乳酸菌發(fā)酵接骨木果汁品質(zhì)及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化

章佳玫，吳祖芳，翁佩芳

（寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院 浙江寧波 315800）

接骨木（Sambucus nigra L.）屬忍冬科植物，廣泛分布于歐洲、西亞、北非和美國，接骨木果含有豐富分營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)、多酚類、黃酮類和花青素等，常用于膳食補(bǔ)充劑[1-2]。Denev 等[3]利用固相萃取法提取了多種漿果的花青素，試驗(yàn)結(jié)果顯示接骨木果的花青素提取物具有較高的氧自由基吸收能力，可達(dá)到5 783 μmol Trolox/g。Goud 等[4]研究表明接骨木果甲醇提取物對DPPH 自由基的清除能力可達(dá)62.56%，對大腸桿菌和惡臭假單胞菌具有較強(qiáng)的抑制能力。接骨木果可以開發(fā)成多種產(chǎn)品，目前市場上有果汁、果醬、果酒、啤酒等商品。接骨木果汁因豐富的花色苷含量而作為良好的食品天然著色劑[5]。Cordeiro 等[6]用5 種不同醋作為木炭烤豬里脊的調(diào)味料，研究其對豬里脊烤制過程中多環(huán)芳烴（PAH）產(chǎn)生的抑制作用，發(fā)現(xiàn)接骨木果醋對PAH 的抑制率最高，達(dá)到了82%。

植物天然化合物通過乳酸菌代謝進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，其性能會發(fā)生較大的改變[7]，鄭莎莎等[8]利用干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌發(fā)酵紅酸湯，改善了紅酸湯的風(fēng)味品質(zhì)，并提高了營養(yǎng)價(jià)值。葉盼等[9]選取植物乳桿菌發(fā)酵蘋果汁，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘋果汁發(fā)酵后其抗氧化能力得到提高，總酚含量有所增加，蘋果汁經(jīng)發(fā)酵后的總酚含量與DPPH 清除能力呈顯著正相關(guān)性。

目前國內(nèi)外利用乳酸菌發(fā)酵接骨木果汁的研究報(bào)道較少。Ricci 等[10]研究了接骨木果汁多酚體外代謝，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌在發(fā)酵接骨木果汁過程中消耗咖啡酸和原兒茶酸，同時(shí)產(chǎn)生二氫咖啡酸和兒茶酚，新生成的二氫咖啡酸比咖啡酸具更強(qiáng)的抗氧化能力[11]。Ricci 等[12]利用植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和干酪乳桿菌發(fā)酵接骨木果汁并測定其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，結(jié)果表明植物乳桿菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)芳香物質(zhì)的能力。

本文選用前期篩選獲得的植物乳桿菌L1 和發(fā)酵乳桿菌L2 對接骨木果汁進(jìn)行發(fā)酵，測定發(fā)酵過程中的理化指標(biāo)及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，以期為接骨木果乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

植物乳桿菌L1（Lactobacillus plantarum L1）、發(fā)酵乳桿菌L2 （Lactobacillus fermentum L2），由寧波大學(xué)食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保藏；接骨木果粉，由寧波市北侖玉健醫(yī)藥科技有限公司提供。

1.2 主要儀器與設(shè)備

PHS－3C 型pH 計(jì)，上海圣科儀器設(shè)備有限公司；TE214S 分析天平，成都浩馳儀器有限公司；LDZX－40B Ⅰ型立式蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ－2D 型超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；XPX 智能生化培養(yǎng)箱，江南儀器廠；5804R 高速大容量冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf 公司；CR-400 色差儀，日本Konica Minolta 公司；7890B-7000C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫科技有限公司；全自動固相微萃取進(jìn)樣系統(tǒng)，德國Gerstel 公司；50·30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取頭，美國Supelco 公司；VOCOL 毛細(xì)管柱（60 m×0.32 mm×1.8 mm），德國CNW 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 種子液制備 將植物乳桿菌L1 和發(fā)酵乳桿菌L2 分別從試管斜面接種至50 mL MRS 肉湯中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h，備用。

1.3.2 乳酸菌發(fā)酵接骨木果汁的制備 在接骨木果粉中以料液比1∶50 加入蒸餾水，加入8 g/100 mL 的蔗糖，調(diào)節(jié)pH 值至5.5，經(jīng)巴氏殺菌后，得到發(fā)酵基質(zhì)，冷卻后接入植物乳桿菌L1 和發(fā)酵乳桿菌L2（1∶1，接種量3%），于37 ℃條件下發(fā)酵36 h。

1.3.3 理化指標(biāo)測定 采用數(shù)字式pH 計(jì)測定樣品pH 值；采用pH 電位法（以乳酸計(jì)）測定總酸含量[13]；采用CR－400 色差儀測定樣品的色差值；采用pH 示差法測定樣品花色苷含量[14]；采用福林酚法測定樣品總酚含量[15]；采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法測定樣品總黃酮含量[16]；通過測定超氧陰離子清除率[17]、總還原力表征樣品抗氧化能力[18]。

1.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定

1.4.1 GC-MS 分析-頂空進(jìn)樣 固相微萃取條件：樣品在60 ℃下震蕩平衡15 min，再將預(yù)先老化20 min 的SPME 萃取頭深入到樣品頂空處吸附20 min，此過程中溫度仍為60 ℃并持續(xù)震蕩。吸附完成后，將萃取頭插入到GC 進(jìn)樣口，在210 ℃溫度下解吸7 min。GC 色譜條件：進(jìn)樣采用不分流模式，柱溫箱起始溫度35 ℃保持3 min，以3 ℃/min，升溫至40 ℃保持1 min，再以5 ℃/min 升溫至200℃保持12 min。載氣為高純氦氣，流速為1.6 mL/min；進(jìn)樣口溫度210 ℃。MS 條件為EI 離子源；電子能量70 eV；燈絲發(fā)射電流為200 μA，離子源溫度為230 ℃；掃描質(zhì)量范圍50～500 m/z。

1.4.2 定量定性分析 化合物經(jīng)NIST 14 譜圖庫檢索，選擇相似度大于80%的結(jié)果與質(zhì)譜圖庫中的標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行對照、復(fù)合，進(jìn)行人工譜圖解析確認(rèn)其中的揮發(fā)性成分，相對百分含量按峰面積歸一化法進(jìn)行計(jì)算[19]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)平行數(shù)為3 次，取平均值。所有數(shù)據(jù)采用Origin 9.1 軟件作圖，用SPSS 25 軟件進(jìn)行相關(guān)性分析和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 接骨木果汁發(fā)酵過程中理化指標(biāo)分析

2.1.1 發(fā)酵過程中pH 值和總酸含量變化 pH 值的變化可反映發(fā)酵是否正常進(jìn)行，總酸含量是發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)。接骨木果汁發(fā)酵過程中pH 值和總酸含量變化如圖1所示。

由圖1可見，接骨木果汁發(fā)酵期間pH 值隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而不斷減小，發(fā)酵前期下降迅速，之后趨于平穩(wěn)；總酸含量則不斷上升。在發(fā)酵前期（0～6 h），pH 值迅速降低至4.01，總酸由0.32 mg/mL 升至0.97 mg/mL，由此可以推斷，發(fā)酵前6 h 是乳酸菌的生長對數(shù)期，生長迅速，產(chǎn)酸能力強(qiáng)。發(fā)酵第7～36 小時(shí)，pH 值下降緩慢，總酸持續(xù)上升，此時(shí)乳酸菌正經(jīng)歷對數(shù)期到穩(wěn)定期再到衰亡期的過度，產(chǎn)酸速度趨于平穩(wěn)并開始下降。

2.1.2 發(fā)酵過程中色差值的變化 色值中，L*值表示樣品的亮度，a*值表示樣品的紅綠色，b*值反映樣品的黃藍(lán)度。由圖2可見，發(fā)酵0～12 h，樣品的L*值有所提高，之后呈下降趨勢，與a*值大致趨勢相同，這可能是因?yàn)榛ㄉ赵诓煌釅A環(huán)境中會呈現(xiàn)不同的顏色，調(diào)節(jié)了初始pH 值后，果汁顏色偏深紫，后因?yàn)榘l(fā)酵期間乳酸菌產(chǎn)酸，果汁pH 值下降，開始呈現(xiàn)原來的顏色。發(fā)酵前期L*值和a*值的變化與花色苷含量之間呈負(fù)相關(guān)，這一結(jié)果與Kwaw 等[20]的研究結(jié)果類似。b*值較為穩(wěn)定，且數(shù)值保持在-0.3 附近，說明樣品偏藍(lán)。ΔE*值代表樣品的色差綜合偏差值，接骨木果汁發(fā)酵過程中ΔE*值變化不大，說明樣品色澤變化并不明顯。

圖2 發(fā)酵過程中色差值的變化Fig.2 Variation of chromatic aberration during fermentation

2.1.3 發(fā)酵過程中花色苷含量的變化 接骨木果汁發(fā)酵過程中花色苷含量的變化結(jié)果如圖3所示，發(fā)酵前6 h，花色苷含量迅速從153.41 mg/L 降至130.62 mg/mL，發(fā)酵前期花色苷含量下降迅速，這是因?yàn)榛ㄉ辗肿颖沪?葡萄糖苷酶水解為糖基和花色素[21]。由于花色苷在酸性條件下較穩(wěn)定，隨著發(fā)酵后期pH 值降低，花色苷含量下降的速度也有所降低。

圖3 發(fā)酵過程中花色苷含量的變化Fig.3 Changes of anthocyanin content during fermentation

2.1.4 接骨木果汁發(fā)酵過程中總酚總黃酮含量變化 由圖4可見，總酚含量在發(fā)酵過程的前12 h迅速從4.93 mg/mL 升至7.52 mg/mL，之后緩慢上升，至24 h 開始下降，發(fā)酵結(jié)束時(shí)含量為7.82 mg/mL；總黃酮含量在發(fā)酵過程的前6 h，由0.46 mg/mL 升至0.74 mg/mL，隨后呈緩慢上升趨勢，發(fā)酵結(jié)束時(shí)最終含量為1.03 mg/mL。經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵，接骨木果汁的總酚和總黃酮含量較發(fā)酵前分別提高了58.62%和123.91%，這與張宏志等[22]的研究結(jié)果相似。

圖4 發(fā)酵過程中總酚和總黃酮含量的變化Fig.4 Changes of total phenols and flavonoids during fermentation

2.1.5 接骨木果汁發(fā)酵過程中抗氧化能力變化由圖5可見，發(fā)酵過程中，接骨木果汁的超氧陰離子清除率和總還原力都呈現(xiàn)上升趨勢。發(fā)酵結(jié)束后，超氧陰離子清除率達(dá)到47.74%，較發(fā)酵前提高了82.07%，總還原能力為0.9 mg VC/mL，較發(fā)酵前提高了55.17%，表明接骨木果汁經(jīng)過發(fā)酵，具有良好的抗氧化能力。賴婷等[23]將乳酸菌接種于桂圓肉中，發(fā)現(xiàn)游離態(tài)的酚類和黃酮類物質(zhì)含量增加，鐵離子還原能力和氧自由基吸收能力兩種抗氧化性能有所提高。

圖5 發(fā)酵過程中抗氧化能力的變化Fig.5 Changes of antioxidant capacity during fermentation

2.1.6 發(fā)酵接骨木果汁中活性物質(zhì)抗氧化能力相關(guān)性分析 發(fā)酵接骨木果汁總酚、總黃酮與超氧陰離子清除率、總還原力的相關(guān)性分析見表1。

表1 發(fā)酵接骨木果汁中活性物質(zhì)與抗氧化能力的相關(guān)性Table 1 Correlation between active substances and antioxidant capacity of fermented elderberry juice

結(jié)果表明，總酚、總黃酮與超氧陰離子清除率、總還原力具有顯著相關(guān)性，這說明總酚、總黃酮均有助于接骨木果汁的抗氧化能力。

2.2 接骨木果汁揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量分析

不同的接骨木果汁樣品 （發(fā)酵0 h、發(fā)酵36 h、未接菌對照組）各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對含量結(jié)果如圖6所示，3 種接骨木果汁樣品共鑒定出99種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中醛類14 種、烯烴類13種、醇類17 種、酮類10 種、烷烴類5 種、酯類16種、其它類24 種，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分別為47、39種和39 種。從不同樣品組之間的聚類分析結(jié)果可以看出，發(fā)酵前、后和未接菌對照組的接骨木果汁差異性較大，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相似性較低。如圖7所示，與發(fā)酵前相比，接骨木果汁經(jīng)乳酸菌接種發(fā)酵后，烯烴類、醇類、酮類、烷烴類、酯類物質(zhì)的相對含量增加，醇類、酮類、烷烴類風(fēng)味物質(zhì)個(gè)數(shù)增加，且產(chǎn)生了很多新的物質(zhì)。

結(jié)合圖6和圖7，接骨木果實(shí)經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，相比較發(fā)酵前樣品，醛類物質(zhì)相對含量減少約87.37%，減少幅度較大；烯烴類物質(zhì)相對含量增加102.03%，新生成相對含量較高的為9.97%的環(huán)己基亞乙烯和6.78%的3-乙基-2-甲基-1，3-己二烯；醇類物質(zhì)在相對含量和種類上都有所增加，新生成相對含量較高的為4.42%的3-trans-（1，1-二甲基乙基）-4-反式甲氧基環(huán)己醇、3.42%的1-（2-己烯基）環(huán)己醇和4.94%的丙基環(huán)己醇；酮類物質(zhì)相對含量增加49.22%，其中含量較高的為5.35%的大馬士酮；烷烴類物質(zhì)相對含量增加186.38%；酯類物質(zhì)相對含量增加36.12%，其中增加幅度較大的物質(zhì)為10.32%的3Z-安琪庚酯；其它類物質(zhì)雖在相對含量上無明顯差異，但在種類上區(qū)別較大。

圖6 接骨木果汁樣品揮發(fā)性風(fēng)味成分的測定結(jié)果Fig.6 Identifification of the volatile flavor components of elderberry juice samples

圖7 乳酸菌發(fā)酵接骨木果汁揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對含量和種類個(gè)數(shù)Fig.7 Relative content and number of species of volatile flavor compounds in elderberry juice fermented by lactic acid bacteria

未接菌對照組的樣品中，醛類物質(zhì)的相對含量和種類和發(fā)酵前組較為相似；烯烴類物質(zhì)相對含量降低了40.42%；醇類物質(zhì)相對含量增加了139.02%，其中含量較高的為7.33%的順-2-甲基環(huán)己醇和7.21%的2-亞甲基環(huán)庚烷醇；未接菌對照組的酯類相對含量較發(fā)酵前組的降低了11.21%；其它類物質(zhì)的相對含量約為發(fā)酵前和發(fā)酵后樣品的1/2。

2.3 接骨木果汁揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主成分分析

利用SPSS 25 軟件對3 種接骨木果汁樣品中的99 種揮發(fā)性風(fēng)味化合物進(jìn)行主成分分析，所得的主成分的特征值和貢獻(xiàn)率如表2所示，所得的3 種接骨木果汁樣品的主成分散點(diǎn)圖和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主成分散點(diǎn)圖分別如圖8和圖9所示。

圖8 接骨木果汁樣品的PCA 分析圖Fig.8 PCA analysis chart of elderberry juice samples

圖9 99 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)PCA 分析圖Fig.9 PCA analysis chart of 99 kinds of flavor components

由表2可知，特征值大于1 的共2 個(gè)主成分，總方差100%的貢獻(xiàn)率來自于第1 主成分和2 主成分，其方差貢獻(xiàn)率分別為60.253%、39.747%，說明這2 個(gè)主成分幾乎反映了原始變量的所有信息。

表2 2 個(gè)主成分的特征值和貢獻(xiàn)率Table 2 Eigenvalues and contribution rate of 2 principal components

以3 種接骨木果汁的第1 主成分值為橫坐標(biāo)、第2 主成分值為縱坐標(biāo)作散點(diǎn)圖得圖8，3 種接骨木果汁中，發(fā)酵前組位于第2 象限，發(fā)酵后組位于第4 象限，未接菌對照組位于第3 象限。3 種樣品在象限區(qū)域內(nèi)分布區(qū)間差異顯著，表明樣品在風(fēng)味物質(zhì)組成上差異較大。

以99 種風(fēng)味物質(zhì)的第1 主成分載荷值為橫坐標(biāo)，第2 主成分的載荷值為縱坐標(biāo)，繪制主成分散點(diǎn)圖，由圖9可見，第1 主成分中正影響揮發(fā)性物質(zhì)載荷系數(shù)達(dá)到0.9 以上的有31 種，主要為烷烴類、烯烴類、醇類、酮類、酯類和其它類，這些成分與第1 主成分有高的相關(guān)性，第1 主成分中的主要代表有2-乙基-4，5-二甲基-1，2-氧雜戊烷（0.992）、螺[2.4]庚烷-4，6-二烯（0.967）、4，6-庚烷基-3-酮（0.967）、雙環(huán)[2.2.1]庚烷-7-醇（0.967）、3，5-二甲苯基N-甲基氨基甲酸酯（0.967）；負(fù)影響揮發(fā)物質(zhì)載荷系數(shù)達(dá)到0.9 以上有10 種，大多為醛類，主要代表有4，5，6，7-四氫-2-氨基-6-乙基苯并噻吩-3-羧酸乙酯（-1）、甲基庚烯酮（-0.997）、5-乙基環(huán)戊-1-烯醛（-0.997）。第2 主成分中載荷較高的正影響揮發(fā)性物質(zhì)主要為烯類和醛類，正影響揮發(fā)性物質(zhì)載荷系數(shù)達(dá)到0.9 以上有31 種，其代表成分為右旋萜二烯（0.973）、（E）-2-庚烯醛（0.965）、2-乙基己烯醛（0.965）；負(fù)影響揮發(fā)物質(zhì)載荷較高的主要為酯類和其它類，其中10-甲基-8-十四碳-1-醇乙酸酯（-0.935）較高。第1 主成分代表烷烴類、烯烴類、醇類和酯類，第2主成分代表烯類和醛類。

結(jié)合圖8和圖9，發(fā)酵初始的接骨木果汁主要揮發(fā)性物質(zhì)為醛類，發(fā)酵后的接骨木果汁主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為烯烴類、烷烴類和酯類，未接菌對照組的接骨木果汁主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為醇類和醛類，3 種樣品在風(fēng)味物質(zhì)的組成上有顯著差異。

3 討論

利用前期試驗(yàn)篩選得到的植物乳桿菌L1 和發(fā)酵乳桿菌L2 混合發(fā)酵接骨木果汁，發(fā)酵過程中的pH 值和總酸含量的變化規(guī)律都是呈現(xiàn)相反狀態(tài)，說明乳酸菌在該體系中正常生長并產(chǎn)酸。

花色苷是一種天然植物色素，也是一種生物活性物質(zhì)，但穩(wěn)定性不高，多種因素例如pH 值、光照、氧、酶、酚酸、金屬離子等可影響其穩(wěn)定性[24]。本研究中，發(fā)酵之前由于調(diào)節(jié)了pH 值，導(dǎo)致接骨木果汁的顏色由原先的亮紫色變?yōu)榘底仙?，夏其樂等[25]利用乳酸菌發(fā)酵楊梅汁，在調(diào)節(jié)pH 值過程中，楊梅汁顏色由紅色變?yōu)樽仙?，這是由于花色苷的結(jié)構(gòu)可隨pH 值的變化發(fā)生轉(zhuǎn)換，顯色發(fā)生差異。發(fā)酵過程中果汁中的花色苷含量在前期迅速下降，這可能與發(fā)酵體系中的氧氣含量和微生物代謝產(chǎn)生的糖苷酶有關(guān)。隨著發(fā)酵后期pH 值的下降，對維持花色苷的穩(wěn)定性有一定的保護(hù)作用，在較低的pH 值條件下，接骨木果汁恢復(fù)到原本的顏色。

總酚含量的提高可能是由乳酸菌在發(fā)酵過程中使接骨木果汁中糖基化酚類化合物去糖基化所致[20]。發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶和酸促進(jìn)了酚類和類黃酮從復(fù)雜大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)楹唵涡》肿有问絒26-27]。當(dāng)體系中的酚類物質(zhì)達(dá)到一定濃度時(shí)便會產(chǎn)生抑菌作用，或發(fā)酵菌種通過對酚類物質(zhì)的降解來維持自身生長，導(dǎo)致總酚含量的降低[28]。

3 種接骨木果汁樣品都含有比較豐富的右旋萜二烯，這種物質(zhì)有似鮮花的清淡香氣，果汁經(jīng)過發(fā)酵新生成了大馬士酮，這種物質(zhì)含有花香、果香和紫丁香的香氣特征[29]。在Di 等[30]的研究中，發(fā)酵前番茄汁的醛類最豐富，這一點(diǎn)與本試驗(yàn)測定結(jié)果一致，接骨木果汁經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，醛類物質(zhì)大量減少，醛類物質(zhì)經(jīng)乳酸菌代謝后分解為醇或被氧化為酸，醇類物質(zhì)的增加進(jìn)而會使相應(yīng)的酯類物質(zhì)增加[31]，乳酸菌在接骨木果汁中代謝后賦予了果汁更豐富且令人愉快的風(fēng)味。

4 結(jié)論

對接骨木果汁發(fā)酵過程中的理化指標(biāo)及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了測定及分析，結(jié)果表明植物乳桿菌L1 和發(fā)酵乳桿菌L2 可以在接骨木果汁中正常發(fā)酵生產(chǎn)，且部分活性物質(zhì)例如總酚總黃酮和抗氧化能力可以得到較好的提升，從而使接骨木乳酸菌發(fā)酵果汁具有較好的保健效果。通過對比分析接骨木果汁發(fā)酵前后風(fēng)味可知，發(fā)酵后的果汁在風(fēng)味物質(zhì)的組成和相對含量上發(fā)生了較大的變化，豐富且改善了原有的風(fēng)味。