螺旋藻多糖對秀麗隱桿線蟲氧化應激及壽命的影響

王 猛，馬浩天，關思宇，狄建兵，王 愈，李潤植，崔紅利，*

（1 山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所 山西太谷 030801 2 山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院 山西太谷 030801）

氧自由基反應及脂質(zhì)過氧化是維持機體新陳代謝、免疫應答的重要因素。當機體受到內(nèi)源或外源刺激而引起氧化應激時，氧自由基反應失衡，體內(nèi)積累大量的活性氧自由基 （Reactive oxygen species，ROS），進而導致自身抗氧化能力下降。現(xiàn)有研究表明，癌癥、衰老、心血管疾病、糖尿病或其它慢性疾病大多與氧化應激反應有關[1-3]。例如：ROS 刺激中樞神經(jīng)氧化會導致多種神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默綜合癥 （Alzheimer's disease，AD）和亨廷頓氏?。℉untington's disease，HD）等[4-5]。生物體細胞ROS 富集會引起生物體機能退化，而藥物合理干預動物機體會提高抗氧化性，緩解ROS 迸發(fā)所致衰老及疾病。目前，人工合成的抗氧化劑毒副作用較大，抗氧化效率較低，在應用范圍上有很大的局限性。尋找天然抗氧化藥物至關重要。來源于海藻的天然產(chǎn)物，如海藻多糖因毒副作用小而備受關注。有研究表明，海藻多糖因具有較強的抗氧化作用，故能夠顯著延緩線蟲衰老[6]。

螺旋藻多糖（Spirulina polysaccharides，PSPs）是一種生理活性多糖，廣泛存在于藍藻門螺旋藻屬，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗病毒、抗便秘以及提高機體免疫等多重功效[7-15]。Zheng等[16]研究表明，PSPs 對阿爾茨海默病小鼠腦線粒體氧化有保護作用。陳帥行等[17]發(fā)現(xiàn)，PSPs 可緩解急性酒精中毒引起的小鼠內(nèi)臟氧化損傷。近年來，隨著PSPs 生物活性作用研究的不斷深入，市場上PSPs 功能食品應運而生，然而其作為外源活性物質(zhì)對緩解生物氧化應激及延緩壽命的分子機制尚不明確，本文將針對PSPs 的抗氧化分子機制做進一步研究。

秀麗隱桿線蟲 （Caenorhabditis elegans，C.elegans）具有成本低、繁殖力強、遺傳背景清晰、與人類因同源性高等特點，被廣泛用作抗氧化和抗衰老研究的模型生物[18-19]。胰島素/類胰島素生長因子（Insulin/IGF-1，IIS）是一條經(jīng)典的進化高度保守的衰老調(diào)控通路，廣泛存在于在模式動物體內(nèi)。前人研究發(fā)現(xiàn)通過對IIS 信號通路的適度抑制，可延緩哺乳動物衰老，延長壽命[20-21]。此外，研究表明多糖可通過作用于某些信號通路信號分子來調(diào)節(jié)下游基因的表達[22]。據(jù)此推測PSPs 可以通過調(diào)控相關信號通路增強線蟲抵抗氧化應激的能力。本研究以飼喂OP50 的秀麗隱桿線蟲為模式動物，研究PSPs 對線蟲抗氧化性及其作用機制，為其作為天然食品開發(fā)利用提高理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

1.1.1 試驗材料 PSPs，購自福清市新大澤螺旋藻有限公司，由山西農(nóng)業(yè)大學分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所保管。菌株（N2 株系），購自美國線蟲遺傳中心（Caenorhabditis genetics center，CGC）。將線蟲接種于添加尿嘧啶缺陷型大腸桿菌（OP50）的線蟲生長培養(yǎng)基（NGM）培養(yǎng)基，培養(yǎng)于在20℃恒溫培養(yǎng)箱，光暗時間為12 h/12 h，光強3 000 Lx。

無水乙醇、甲醇、H2O2，天津恒興化學試劑制造有限公司（分析純級）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH，分析純級）、ROS 熒光探針二氫乙錠（Dihydroethidium，DHE）試劑盒、熒光素二乙酸（FDA）、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒、BCA 法蛋白質(zhì)濃度測定等相關試劑盒，南京建成生物科技研究所。

1.1.2 儀器與設備 WFJ2100 紫外光分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司；LX73 正置熒光顯微鏡，日本Olympus 公司；Boxun BJ-CD 超凈工作臺，上海博訊實業(yè)有限公司；體式顯微鏡，重慶奧特光學儀器公司；H1850 臺式冷凍離心機，湘潭湘儀儀器有限公司；LRH-250F 生化培養(yǎng)箱，無錫瑪瑞特科技有限公司；MyCycler PCR 儀、MyiQ2 qPCR 儀，美國Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 DPPH 自由基清除能力的測定 DPPH 自由基清除能力測定根據(jù)參考文獻[23]所述方法。首先將PSPs 分別配制成質(zhì)量濃度為1，2，3，4，5 mg/mL 的樣品溶液，每個質(zhì)量濃度重復3 次，避光室溫反應30 min，然后用紫外分光光度計在波長517 nm 處測定每組吸光度值，根據(jù)公式計算自由基清除率。

式中，A0——2 mL 無水乙醇+2 mL DPPH 吸光值；A1——2 mL 樣液+2 mL DPPH 吸光值；A2——2 mL 無水乙醇+2 mL 樣液吸光值。

1.2.2 總還原力的測定 總還原力測定方法根據(jù)參考文獻[30]的方法。取1.2.1 節(jié)的PSPs 樣品溶液1 mL，分別加入2.5 mL PBS（pH=6.6）和1%K3Fe（CN）6，充分混勻后50 ℃水浴20 min。冷卻后加入2.5 mL 10% CH3COOCl3、蒸餾水和0.5 mL 0.1% FeCl3充分反應，靜置10 min 后用紫外分光光度計測定波長700 nm 處的吸光值。

1.2.3 線蟲壽命、運動能力和活力的測定 將同期化至L4 期線蟲隨機分為4 組，分別接種至不含或含有不同質(zhì)量濃度（50，100，200 μg/mL）PSPs 的NGM 培養(yǎng)基飼養(yǎng)（飼喂OP50，為防止排卵影響，添加150 μmol/L 五氟尿嘧啶）。每組3 次重復，每板30 條，于恒溫、恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此時記為線蟲壽命的第0 天。每天更換新鮮培養(yǎng)基，同時挑出死亡線蟲，記錄存活個數(shù)，計算生存率，直至所有線蟲死亡（判別標準：線蟲無移動及吞咽動作，用鉑金探針輕觸蟲體無任何反應的即為死亡）。鉆入培養(yǎng)基的線蟲及因其它因素死亡的線蟲從統(tǒng)計數(shù)據(jù)中排除，每個獨立試驗至少3 次平行。以生存率百分比為縱坐標，繪制生存曲線，并用Origin 軟件進行單因素方差分析（One-way analysis of variance，One-way ANOVA），數(shù)據(jù)采用平均值±標準差（±s）表示。

線蟲運動能力檢測參考文獻[24]的方法。將同期化至L4 期線蟲轉入含有或不含PSPs 的NGM培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)，在第5，10 天時挑在1 mL M9 緩沖液的平板上，適應5 min 后觀察并記錄30 s 內(nèi)頭部擺動次數(shù)，每條線蟲統(tǒng)計3 次重復，取平均值為最終結果。每個獨立試驗至少設置3 次平行。線蟲活力采用二乙酸熒光素法（FDA）測定：取一線蟲培養(yǎng)平板，切除2.0 cm×2.0 cm 的瓊脂，加入M9 緩沖液，低速離心后收集蟲體。將5 mL FDA 溶于1 mL 丙酮中，避光4 ℃保存。熒光檢測前，將0.4 mL FDA 加入0.65 mol/L 甘露醇溶液中，每個蟲體樣品避光染色40 min，用磷酸鹽-生理鹽水緩沖液沖洗3 次，用熒光顯微鏡在激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長530 nm 的藍光下鏡檢。

1.2.4 體內(nèi)脂褐素、ROS 及抗氧化酶的測定 采取自發(fā)熒光法檢測脂褐素。收集不同處理的蟲體，置于熒光顯微鏡紫外激發(fā)光下觀察。ROS 測定：取滅菌平板，加入M9 緩沖液，收集蟲體后用DHE 熒光探針避光孵育30 min，于激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長530 nm 藍光觀察。為了確定PSPs 是否介導體內(nèi)抗氧化酶活性表達，收集PSPs 給藥2 d 后的蟲體，檢測其SOD 和CAT 酶活性。測定方法：選取離心后的蟲體樣本1 mL，置于EP 管中，離心后收集沉淀，加入液氮研磨，其CAT、SOD 活性分別用相應的試劑盒測定，結果以對照組的100%表示。同時將收集的部分蟲卵離心、研磨，取上清液用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。

1.2.5 秀麗隱桿線蟲氧化應激模型的建立 將接種于含有或不含PSPs 的培養(yǎng)基（培養(yǎng)基含有150 μL 五氟尿嘧啶）上培養(yǎng)2 d 的線蟲，急性暴露于1‰ H2O2的NGM 培養(yǎng)基上，飼喂OP50，每隔1 h計數(shù)線蟲的存活個數(shù)，繪制生存曲線，直至全部死亡。

1.2.6 mRNA 提取及熒光定量PCR 檢測 將同期化L4 期線蟲用多糖處理后，培養(yǎng)2 d。收集蟲體于離心管中，PBS 緩沖液清洗3 次。Trizol 法提取線蟲總RNA，Primer 5.0 設計相關基因引物。用SYBR Green 為DNA 熒光染料，實時熒光定量PCR 測定，以β-Actin 為內(nèi)參測定daf-16 及其下游靶基因的表達量，基因表達以PCR 的2-ΔΔCt值表示。

表1 秀麗隱桿線蟲抗氧化基因?qū)崟r定量PCR 引物Table 1 Real time quantitative PCR primers for antioxidant genes of C.elegans

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)處理采用Graphpad Prism 5.0，P＜0.05表示差異顯著，圖中用* 標記；P＜0.01 表示極顯著差異，圖中用** 標記。數(shù)據(jù)采用平均值±標準差（x±s）表示，用One-way ANOVA 處理，F(xiàn)DA 染色、脂褐素以及ROS 熒光用顯微鏡觀察并拍照，作圖用Origin 9.1。

2 結果

2.1 PSPs 清除DPPH 自由基和提升總還原力能力

DPPH·清除率是典型的體外抗氧化活性定量評價指標。本文用VC 作對照，評價PSPs 對DPPH自由基的清除能力，如圖1a所示。當PSPs 質(zhì)量濃度0～5 mg/mL 時，隨著給藥質(zhì)量濃度的增加，DPPH 自由基清除率顯著增加，效果呈質(zhì)量濃度依賴性；當PSPs 質(zhì)量濃度為5 mg/mL 時，其對DPPH·清除率最大，為42.37%。眾所周知，抗氧化劑對Fe3+的還原能力與抗氧化活性成正相關，PSPs 的還原力越強抗氧化效果越強。圖1b 顯示，在質(zhì)量濃度為0～5 mg/mL 范圍，PSPs 對鐵氰化鉀的還原力呈質(zhì)量濃度依賴性增加。

圖1 螺旋藻多糖自由基清除率（a）和總還原力（b）測定Fig.1 Determination of free radical clearance （a） and total reducing power （b） of PSPs

2.2 PSPs 對秀麗隱桿線蟲壽命的影響

用不同質(zhì)量濃度的PSPs（50，100，200 μg/mL）培養(yǎng)N2 野生型秀麗隱桿線蟲，研究PSPs 對線蟲壽命的影響。存活率曲線以及各劑量PSPs 處理對線蟲平均壽命的影響結果見圖2a 和表2。結果表明，不同質(zhì)量濃度的樣品溶液處理的線蟲均顯示壽命延長的趨勢，特別是200 μg/mL PSPs 治療組。由圖2a 可見，對照組線蟲的最長壽命為20 d，而50，100，200 μg/mL PSPs 處理組的最長壽命為24，24，28 d，分別延長了4，4，8 d。在適當生活條件下，對照組平均壽命為（10.58±1.21）d。與對照組相比，高質(zhì)量濃度PSPs 顯著延長線蟲平均壽命至（16.82±0.62）d，存活率提高58.98%。100 μg/mL PSPs 組平均壽命為（14.38±1.93）d，與對照組相比存活率增加35.92%。50 μg/mL PSPs 組存活率增加相對較低，為20.13%，平均壽命為（12.71±0.90）d。綜上所述，與對照組相比，PSPs 對線蟲壽命的影響存在顯著性差異且呈劑量依賴性。

表2 不同質(zhì)量濃度PSPs 對線蟲平均壽命的影響（±s，n=3）Table 2 Effects of different mass concentrations of PSPs on the average lifespan of C.elegans （±s，n=3）

表2 不同質(zhì)量濃度PSPs 對線蟲平均壽命的影響（±s，n=3）Table 2 Effects of different mass concentrations of PSPs on the average lifespan of C.elegans （±s，n=3）

注：與對照組相比，*.P<0.05；**.P<0.01。

壽命延長率/%對照組 空白 10.58±1.21-50 12.71±0.90 20.13 PSPs 組 100 14.38±1.93* 35.92 200 16.82±0.62** 58.98組別 劑量/μg·mL-1平均壽命/d

2.3 PSPs 對秀麗隱桿線蟲活力及運動能力的影響

機體衰老會伴隨著各項生理機能的衰退，線蟲運動能力也會衰退。本試驗以線蟲是否做連續(xù)頭臂擺動運動為衡量標準，在線蟲生活的第5，10天評估PSPs 對線蟲的運動能力的影響。如圖2b所示，PSPs 干預后的第5 天，與對照組相比低劑量PSPs 試驗組線蟲的運動能力未見明顯差異，飼喂200 μg/mL PSPs 的線蟲則表現(xiàn)出較強的運動能力。值得注意的是直至第10 天，雖然隨著生命周期的進展線蟲的代謝能力有所降低，但與對照組相比，治療組線蟲運動能力仍然較強。

如圖2c所示，PSPs 處理后，利用FDA 染液在熒光顯微鏡下觀察蟲體。因FDA 本身特性，進入蟲體后細胞具有活性而發(fā)出綠色熒光，與對照組相比，飼喂PSPs 對線蟲活力影響不顯著，間接提示PSPs 對蟲體無任何毒害作用。

圖2 PSPs 對線蟲壽命、運動能力以及活力的影響Fig.2 The effect of PSPs on life span，exercise capacity and vitality of C.elegans

2.4 PSPs 對延長線蟲氧化應激抵抗力的影響

H2O2通過誘導細胞產(chǎn)生自由基誘發(fā)細胞氧化損傷，進而破壞機體代謝功能。圖3表明，在H2O2急性應激試驗中，與對照組相比，經(jīng)不同質(zhì)量濃度PSPs 處理的線蟲暴露于H2O2環(huán)境中的生存能力顯著提高（P<0.05），并呈劑量依賴性。50，100 μg/mL 和200 μg/mL PSPs 干預后，線蟲的平均壽命分別為（4.20±0.24），（4.56±0.17），（4.67±0.29）h，壽命相對延長率為14.44%，24.25%和27.25%（表3），表明在急性氧化應激下，PSPs 對線蟲有顯著保護作用（P<0.05），可有效提高線蟲氧化應激耐受性，且200 μg/mL 時效果最佳。

圖3 急性氧化應激下PSPs 對線蟲壽命的影響Fig.3 Effect of PSPs on life span of C.elegans under acute oxidative stress

表3 急性氧化應激下不同質(zhì)量濃度PSPs 對線蟲的影響（±s，n=3）Table 3 Effect of different mass concentrations of PSPs on C.elegans under acute oxidative stress （±s，n=3）

表3 急性氧化應激下不同質(zhì)量濃度PSPs 對線蟲的影響（±s，n=3）Table 3 Effect of different mass concentrations of PSPs on C.elegans under acute oxidative stress （±s，n=3）

注：與對照組相比，* 代表P<0.05；** 代表P<0.01。

壽命延長率/%對照組 空白 3.67±0.12-50 4.20±0.24* 14.44 PSPs 組 100 4.56±0.17** 24.25 200 4.67±0.29** 27.25組別 劑量/μg·mL-1平均壽命/h

2.5 PSPs 降低體內(nèi)ROS 含量

隨著機體的衰老，線蟲各項代謝功能下降，脂褐素大量積累在細胞內(nèi)造成細胞損傷。由圖4a 可見，與對照組相比，用PSPs 處理后線蟲脂褐素水平顯著降低，表明PSPs 可改善年齡色素沉積，緩解細胞的衰老。活性氧ROS 在正常生理代謝過程中維持穩(wěn)態(tài)，在氧化劑的誘導下，機體自由基反應失衡，大量的自由基會聚集在細胞內(nèi)，因此限制線蟲壽命的主要因素是ROS 積累所引起的氧化應激反應[25-26]。如圖4b所示，與對照組相比，PSPs 可改善體內(nèi)ROS 水平，隨著PSPs 質(zhì)量濃度的增加，作用效果顯著。

圖4 PSPs 對線蟲脂褐素和ROS 影響Fig.4 Effect of PSPs on lipofuscin and ROS levels in C.elegans

2.6 PSPs 提高線蟲體內(nèi)SOD、CAT 的活性

細胞發(fā)生氧化應激進而發(fā)展到細胞損傷等一系列級聯(lián)反應，往往是由抗氧化酶類物質(zhì)難以清除過量的自由基所致，在這一過程中，SOD 和CAT發(fā)揮了重要作用。如圖5a 和b所示，與對照組相比，PSPs 顯著增強CAT 和SOD 的活力，其中100 μg/mL PSPs 和200 μg/mL PSPs 組CAT 活性分別增加1.55 倍和1.61 倍。同時SOD 活性也分別增加了1.50 和1.78 倍。結果表明PSPs 通過促進線蟲體內(nèi)抗氧化酶表達清除自由基。

圖5 PSPs 抗氧化酶對秀麗隱桿線蟲的影響Fig.5 Effect of PSPs antioxidant enzymes on C.elegans

2.7 PSPs 對線蟲IIS 信號通路基因表達量的影響

以上試驗表明，PSPs 介導了線蟲抗氧化及壽命的延長。為進一步檢測PSPs 對線蟲體內(nèi)抗氧化分子機制，利用qRT-PCR 分析PSPs 對IIS 信號通路上轉錄因子Daf-16 和Skn-1 以及下游基因的影響。結果如圖6所示，相比于對照組，試驗組線蟲體內(nèi)轉錄因子Daf-16 的轉錄水平顯著增強，其下游靶基因sod-3 和clt-2 轉錄水平極顯著增強。Skn-1 和長壽基因sir2.1 是線蟲體內(nèi)壽命調(diào)節(jié)的重要調(diào)控因子，這兩個基因轉錄水平均顯著提高（P＜0.05），且呈劑量依賴性，在200 μg/mL PSPs處理下，Skn-1 和sir2.1 的表達分別增加1.88 倍和1.95 倍。這幾個胰島素信號通路上關鍵因子表達的提高，表明PSPs 是通過上調(diào)抗氧化相關基因的表達及壽命調(diào)控因子水平，提高線蟲抵抗氧化應激及延緩衰老的能力。

圖6 PSPs 對胰島素信號通路基因轉錄水平的影響Fig.6 The effect of PSPs on the transcription level of insulin signaling pathway genes

3 討論

隨著年齡的增長，細胞受到氧化損傷而引起其抗氧化功能紊亂。氧化應激在衰老相關疾病發(fā)作中的作用已有文獻記載，抗氧化劑被認為能夠減弱或預防衰老所帶來的影響[27]。PSPs 是一種具有多種生物學活性的天然產(chǎn)物，具有強大的抗氧化能力。線蟲能夠調(diào)節(jié)細胞抗逆性和新陳代謝，符合衰老的自由基理論，被廣泛用作研究氧化應激和衰老的模式生物[28]。Li 等[29]研究表明，連翹花色素通過提升線蟲體內(nèi)SOD 和CAT 酶活性以及上調(diào)壽命相關基因的表達來抵抗氧化應激。H2O2介導下細胞會產(chǎn)生大量的ROS，從而加快蟲體組織損傷，縮短壽命；細胞受到氧化劑的誘導，會發(fā)生過氧化反應，造成組織損傷甚至細胞凋亡，為維持機體正常代謝活動，生物體在長期的進化過程中形成了能夠特異性抑制機體氧化損傷的抗氧化體系，主要包括抗氧化酶和非酶類抗氧化劑。研究發(fā)現(xiàn)，天然多糖通過作用于部分信號通路分子調(diào)控機體抗氧化[30]。作者通過胰島素信號通路來驗證PSP 對機體氧化應激的影響。

IIS 信號通路是在分子水平上研究衰老模型的保守信號通路[31]，如圖7所示。Daf-16 是線蟲體內(nèi)參與提高應激抵抗以及代謝基因表達的重要轉錄因子，可在一定程度上延長壽命。通常在哺乳動物體內(nèi)，胰島素信號通路的激活引起一系列磷酸化級聯(lián)反應，最終導致FOXOS/daf-16 核轉錄因子排出細胞核失活[32]。本研究表明，PSPs 處理后，線蟲體內(nèi)daf-16 的表達量顯著升高（P＜0.05），且其下游靶基因sod-3 和clt-1 的mRNA 相對表達量極顯著升高 （P＜0.01）（圖6），表明PSPs 可促進daf-16 激活并上調(diào)下游基因的表達，進而提升線蟲對氧化應激的抵抗力。Zhang 等[33]研究表明，紫山藥多糖通過作用胰島素信號通路使daf-16 進入細胞核，調(diào)控細胞核內(nèi)抗氧化酶基因的表達，從而增強細胞的抗氧化能力并延長線蟲的壽命。

圖7 PSPs 通過Insulin/IGF-1 通路在秀麗隱桿線蟲中抗氧化功能的假想機理圖Fig.7 Hypothetical mechanism diagram of PSPs antioxidant function in C.elegans via the Insulin/IGF-1 pathway

Sir-2.1（沉默信息調(diào)節(jié)蛋白）是一類進化相對保守的蛋白因子，sir-2.1 可通過抑制AKT/PI3K的磷酸化及基因表達，促使FOXOS/daf-16 轉錄因子的表達，發(fā)生核轉位并與下游調(diào)控抗氧化酶基因相結合，上調(diào)其表達，從而清除ROS，增強機體抵抗氧化應激的能力[34]。本研究結果顯示，PSPs 處理后，與空白組相比sir-2.1 轉錄水平顯著升高（P＜0.01）。在線蟲體內(nèi)，skn-1 是調(diào)控機體氧化應激的重要轉錄因子，同樣受IIS 信號通路的調(diào)控。本研究結果表明，PSPs 能夠顯著提高skn-1 mRNA 的表達水平（P＜0.01）。推測PSPs 對線蟲氧化應激抵抗力的提高以及壽命的延長，是通過調(diào)控sir-2.1，daf-16 和skn-1 的表達作用的結果。

4 結論

總之，線蟲經(jīng)不同質(zhì)量濃度的PSPs 干預后，其壽命、運動能力和內(nèi)源性抗氧化水平提高。此外，通過對衰老相關信號通路轉錄因子表達水平的測定，揭示了PSPs 提高線蟲氧化應激的抵抗力和延長壽命的潛在分子機制，為PSPs 抗氧化的研究提供了理論依據(jù)，并為未來PSPs 作為抗氧化劑的開發(fā)應用提供數(shù)據(jù)支撐。線蟲氧化應激及壽命的調(diào)控機制較為復雜，且PSPs 為水溶性大分子活性物質(zhì)，本試驗中并沒有將提取的PSPs 進行分離，具體何種組分對線蟲氧化應激發(fā)揮作用還不得而知。后續(xù)試驗過程中應重點探究PSPs 不同組分對線蟲的影響，整合多組學技術挖掘PSPs 的抗氧化、抗衰老功能的新型作用靶點。