植物油中不飽和醛作為特征氧化指標(biāo)的適用性

馬路凱，崔 蕓，劉 漩，劉袆帆，陳海光，程威威，李琳琳，劉國(guó)琴，朱立學(xué)

（1 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院 廣州 510225 2 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)創(chuàng)新研究院 廣州 510225 3 深圳大學(xué)高等研究院 廣東深圳 518000 4 華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 廣州 510225）

油脂是食物的組成成分，不僅為機(jī)體提供能量，還可提供多種必需脂肪酸和脂溶性營(yíng)養(yǎng)素[1]，具有預(yù)防心腦血管等慢性疾病，促進(jìn)大腦發(fā)育等重要的生理作用[2]。只有保證油脂安全，才能更好地發(fā)揮其營(yíng)養(yǎng)功效。植物油在精煉、加工、消費(fèi)及貯藏過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生一些對(duì)人體健康有危害作用的物質(zhì)，如反式脂肪酸（TFA）[3]、丙烯酰胺（AA）[4]、苯并（a）芘[5]、縮水甘油脂肪酸酯（GEs）[6]等，這些危害物多產(chǎn)生在植物油的加工過(guò)程，關(guān)于其生成規(guī)律目前有較為系統(tǒng)的研究，且已形成有效的抑制方法[7]。

植物油在貯藏過(guò)程中會(huì)發(fā)生自動(dòng)氧化，尤其是富含多不飽和脂肪酸（PUFA）的植物油，生成較多的氧化產(chǎn)物，以醛類物質(zhì)為主。在生成的眾多醛類物質(zhì)中，一些醛較難揮發(fā)，具有多種活性基團(tuán)，有極強(qiáng)的反應(yīng)活性，可與蛋白質(zhì)、DNA、磷脂等多種生物大分子發(fā)生共價(jià)結(jié)合，破壞其原有結(jié)構(gòu)和功能，具有一定的細(xì)胞毒性。其中丙二醛（MDA）、4-羥基己烯醛（HHE）和4-羥基壬烯醛（HNE）是3種典型的非揮發(fā)性活性醛。Butterfield 等[8]研究發(fā)現(xiàn)HNE 與載脂蛋白上的Cys 殘基結(jié)合，增加患阿爾茨海默病的風(fēng)險(xiǎn)。有研究[9]還發(fā)現(xiàn)HNE 的過(guò)度表達(dá)與前列腺癌的分級(jí)相關(guān)。Guillén 等[10]在多種植物油和油炸食物中發(fā)現(xiàn)了MDA、HNE 和HHE。比利時(shí)Papastergiadis 等[11]對(duì)16 種食物中3 種醛的分布進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)MDA、HHE 和HNE 的檢出率分別為84%，16%和63%，其中熱加工植物油和油炸食物中3 種醛的含量較高。其廣泛的分布及較高的含量，在國(guó)際上引起廣泛關(guān)注。比利時(shí)高級(jí)衛(wèi)生委員會(huì) （Belgian Superior Health Council）認(rèn)定MDA 和HNE 是危害人類健康的主要問(wèn)題之一[12]。美國(guó)學(xué)者指出HNE 可能是一種引發(fā)公共健康問(wèn)題的風(fēng)險(xiǎn)因子[13]。歐洲食品安全局（EFSA）科學(xué)委員會(huì)設(shè)定MDA、HNE 和HHE 的毒理學(xué)關(guān)注閾（TTC）值，分別為30，1.5 μg/（kg bw·d）和1.5 μg/（kg bw·d）[11]。至此，關(guān)于MDA，HHE 和HNE的研究成為新一輪的熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)關(guān)于其在植物油貯藏過(guò)程中的生成以及作為植物油氧化指標(biāo)，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究選取5 種市售植物油，研究其在儲(chǔ)藏過(guò)程中3 種毒性醛類物質(zhì)MDA、HNE 和HHE 的生成規(guī)律，同時(shí)探究其作為特征性油脂氧化指標(biāo)的適用性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棕櫚油（PO）、玉米油（CO）、菜籽油（RO）、茶籽油（CLO）和亞麻籽油（LO），廣州沃爾瑪超市；95%乙醇（分析純級(jí)）、石油醚（沸程30～60 ℃）、冰醋酸、異辛烷，天津市大茂化學(xué)試劑廠；對(duì)甲氧基苯胺（分析純級(jí)），上海Aladdin 試劑公司；2，4-二硝基苯肼 （DNPH，分析純級(jí)）、生育酚標(biāo)品（HPLC），美國(guó)Sigma 公司；甲醇（HPLC）、乙腈（HPLC），德國(guó)Merck 公司；HHE、HNE（標(biāo)準(zhǔn)品，>98%），美國(guó)Cayman 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA3204B 電子天平，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；UV-1780 紫外分光光光度計(jì)，島津（上海）實(shí)驗(yàn)器材有限公司；GC6890N-5975MS 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent 公司；P680 液相色譜儀、PDA-100 二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)Dionex公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 植物油中酸價(jià)（AV）、過(guò)氧化值（POV）和p-茴香胺值（p-AV）的測(cè)定 酸價(jià)、過(guò)氧化值和p-茴香胺值的測(cè)定分別參照國(guó)標(biāo)GB 5009.229-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中酸價(jià)的測(cè)定》、GB 5009.227-2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過(guò)氧化值的測(cè)定》 和GB/T 24304-2009 《動(dòng)植物油脂茴香胺值的測(cè)定》。

1.3.2 植物油中共軛二烯值（CDV）的測(cè)定 參照參考文獻(xiàn)[14]的方法并稍作修改。稱取適量油樣（0.05～0.20 g）于小燒杯中，用異辛烷溶解并用50 mL 容量瓶定容，于波長(zhǎng)232 nm 處測(cè)定其吸光度。以異辛烷溶劑做空白。共軛二烯值計(jì)算公式：

1.3.3 植物油中脂肪酸組成的測(cè)定 脂肪酸組成的測(cè)定參考文獻(xiàn)[1]方法。樣品經(jīng)甲酯化后，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定（GC-MS）。測(cè)定條件：采用Agilent DB-23 色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為氦氣；流速為1.0 mL/min；色譜升溫程序：130 ℃保持1 min，5 ℃/min 升溫至220 ℃，保持5 min；檢測(cè)器、進(jìn)樣口溫度220 ℃；分流比5∶1；進(jìn)樣量0.2 μL；質(zhì)譜條件：四級(jí)桿溫度和離子源溫度：200 ℃；掃描范圍：33～500（m/z）。

1.3.4 植物油中生育酚的測(cè)定 生育酚含量的測(cè)定采用GB/T 26635-2011《動(dòng)植物油脂 生育酚及生育三烯酚含量測(cè)定 高效液相色譜法》的方法。

1.3.5 植物油MDA、HNE 和HHE 含量的測(cè)定MDA、HHE 和HNE 的測(cè)定參考前期建立方法[15]。經(jīng)DNPH 衍生，所得衍生物用乙醇和水的混合物（1∶1，V/V） 提取。用配有光電二極管陣列檢測(cè)器（DAD）的高效液相進(jìn)行分離和檢測(cè)。條件：流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。流動(dòng)相為乙腈和水，梯度洗脫條件：前18 min 為45%溶劑A，5 min 內(nèi)從45%溶劑A 線性梯度至70%，然后，在70%溶劑梯度洗脫15 min。MDA-DNPH 的測(cè)定波長(zhǎng)為310 nm，HHE-DNPH 和HNE-DNPH 的測(cè)定波長(zhǎng)為378 nm。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。用軟件SPSS Statistics 24.0 進(jìn)行差異顯著性分析 （P<0.05），采用Origin 2016 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物油在儲(chǔ)藏過(guò)程中MDA、HNE 和HHE的含量變化

不同植物油儲(chǔ)藏過(guò)程中MDA、HNE 和HHE的生成情況如圖1所示。在新鮮市售植物油中有少量3 種醛類物質(zhì)，且MDA、HNE 和HHE 的含量隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。不同植物油中3 種醛的生成情況不同。

5 種植物油中均有毒性醛MDA 生成。圖1a、1b、1d所示，儲(chǔ)藏期間棕櫚油（PO）、玉米油（CO）、茶油 （CLO） 中MDA 的生成量都較少，菜籽油（RO）中MDA 含量變化較大，亞麻油（LO）儲(chǔ)藏期間的含量變化最大，且含量最高。Viau 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在37 ℃自動(dòng)氧化過(guò)程中，MDA 是ω-3 油氧化產(chǎn)生的主要次級(jí)產(chǎn)物。RO、LO 中含有較多的亞麻酸[17]，其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，容易發(fā)生氧化裂解[18]，生成較多的MDA。PO、CO、CLO 中亞麻酸含量極低，生成較少的MDA。

圖1 不同植物油儲(chǔ)藏過(guò)程中MDA、HNE 和HHE 的生成情況Fig.1 Formation of MDA，HHE and HNE in different vegetable oils during storage

不同植物油儲(chǔ)藏過(guò)程中生成的HNE 含量差異較大。在新鮮的PO 中沒(méi)有檢測(cè)到HNE，而經(jīng)60 ℃儲(chǔ)藏后生成HNE，其含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。PO 與CLO 中HNE 的生成量較少，而CO、RO和LO 中生成較多的HNE，其中CO 生成的HNE最多，RO 和LO 次之。有研究[19]表明HNE 的形成主要與亞油酸的氧化有關(guān)。HNE 的生成量差異可能是由脂肪酸種類及含量引起的。

5 種植物油中只有RO 和LO 中有HHE 生成。其中，LO 中HHE 含量隨時(shí)間的增加迅速增長(zhǎng)，RO 中HHE 的含量變化較小。CO、PO 和CLO中沒(méi)有檢測(cè)到HHE，可能是這3 種植物油中含有極低的HHE 形成前體物質(zhì)，或者還含有抑制HHE 形成的物質(zhì)。文獻(xiàn)[20]顯示HHE 是由ω-3 脂肪酸的過(guò)氧化作用產(chǎn)生的六碳脂醛。也有研究發(fā)現(xiàn)[21]HHE 的生成是個(gè)累積的過(guò)程。HHE 可能作為一些植物油（如RO 和LO）的特征性醛。

MDA、HNE 與HHE 生成量不同的原因可能是不同植物油的脂肪酸組成或其含有抑制醛生成物（如生育酚）。為此，測(cè)定了5 種植物油儲(chǔ)藏過(guò)程中的脂肪酸和生育酚含量變化。

2.2 儲(chǔ)藏過(guò)程中植物油中生育酚含量及不飽和脂肪酸的變化

為了探究生育酚與MDA、HNE、HHE 生成的關(guān)系，檢測(cè)植物油60 ℃儲(chǔ)藏過(guò)程中生育酚含量的變化，結(jié)果如圖2a所示。隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，植物油中總生育酚含量呈下降趨勢(shì)。儲(chǔ)藏15 d，僅CO 中檢出生育酚。儲(chǔ)藏30 d，所有受試植物油中生育酚含量均低于檢測(cè)限，表明生育酚對(duì)油脂氧化的抑制作用有限。有研究[22]發(fā)現(xiàn)花生油、茶籽油、玉米油在180 ℃煎炸下，其生育酚含量有下降趨勢(shì)。Song 等[23]發(fā)現(xiàn)植物油在氧化過(guò)程中，生育酚含量持續(xù)下降直至為零。這是因?yàn)樘烊豢寡趸瘎┲谢钚猿煞趾可?，且穩(wěn)定性較差，容易受光、熱等因素的影響[24]。

不飽和脂肪酸含量變化如圖2b所示。不同植物油中不飽和脂肪酸含量呈顯著下降趨勢(shì)（P<0.05），表明整個(gè)儲(chǔ)藏期間不飽和脂肪酸發(fā)生氧化降解。這說(shuō)明MDA、HNE 和HHE 的生成與不飽和脂肪酸組成有關(guān)。因?yàn)榭傊舅岷侩S著油儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，其中飽和脂肪酸所占比例呈增加趨勢(shì)，不飽和脂肪酸所占比例呈下降趨勢(shì)[25]。作者之前的研究[26]也發(fā)現(xiàn)，在180 ℃條件下8種植物油中HNE 在富含ω-6 脂肪酸的油中含量較高，HHE 在富含ω-3 脂肪酸的油中占主導(dǎo)地位。

圖2 不同植物油儲(chǔ)藏過(guò)程中總生育酚（a）、不飽和脂肪酸（b）含量的變化情況Fig.2 Changes of total tocopherol （a） unsaturated fatty acid （b） content in different vegetable oils during storage

2.3 植物油儲(chǔ)藏過(guò)程中傳統(tǒng)氧化指標(biāo)的變化

為更好地了解植物油儲(chǔ)藏過(guò)程中品質(zhì)變化，測(cè)定了30 d 儲(chǔ)藏（60 ℃）過(guò)程中傳統(tǒng)氧化指標(biāo)酸價(jià)、過(guò)氧化值、茴香胺值及共軛二烯值的變化，如圖3所示。5 種植物油中AV、POV、p-AV、CDV 的含量隨儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)均顯著升高 （P<0.05），表明植物油儲(chǔ)藏過(guò)程中氧化劣變程度加深，游離酸、過(guò)氧化物、醛酮等物質(zhì)含量增加。

圖3 不同植物油儲(chǔ)藏過(guò)程中酸價(jià)、過(guò)氧化值、茴香胺值、共軛二烯值的變化規(guī)律Fig.3 Changes of acid value，peroxide value，anisidine value and conjugated diene value of different vegetable oils during storage

趙宇明等[27]在研究貯藏對(duì)油脂理化指標(biāo)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)酸價(jià)作為評(píng)價(jià)油脂氧化的指標(biāo)不靈敏。Damerau 等[28]研究發(fā)現(xiàn)采用單一的傳統(tǒng)氧化指標(biāo)POV、p-AV 在評(píng)價(jià)油脂氧化穩(wěn)定性程度時(shí)，專一性不強(qiáng)，具有一定的局限性。有研究[14]表明5 種植物油（大豆油、玉米油、菜籽油、葵花籽油、椰子油）中CDV 值和p-AV 值出現(xiàn)不同的變化規(guī)律，很難把握二者的結(jié)合點(diǎn)，造成評(píng)價(jià)指標(biāo)的不準(zhǔn)確。單一從POV、p-AV、CDV 的變化來(lái)評(píng)價(jià)油脂氧化程度具有一定的缺陷。

2.4 主成分分析

基于以上數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步研究植物油中MDA、HHE 和HNE 的形成與不飽和脂肪酸組成的關(guān)系，以及MDA、HNE 和HHE 含量與植物油氧化程度之間的關(guān)系，對(duì)不同植物油的中脂肪酸組成、傳統(tǒng)氧化指標(biāo)、3 種醛（MDA、HHE、HNE）進(jìn)行主成分分析。如圖4所示，第1 主成分F1 和第2主成分F2 的貢獻(xiàn)率達(dá)100%。第1 主成分和第2主成分分別占總差異性的95.91%～97.57%和2.43%～4.09%，F(xiàn)1 貢獻(xiàn)率最大。

由圖4可知，植物油的氧化與亞油酸（ω-6）和亞麻酸（ω-3）等不飽和脂肪酸的過(guò)氧化作用密切相關(guān)。PO、CO、CLO 中從主成分F1 軸可清晰地看出MDA、HNE 與PUFA、ω-6 型脂肪酸表現(xiàn)出顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），即隨著MDA 與HNE 生成量的增加，PUFA、ω-6 脂肪酸含量減少。MDA、HNE與其余指標(biāo)均呈現(xiàn)正相關(guān)。由圖4a、4b、4d可知，MDA 與PUFA 和ω-6 型脂肪酸的夾角小于HNE，說(shuō)明MDA 與PUFA 和ω-6 型脂肪酸相關(guān)性低于HNE。又因?yàn)镸DA 是ω-3 油氧化產(chǎn)生的主要次級(jí)產(chǎn)物，所以MDA 不適合用來(lái)評(píng)價(jià)亞麻酸含量低的油脂氧化，而HNE 可作為油脂氧化的新指標(biāo)。如圖4c、4e所示，RO 和LO 中目標(biāo)醛類物質(zhì)MDA、HEN 和HHE 與PUFA、ω-6、ω-3 均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。由圖1c、1e可知，RO 中HNE 含量高，LO 中HHE 含量最高。研究[29]發(fā)現(xiàn)亞麻酸（ω-3）可以促進(jìn)亞油酸（ω-6）的氧化，可能是因亞麻酸與亞油酸的氧化存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系而導(dǎo)致RO 中HNE 的生成量較大。HHE 可作為亞麻酸含量高的油脂的氧化新指標(biāo)。

對(duì)不同植物油的氧化指標(biāo)進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖4f所示。PO 與CLO 在0，15，30 d 時(shí)分布較集中，均分布于第4 象限，說(shuō)明PO 與CLO 在此期間的氧化差異性較小。0 d 時(shí)RO、CO 和LO 集中在同一個(gè)區(qū)域，均分布于第3 象限，說(shuō)明0 d 時(shí)3 種植物油中MDA、HNE、與HHE 的差異不顯著。儲(chǔ)藏15 d 的RO 和LO，與儲(chǔ)藏30 d 的CO 均分布在第2 象限，說(shuō)明RO、LO 氧化15 d 時(shí)醛類物質(zhì)的生成量已達(dá)到CO 30 d 時(shí)的水平，由此可以準(zhǔn)確區(qū)分CO 與RO、LO。因CO 中的不飽和酸主要以ω-6 亞油酸[30]為主，又因亞油酸是HNE 的前體物[31]，故HNE 可用來(lái)評(píng)價(jià)CO 的氧化。儲(chǔ)藏30 d時(shí)LO、RO 分布同一區(qū)域，LO 中HHE 的含量遠(yuǎn)高于RO （圖1c、1e），可準(zhǔn)確區(qū)分LO 與RO，因此HHE 可用來(lái)評(píng)價(jià)LO 的氧化，即HNE、HHE 可作為特征指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)ω-6 和ω-3 脂肪酸的氧化。

圖4 不同植物油儲(chǔ)藏過(guò)程PCA 分析Fig.4 PCA analysis of different vegetable oil at storage processes

3 結(jié)論

對(duì)5 種植物油儲(chǔ)藏過(guò)程中，MDA、HHE 和HNE 的生成情況以及作為氧化指標(biāo)的適用性的研究表明：MDA 在LO 中的分布最廣，PO、RO、CLO 及CO 中有少量MDA 檢出。儲(chǔ)藏過(guò)程中PO與CLO 中HNE 的生成量較少，而CO、RO 和LO中生成較多的HNE。HHE 主要分布在LO 中，RO中含量極少。研究發(fā)現(xiàn)植物油中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)——生育酚雖可在一定程度上影響MDA、HNE 和HHE 的生成，但不是主要影響因素。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)醛的生成與植物油不飽和脂肪酸組成密切相關(guān)，PCA 分析表明：MDA 與植物油不飽和脂肪酸的相關(guān)性較低（P<0.05），不適合作為油脂氧化指標(biāo)。HNE、HHE 與不飽和脂肪酸的相關(guān)性高，可作為油脂氧化的新指標(biāo)。PCA 聚類分析表明：HNE 可用于評(píng)價(jià)ω-6 型植物油氧化，HHE 可用來(lái)評(píng)價(jià)ω-3 型植物油的氧化。HHE 和HNE 可作為特征性指標(biāo)反映植物油中ω-3 和ω-6 脂肪酸的消減。