自由基活性的測定參照Du 等[17]報道中的方法。配制并移取待測樣品溶液（50 μL 0.1 mg/mL），加入DPPH-乙醇溶液（50 μL 0.05 mg/mL），渦旋震蕩室溫避光30 min，用無水乙醇調(diào)零于517 nm處測定吸光度值Ai；用無水乙醇替換DPPH 溶液測得Aj；以無水乙醇代替待測樣品溶液測得A0；以抗壞血酸（VC）作為陽性對照，依據(jù)公式計算得DPPH 清除率。

1.3.4.2 清除羥自由基活性的測定 清除羥自由基活性的測定參照Smirnoff 等[18]報道的方法。配制并移取待測樣品溶液（50 μL 0.1 mg/mL），依次加入50 μL FeSO4（6.0 mmol/L）溶液、水楊酸-乙醇（6.0 mmol/L） 溶液、0.1% H2O2溶液，37 ℃水浴反應30 min，用20%乙醇調(diào)零于波長510 nm 處測定吸光度值A1；以無水乙醇代替待測樣品溶液測得A0，用蒸餾水替換0.1% H2O2溶液測得A2；并以抗壞血酸（VC）作為陽性對照，依據(jù)公式計算得羥自由基清除率。

1.3.4.3 總還原力的測定 還原力的測定參照Wei 等[19]的方法。配制并移取磷酸鹽緩沖液（500 μL 0.2 mol/L，pH=6.6），依次加入待測樣品溶液（500 μL 0.1 mg/mL）和500 μL 1% K3[Fe（CN）6]，50 ℃水浴后快速冷卻至室溫，加入500 μL 10%三氯乙酸溶液，混勻后5 000 r/min 離心，取上清液100 μL 依次加入80 μL 蒸餾水及20 μL 0.1%的三氯化鐵溶液，充分反應15 min，于波長700 nm處測定其吸光度值，吸光度值越大表明其還原力越強，以500 μL 蒸餾水代替1% K3[Fe（CN）6]溶液作空白，用VC 的總還原力做標準曲線，每組樣品平行3 次，求其均值。

1.3.5 甘草內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的抑菌活性評價 取經(jīng)活化的5 種受試菌株菌液按1%的接種量接種于100 mL 牛肉膏-蛋白胨液體培養(yǎng)基并將菌液濃度稀釋至0.5 麥氏濃度，作為受試菌懸液[20-21]。制備1.3.1 節(jié)所述牛肉膏-蛋白胨固體培養(yǎng)基（厚度2～3 mm）移取受試菌懸液200 μL，均勻涂布制成含菌平板。取待測樣品溶液 （10 μL 10 mg/mL）滴于直徑5 mm 已滅菌濾紙片并移至含菌平板上，以青霉素鉀和硫酸鏈霉素（0.1 mg/mL）作陽性對照，每個待測樣品溶液作兩個平行。37 ℃恒溫培養(yǎng)觀察并測量抑菌圈直徑大小，以抑菌圈直徑作為評價樣品抑菌效果的指標[2，22]。

2 結(jié)果

2.1 甘草內(nèi)生真菌菌株分布

研究采用9 種培養(yǎng)基從甘草根、莖、葉中共分離出內(nèi)生真菌128 株，其中根部95 株、莖部9 株、葉部24 株，分別為分離菌株總數(shù)的74.22%、7.03%、18.75%（見表2）。9 種培養(yǎng)基對甘草中內(nèi)生真菌分離的出菌率如圖1所示，以山藥培養(yǎng)基和100 倍稀釋的山藥培養(yǎng)基的出菌率最高，分別為19.53%、13.28%。

圖1 甘草內(nèi)生真菌在不同培養(yǎng)基分離下的出菌率圖Fig.1 Isolation rate of endophytic fungi from licoricein different media

表2 甘草內(nèi)生真菌菌株分布Table 2 Distribution of isolates of endophytic fungi from licorice

（續(xù)表2）

2.2 甘草內(nèi)生真菌的分子生物學鑒定

從所分離出的菌中按照不同分離培養(yǎng)基各選取了部分形態(tài)特殊的菌株共計18 株，進行了18S rDNA 測序，提交NCBI 進行GeneBank 注冊（見表3）。將上述菌株的測定序列在Genbank 數(shù)據(jù)庫進行序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果如圖2所示。真菌經(jīng)分子生物學鑒定歸屬于4 目5 科5 屬，包括曲霉屬、鐮刀菌屬、畢赤酵母屬、叢赤殼屬、枝孢屬，歸屬于4 個不同的目。其中分離出較多的菌屬為鐮刀菌屬和畢赤酵母屬。

圖2 甘草內(nèi)生真菌的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of endophytic fungi in licorice

表3 甘草內(nèi)生真菌分子生物學鑒定Table 3 Molecular biological identification of endophytic fungi in licorice

2.3 甘草內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物抗氧化活性的評價

2.3.1 次級代謝產(chǎn)物樣品對DPPH 自由基的清除作用 從根、莖、葉3 個部位所分離的菌株中各選取了部分形態(tài)特殊的甘草內(nèi)生真菌共18 株，制得36 個供試樣品并測定了其對DPPH 自由基清除率，如表4所示。

表4 不同甘草內(nèi)生真菌樣品的DPPH 自由基清除率Table 4 DPPH free radical scavenging rate of different licorice endophytic fungi samples

試驗結(jié)果顯示陽性對照VC 的DPPH 自由基清除率為95.20%。對DPPH 自由基清除率超過60%的樣品有25 個，占總樣品的69.44%；清除率超過80%的樣品有10 個，其中GS-6a、GS-7 菌液粗提物對DPPH 自由基的清除率分別達到了97.54%和96.87%與陽性對照效果相當，具有較強體外抗氧化能力。

2.3.2 次級代謝產(chǎn)物樣品對羥自由基的清除作用 試驗對所得36 個次級代謝產(chǎn)物樣品又進行了羥自由基清除率的測定，測定結(jié)果如下表5所示。

表5 不同甘草內(nèi)生真菌樣品的羥自由基清除率Table 5 Hydroxyl radical scavenging rate of different licorice endophytic fungi samples

試驗結(jié)果顯示陽性對照VC 的羥自由基清除率為95.30%。對羥自由基清除率超過60%的樣品有20 個，占總樣品的55.56%；清除率超過80%的供試樣品有16 個，其中GS-6a、YS-4 菌株菌絲體供試樣品具有強體外抗氧化能力，對羥自由基的清除率分別達到了98.83%和98.32%，與陽性對照效果相當，具有較強體外抗氧化能力。

2.3.3 次級代謝產(chǎn)物樣品的總還原力 將陽性對照VC 配成不同質(zhì)量濃度的標準溶液，以VC 標準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，以波長700 nm 處測定的不同質(zhì)量濃度標準溶液吸光度值為縱坐標作VC標準曲線，如圖3所示。VC 標準溶液在0.02～0.10 mg/mL 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其吸光度值與質(zhì)量濃度線性關系良好。將各供試樣品溶液吸光度值代入線性回歸方程 Y=7.445X+0.0587（R2=0.994），算出各樣品的VC 當量如表6所示。

圖3 VC 標準曲線Fig.3 VC standard curve

表6 不同甘草內(nèi)生真菌樣品總還原力測定Table 6 Determination of total reducing power of different licorice endophytic fungi samples

試驗結(jié)果顯示，總還原力超過0.060 mg VC當量還原力的待測樣品共有11 個，占到了樣品總數(shù)的30.6%；YS-2、YB-4 菌株發(fā)酵液樣品的總還原力分別達到0.115 mg VC 當量和0.101 mg VC當量，與0.100 mg VC 當量的還原力相當，具有較強體外抗氧化能力。

2.3.4 甘草內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物樣品抑菌活性的評價 試驗采用紙片擴散法[23-24]對36 份甘草內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物樣品進行抑菌活性測定，標準供試菌使用2 種革蘭氏陰性菌綠膿桿菌、大腸桿菌和3 種革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、地衣芽孢桿菌，結(jié)果如表7所示。

表7 抑菌活性測定結(jié)果Table 7 Test results of antibacterial activity

（續(xù)表7）

大腸桿菌、綠膿桿菌陽性藥-鏈霉素；地衣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌陽性藥-青霉素；對供試樣品進行了抑菌活性的測定，部分結(jié)果如圖4所示。圖4分別為各細菌的典型抑菌結(jié)果。

圖4 各供試細菌的典型抑菌結(jié)果Fig.4 Typical antibacterial results of each tested bacteria

結(jié)果表明，菌株YS-6 發(fā)酵液對大腸桿菌的抑菌活性達到鏈霉素的70%，對地衣芽孢桿菌的抑菌活性達到青霉素的67%，對金黃色葡萄球菌的抑菌活性達到青霉素的79%，具有良好的抑菌活性；而GS-12 發(fā)酵液對以上3 種供試細菌也有著僅次于YS-6 的抑菌活性；所有待測樣品對綠膿芽孢桿菌及肺炎雙球菌的抑制作用不明顯，表現(xiàn)出較弱的抑菌活性。由此可知，YS-6 發(fā)酵液供試樣品和GS-6a 菌絲體供試樣品在抑菌活性方面有較好的研究潛力。

3 討論

植物內(nèi)生真菌作為與植物共存一類微生物，通常與宿主植物具有相同或相似的次生代謝產(chǎn)物合成途徑，其分布廣泛種類多樣，是一種亟待開發(fā)的重要微生物資源[2]。本研究通過不同培養(yǎng)基實現(xiàn)甘草根、莖、葉進行內(nèi)生真菌的分離，結(jié)果證實甘草內(nèi)生真菌在不同組織中都有分布且在不同組織中的分布不同，其中甘草根部組織微生物數(shù)量眾多且種屬各異，提示植物根部內(nèi)生真菌的多樣性最為豐富。

本研究通過9 種不同培養(yǎng)基進行內(nèi)生真菌分離。為了盡可能模擬內(nèi)生菌生長的自然環(huán)境，分離中除了采用經(jīng)典微生物培養(yǎng)通常采用的常規(guī)培養(yǎng)基外，還設計了經(jīng)50 倍和100 倍稀釋的寡營養(yǎng)培養(yǎng)基[25]進行內(nèi)生真菌的分離（見表1）。結(jié)果顯示，常規(guī)培養(yǎng)基從甘草中能分離到內(nèi)生真菌63 株，而寡營養(yǎng)培養(yǎng)基可分離出內(nèi)生真菌65 株。以根部內(nèi)生真菌最常采用的PDA 培養(yǎng)基分離為例，常規(guī)PDA 分離到9 株真菌，經(jīng)50 倍和100 倍稀釋的PDA 分別分離到6 株真菌和13 株真菌，該結(jié)果也提示經(jīng)過稀釋的培養(yǎng)基可以分離到常規(guī)方法難以獲得的菌株，詮釋了寡營養(yǎng)培養(yǎng)基也是一種良好的內(nèi)生真菌分離手段。

為了盡力可能多地分離甘草內(nèi)生真菌，本研究采用了馬鈴薯、山藥、胡蘿卜和百合作為培養(yǎng)基的成分進行培養(yǎng)基的改良，結(jié)果顯示山藥培養(yǎng)基共分離得到42 株內(nèi)生真菌與常規(guī)真菌培養(yǎng)基PDA 分離到的內(nèi)生真菌數(shù)量相當，均占總分離菌株數(shù)的32.81%，而通過百合培養(yǎng)基和胡蘿卜培養(yǎng)基分離到的菌株數(shù)量只有以上兩種的一半，分別占總菌株數(shù)的15.63%和18.75%，該結(jié)果也進一步說明了山藥培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分豐富，是一種可用于植物內(nèi)生真菌分離的優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)基。PDA 是植物內(nèi)生真菌分離最常用的一種培養(yǎng)基，也有研究采用該培養(yǎng)基進行了甘草內(nèi)生真菌的分離[26-28]，與這些結(jié)果相比較，本研究不僅從甘草組織中分離得到了鐮刀菌屬、青霉屬、曲霉屬、鏈格孢屬等已被報道過的甘草內(nèi)生真菌，而且通過山藥培養(yǎng)基和胡蘿卜培養(yǎng)基也分離得到了如畢赤酵母屬、枝孢屬等鮮見報道的內(nèi)生真菌，這顯示出甘草內(nèi)生真菌的數(shù)量眾多且種屬構(gòu)成復雜，常規(guī)PDA 培養(yǎng)基能分離出的內(nèi)生真菌只占植物中內(nèi)生真菌總數(shù)的很少一部分，天然培養(yǎng)基和寡營養(yǎng)培養(yǎng)基的交叉使用對分離培養(yǎng)基種類的增加和菌株分離具有非常重要的意義。

本研究通過紙片擴散法[29]和3 種抗氧化活性測定方法評價了部分甘草內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的抗氧化和抑菌活性，從中篩選出了高活性菌株；GS-6a 菌株經(jīng)分子生物學鑒定與季也蒙畢赤酵母有100%的同源性，初步鑒定為畢赤酵母屬（Pichia.sp.），抗氧化活性測定結(jié)果顯示其發(fā)酵液樣品對DPPH 自由基清除率為97.54%，菌絲體樣品對羥自由基清除率為98.83%，說明了季也蒙畢赤酵母次生代謝產(chǎn)物具有顯著的抗氧化活性潛力[26-27]。此外，研究顯示，季也蒙畢赤酵母也被用于聚乙烯等高分子材料的降解[28]，在生物轉(zhuǎn)化[30]和新型生物防菌劑[31]的制備方面也有較好的應用，具有著較高開發(fā)價值。具有較高抑菌活性的YS-6 菌株經(jīng)分子生物學初步鑒定為枝孢霉菌屬（Cladosporium sp.），其主要抗菌成分以異香豆素衍生物為主，顯示了極大的開發(fā)潛力[32-33]。甘草作為一種應用廣泛的中藥，本研究通過其內(nèi)生真菌較為系統(tǒng)的研究證實，甘草內(nèi)生菌資源豐富，是活性化合物發(fā)現(xiàn)的良好資源，研究將為甘草的保護和深層次應用提供重要的技術資料。