添加α-乳白蛋白和色氨酸的嬰兒配方奶粉對(duì)新生大鼠腦發(fā)育的影響

張一帆，逄金柱，米麗娟，李依璇

（1 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 北京 100183 2 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)營(yíng)養(yǎng)與健康系（營(yíng)養(yǎng)與健康研究院） 北京 100083 3 內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司 北京 101107）

腦是一切認(rèn)知功能、調(diào)節(jié)功能的樞紐，是人類一切生命活動(dòng)的最高中樞[1-2]。嬰幼兒出生后的12個(gè)月內(nèi)是其大腦發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，大腦的結(jié)構(gòu)、功能、容量和連通性等發(fā)育迅速[3]。足月出生的嬰兒平均大腦體積僅為成人大腦平均體積的三分之一，在3月齡前，其體積會(huì)以4%/d 的速度增長(zhǎng)，3月齡后減小到1%/d，在1 歲時(shí)腦容量翻倍[4-5]。在這段腦發(fā)育的黃金時(shí)期，嬰幼兒的營(yíng)養(yǎng)供給十分重要。

母乳是嬰兒最佳的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，嬰幼兒配方奶粉的營(yíng)養(yǎng)成分應(yīng)最大程度地與母乳接近，以滿足嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育的需要[6]。目前的嬰幼兒配方奶粉的基本組成成分是模擬母乳設(shè)計(jì)的，可以基本滿足嬰幼兒對(duì)蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物以及維生素和礦物質(zhì)等微量元素的需求[7]。然而，二者在脂肪酸結(jié)構(gòu)、氨基酸組成以及低聚糖的種類及組成上仍有較大差異，因此母乳喂養(yǎng)與人工喂養(yǎng)仍有較大差異。在腦發(fā)育方面，母乳喂養(yǎng)更有利于嬰兒的神經(jīng)和大腦發(fā)育。李霞[8]的研究發(fā)現(xiàn)，母乳喂養(yǎng)的嬰兒精神發(fā)育指數(shù)（MDI）、運(yùn)動(dòng)發(fā)育指數(shù)（PDI）指數(shù)均顯著高于人工喂養(yǎng)的嬰兒。開(kāi)發(fā)一款適合嬰幼兒腦發(fā)育的配方奶粉十分重要。

目前，主流的促進(jìn)腦發(fā)育的嬰幼兒配方是在奶粉中添加二十二碳六烯酸（DHA）和花生四烯酸（AA），二者對(duì)嬰幼兒的視網(wǎng)膜和大腦功能具有重要的意義[9]。近年研究表明，5-羥色胺（5-HT）與腸道菌群對(duì)兒童的神經(jīng)系統(tǒng)與腦發(fā)育同樣具有重要的意義[10]，如念珠菌、鏈球菌、腸球菌可以產(chǎn)生5-HT，同時(shí)海馬區(qū)內(nèi)5-HT 受體1A（5-HT1A）與學(xué)習(xí)記憶功能相關(guān)[11-12]；5-HT 也是腸腦軸與腸道菌群相互作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，能影響大腦的信號(hào)傳導(dǎo)、情緒控制、學(xué)習(xí)與記憶力，同時(shí)也參與免疫功能[13]。根據(jù)GB 10765-2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰兒配方食品》的最新要求，奶粉中需要增加α-乳白蛋白以及某些氨基酸【色氨酸（Trp）、亮氨酸等】的含量，使其蛋白組成與氨基酸模式更接近母乳[14]。本研究通過(guò)增加α-乳白蛋白和色氨酸的含量以及調(diào)整總蛋白含量，設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)一款升級(jí)版的嬰兒配方奶粉，探究其對(duì)新生大鼠腦發(fā)育的影響，為研發(fā)升級(jí)且更適合嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育的配方奶粉提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD 大鼠整窩鼠，7日齡，體重13～15 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（京）2017-0033。本試驗(yàn)通過(guò)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號(hào)：AW71302202-5-1。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室恒溫（22±2）℃，恒濕（55±5）%，每12 h 晝夜交替。

1.1.2 試驗(yàn)原料 普通1 段嬰兒配方奶粉、升級(jí)嬰兒配方奶粉（蒙牛-雅士利、瑞哺恩），其主要成分見(jiàn)表1。

表1 不同嬰兒配方奶粉配方主要成分Table 1 Main ingredients of different infant formula

1.1.3 試劑 4%多聚甲醛通用型組織固定液，索萊寶生物科技有限公司；大鼠5-羥色胺（5-HT）ELISA 檢測(cè)試劑盒、大鼠5 羥基吲哚乙酸（5-HIAA）ELISA 檢測(cè)試劑盒；上海江萊生物有限公司；L-色胺酸，美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.1.4 儀器 Multiskan FC 酶標(biāo)儀、Fresco21 冷凍離心機(jī)，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；Agilent 1290 Infinity 超高壓液相色譜儀、Agilent 6460 三重四極桿質(zhì)譜儀配有電噴霧離子源（ESI），美國(guó)安捷倫科技公司；MS105DU 電子分析天平，瑞士Mettler Toledo 公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案 以30 只7日齡的SD 大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，隨機(jī)分為3 組，每組10 只子鼠與1只母鼠，每組子鼠雌、雄各半。實(shí)驗(yàn)大鼠分為鼠乳喂養(yǎng)組（空白對(duì)照）、普通配方奶粉喂養(yǎng)組和升級(jí)配方奶粉喂養(yǎng)組（NZ 小試產(chǎn)品），兩種配方奶粉除α-乳白蛋白、色氨酸含量不同外，總能量、總蛋白及其它營(yíng)養(yǎng)素的含量無(wú)顯著差異。將奶粉與水配制成22.5 g/100 mL 質(zhì)量濃度溶液，每次以0.4 mL/10 g BW 劑量灌胃實(shí)驗(yàn)組大鼠，每4 h 灌胃1次（白天10：00、14：00、18：00 灌胃，10：00 須提前斷食4 h），晚上（18：00 至次日早上6：00）由母鼠自由喂奶。鼠房溫度22～24 ℃，濕度60%～70%，每日光照時(shí)間為8：30～20：30。預(yù)期喂飼21 d，測(cè)量大鼠生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)和神經(jīng)行為指標(biāo)，之后斷頸處死取臟器進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.2.2 體質(zhì)量測(cè)量 測(cè)定SD 大鼠第0，7，14，21天的體質(zhì)量。

1.2.3 16 S rDNA 測(cè)序 采用CTAB 凍融法提取每組糞便樣品的總DNA，同時(shí)采用Nanodrop 對(duì)DNA 進(jìn)行定量，并通過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 提取質(zhì)量。然后通過(guò)PCR 擴(kuò)增目標(biāo)片段。采用Illumina 公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 制備測(cè)序文庫(kù)后上機(jī)進(jìn)行高通量測(cè)序。得到的測(cè)序數(shù)據(jù)根據(jù)序列質(zhì)量初篩，重測(cè)、補(bǔ)測(cè)問(wèn)題樣本。通過(guò)篩選的原始序列按照index 和barcode 信息進(jìn)行文庫(kù)和樣本劃分，并去除barcode序列。按照QIIME2 dada2 分析流程去噪、OTU 聚類。測(cè)序工作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 不同蛋白質(zhì)和氨基酸配方嬰兒奶粉對(duì)SD大鼠體質(zhì)量的影響

為評(píng)價(jià)不同蛋白質(zhì)和氨基酸配方嬰兒奶粉對(duì)SD 大鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響，對(duì)SD 大鼠的體質(zhì)量進(jìn)行測(cè)量。如圖1所示，實(shí)驗(yàn)前各組大鼠初始體質(zhì)量無(wú)明顯差異，從第2 周開(kāi)始，各組之間出現(xiàn)差異，且差異持續(xù)到實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?。隨著時(shí)間的推移，每組小鼠的體質(zhì)量均呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，且普通配方奶粉組體質(zhì)量增加最快，而各組間無(wú)顯著差異，表明不同蛋白質(zhì)和氨基酸配方嬰兒奶粉對(duì)SD 大鼠生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)影響。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量變化Fig.1 The body weight changes of rats in each group

2.2 不同蛋白質(zhì)和氨基酸配方嬰兒奶粉對(duì)SD大鼠臟器指數(shù)的影響

胸腺和脾臟是重要的免疫器官，其臟器指數(shù)可在一定程度上反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱。為探究不同蛋白質(zhì)和氨基酸配方嬰兒奶粉對(duì)SD 大鼠臟器發(fā)育的影響，對(duì)飼喂不同配方奶粉新生大鼠的臟器指數(shù)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，對(duì)于心臟、肺、腎和腦，各組之間臟器指數(shù)無(wú)顯著性差異（P>0.05）。對(duì)于肝臟，普通配方奶粉組的大鼠肝臟質(zhì)量較空白組顯著增加（P<0.05），較高的肝臟指數(shù)不利于健康，可能與肥胖與脂肪肝相關(guān)[15]。對(duì)于免疫器官，普通配方奶粉組的大鼠脾臟重量較空白組顯著增加（P<0.05），升級(jí)配方奶粉組的脾臟質(zhì)量雖最大，但與普通配方奶組相比無(wú)顯著性差異；升級(jí)配方奶粉組的大鼠胸腺質(zhì)量較空白組和普通配方奶粉組的大鼠顯著增加（P<0.05）。從臟器指數(shù)層面看，普通配方奶粉有助于脾臟免疫功能的提高（P<0.05）；而升級(jí)配方奶粉有助于胸腺免疫功能的提高（P<0.05）。

2.3 不同配方嬰兒奶粉對(duì)SD 大鼠血清5-HT、5-HIAA、Trp 含量的影響

5-HT 是一種存在于人體腦和消化道中的重要胞內(nèi)信使和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，它首先由色氨酸經(jīng)色氨酸羥化酶生成5-HTP，然后經(jīng)5-羥色胺酸脫羧酶生成5-HT，5-HT 最終經(jīng)單胺氧化酶和醛脫氫酶轉(zhuǎn)化為5-羥吲哚乙酸 （5-Hydroxyindolacetic acid，5-HIAA）隨尿液排出體外。5-HT是調(diào)節(jié)神經(jīng)活動(dòng)的重要物質(zhì)，在血清和胃腸道中，5-HT 起到內(nèi)臟感覺(jué)、腸道蠕動(dòng)、上皮分泌等作用。升級(jí)配方奶粉組5-HT 含量約為普通配方組的2倍，而較空白組相比，5-HT 含量無(wú)顯著差異，表明升級(jí)配方具有促進(jìn)大鼠內(nèi)臟感覺(jué)、腸道蠕動(dòng)的潛力。5-HIAA 是5-HT 代謝終產(chǎn)物，升級(jí)配方奶粉組大鼠血清5-HIAA 含量顯著高于空白對(duì)照組和普通配方奶粉組（P<0.05）。普通配方奶粉組大鼠的血清5-HIAA 含量顯著低于空白對(duì)照組 （P<0.05）。升級(jí)配方奶粉組大鼠的血清Trp 含量最高，顯著高于普通配方奶粉組（P<0.05），而與空白對(duì)照組無(wú)顯著差異；普通配方奶粉組大鼠的血清Trp 含量顯著低于空白對(duì)照組（P<0.05）。綜上，升級(jí)配方奶粉對(duì)于提高大鼠血清5-HT 含量的效果優(yōu)于普通配方奶粉，更有利于大鼠的腸道蠕動(dòng)。

圖2 大鼠臟器指數(shù)比較Fig.2 Comparison of organ index in rats

圖3 不同嬰兒配方奶粉對(duì)SD 大鼠血清5-HT、5-HIAA、Trp 含量的影響Fig.3 Effects of different infant formula on serum contents of 5-HT，5-HIAA and Trp in SD rats

2.4 不同蛋白質(zhì)和氨基酸配方嬰兒奶粉對(duì)SD大鼠間腦5-HT、5-HIAA、Trp 含量的影響

5-HT 在大腦中的濃度也很高，主要起到調(diào)節(jié)神經(jīng)活動(dòng)的作用，5-HT4R 是5-HT 的受體之一，大腦皮層中的5-HT4R 受體與機(jī)體的學(xué)習(xí)能力和記憶能力有關(guān)，5-HT4R 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的前膜、后膜中均有表達(dá)，具有強(qiáng)化學(xué)習(xí)記憶的功能。從各組大鼠間腦組織勻漿中5-HT、5-HIAA、Trp 含量來(lái)看，對(duì)于5-HT，升級(jí)配方奶粉組大鼠的間腦組織勻漿5-HT 含量顯著高于空白對(duì)照組和普通配方奶粉組（P<0.05），約為普通配方奶粉組的2 倍，為空白對(duì)照組的1.5 倍；普通配方奶粉組大鼠的間腦組織勻漿5-HT 含量顯著低于空白對(duì)照組（P<0.05）。升級(jí)配方奶粉組大鼠的間腦組織勻漿5-HIAA 含量顯著高于空白對(duì)照組和普通配方奶粉組（P<0.05），普通配方奶粉組大鼠的間腦組織勻漿5-HIAA 含量顯著低于空白對(duì)照組（P<0.05）。各組間Trp 含量無(wú)顯著性差異（P>0.05）。由此可以說(shuō)明升級(jí)配方奶粉對(duì)提高大鼠腦組織5-HT 含量的效果優(yōu)于普通配方奶粉，更有利于提高大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育。

2.5 不同蛋白質(zhì)和氨基酸配方嬰兒奶粉對(duì)SD大鼠腸道菌群的影響

2.5.1 Alpha 多樣性分析 Alpha 多樣性可以反映微生物群落的豐度和多樣性。Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)是可用來(lái)估算樣本中微生物多樣性的指數(shù)。Shannon 指數(shù)值越大，說(shuō)明群落多樣性越高；Simpson 指數(shù)值越大，說(shuō)明群落多樣性越低。ACE 指數(shù)和Chao 指數(shù)可以用來(lái)代表菌群的豐度。Coverage 是指各樣本文庫(kù)的覆蓋率，數(shù)值越高，樣本中序列被測(cè)出的概率越高，該指數(shù)反映測(cè)序結(jié)果是否代表了樣本中微生物的真實(shí)情況。

圖4 不同嬰兒配方奶粉對(duì)SD 大鼠間腦組織5-HT、5-HIAA、Trp 含量影響Fig.4 Effects of different infant formula on the contents of 5-HT，5-HIAA and Trp in diencephalon tissue of SD rats

為研究各組大鼠腸道菌群的豐度及多樣性，對(duì)樣本進(jìn)行Alpha 多樣性分析，結(jié)果如表2所示，所有樣本的測(cè)序Coverage 指數(shù)均大于0.999，說(shuō)明盲腸內(nèi)容物樣品中的序列基本都被測(cè)出，未被檢測(cè)到的概率較低，本次測(cè)序結(jié)果可以反映樣本的真實(shí)情況。其次，通過(guò)Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)可以看出，升級(jí)配方奶粉組的SD 大鼠腸道菌群多樣性顯著高于空白對(duì)照組與普通配方奶粉組。由ACE 指數(shù)和Chao 指數(shù)可以看出，空白對(duì)照組的SD 大鼠腸道菌群豐度最高，而普通配方奶粉組與升級(jí)配方奶粉組的SD 大鼠腸道菌群豐度水平接近。

表2 各組SD 大鼠盲腸內(nèi)容物中微生物Alpha 多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity index of microorganism in cecal contents of SD rats in each group

2.5.2 Beta 多樣性分析 利用bry-curtis 的主坐標(biāo)分析法 （Principal coordinates analysis，PCoA）分析各組SD 大鼠腸道菌群β-多樣性。如圖5所示，各組SD 大鼠腸道菌群明顯存在獨(dú)立聚類，腸道群落具有顯著差異。第1 主成分為28.62%，第2主成分為18.01%。其中升級(jí)配方奶粉組沿PC1 與空白對(duì)照組的菌群組成更為接近。

圖5 不同組大鼠腸道菌群PCoA 分析Fig.5 PCoA analysis of intestinal flora of rats in different groups

2.5.3 微生物群落組成分析 為探究大鼠腸道菌群的群落組成，在門的水平上比較了各組微生物種群相對(duì)豐度，如圖6a所示，在門的水平上，優(yōu)勢(shì)菌群為厚壁菌門 （Firmicutes），放線菌門（Actinobacteriota），疣微菌門（Verrucomicrobiota）和擬桿菌門（Bacteroidota）。升級(jí)配方奶粉組的腸道菌群中厚壁菌門和擬桿菌門豐度與空白對(duì)照組相比顯著降低（P<0.05）；升級(jí)配方奶粉組的腸道菌群中放線菌門豐度與普通配方奶粉組相比顯著升高（P<0.05）；升級(jí)配方奶粉組的腸道菌群中疣微菌門豐度雖較其它兩組高，但無(wú)顯著差異（P>0.05）。

如圖6b所示，在屬水平上比較了各組微生物種群相對(duì)豐度。在屬水平上，優(yōu)勢(shì)菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus），庫(kù)特氏菌屬（Kurthia），阿克曼氏菌屬 （Akkermansia），葡萄球菌屬（Staphylococcus），氣球菌屬（Aerococcus），棒狀桿菌屬（Corynebacterium）。從圖6b 中可以看出，普通配方奶粉組的SD 大鼠腸道乳桿菌屬、氣球菌屬和棒狀桿菌屬與空白對(duì)照組相比顯著下降 （P<0.05），而飼喂升級(jí)配方奶粉可以一定程度上恢復(fù)其豐度。乳酸桿菌為人體有益菌，對(duì)人體身體健康有益；氣球菌屬和棒狀桿菌屬為條件性有害菌，通常情況下對(duì)人體有益，當(dāng)其豐度紊亂或轉(zhuǎn)移至其它器官時(shí)則會(huì)有害。圖6b 顯示，在兩種配方奶粉喂養(yǎng)后，其腸道中均出現(xiàn)了母乳喂養(yǎng)中含量極低的雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）；升級(jí)配方奶粉組的阿克曼菌屬（AKK）顯著高于空白對(duì)照組和普通配方奶粉組。研究表明，AKK 在增加癌癥免疫治療效果、降脂和降血糖上有非常顯著的作用[16]。

圖6 各組大鼠腸道菌群群落組成Fig.6 Composition of intestinal flora community of rats in each group

不同配方奶粉喂養(yǎng)的SD 大鼠與母乳喂養(yǎng)的SD 大鼠腸道菌群組成相似，而在屬的水平上，不同屬的菌群豐度差異較大。相比于普通配方奶粉，升級(jí)配方奶粉更有利于SD 大鼠腸道菌群的穩(wěn)定以及腸道的生長(zhǎng)發(fā)育。

3 討論

本文利用7日齡SD 大鼠模型來(lái)探討升級(jí)嬰幼兒配方奶粉對(duì)大鼠健康的影響。研究結(jié)果表明，飼喂升級(jí)嬰幼兒配方奶粉可以有效減輕由普通配方奶粉喂養(yǎng)導(dǎo)致的腸道菌群紊亂現(xiàn)象，提高有益菌AKK 的相對(duì)豐度，并顯著提高大鼠血清及腦組織5-HT 含量，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育及記憶認(rèn)知功能。

目前越來(lái)越多研究表明，腸道菌群對(duì)機(jī)體的神經(jīng)發(fā)育起著重要的作用[17]。在本研究中，通過(guò)16S rDNA 基因測(cè)序研究了升級(jí)配方奶粉與普通配方奶粉對(duì)幼鼠的腸道菌群影響。研究結(jié)果證明，升級(jí)配方奶粉的攝入可以調(diào)節(jié)腸道菌群菌落結(jié)構(gòu)至接近對(duì)照組水平，同時(shí)有益菌AKK 的豐度顯著增加。目前研究表明，腸道菌群與兒童神經(jīng)系統(tǒng)疾病息息相關(guān)，如注意缺陷多動(dòng)障礙（Attention deficit hyperactivity disorder，ADHD）是兒童中較為常見(jiàn)的神經(jīng)和精神發(fā)育障礙性疾病，表現(xiàn)為活動(dòng)過(guò)度、易沖動(dòng)及注意力分散的行為[18]?；純后w內(nèi)與5-HT 代謝途徑存在異常，而5-HT 與ADHD兒童的攻擊、沖動(dòng)等破壞性行為發(fā)生有關(guān)，腸道菌群組成與正常兒童具有顯著差異[19]。而腸道中的念珠菌、鏈球菌、腸球菌可產(chǎn)生5-羥色胺[11]，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，孢子菌產(chǎn)生的短鏈脂肪酸可增強(qiáng)腸道嗜鉻細(xì)胞內(nèi)5-HT 合成酶TPH1 的活性，促進(jìn)體內(nèi)5-HT 的合成[20]。本研究飼喂升級(jí)配方奶粉的大鼠在腸道菌群、血清5-HT 水平和腦組織5-HT 水平均與對(duì)照組更接近，而飼喂普通配方奶粉會(huì)引起紊亂，推測(cè)升級(jí)配方奶能通過(guò)介導(dǎo)腸道菌，恢復(fù)普通配方奶粉飼喂引起的5-HT 水平降低。升級(jí)配方奶粉雖對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)具有積極的作用，但其機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

本研究中，升級(jí)嬰兒配方奶顯著改善了大鼠的腸道菌群、提高了血清及間腦組織中5-HT 及其代謝產(chǎn)物的含量，對(duì)生命早期的腸道和神經(jīng)發(fā)育有潛在的健康益處。本文為嬰幼兒配方奶粉的設(shè)計(jì)提供了新的思路，同時(shí)有必要進(jìn)一步確定升級(jí)配方中特定活性成分在調(diào)節(jié)腸道菌群、5-HT 代謝和炎癥相關(guān)信號(hào)通路中的作用，以探討其作用機(jī)制。

4 結(jié)論

添加α-乳白蛋白和色氨酸的升級(jí)嬰兒配方奶粉，能顯著增加新生大鼠腸道有益菌的豐度，增加血清和間腦組織中5-HT 及其代謝產(chǎn)物的含量，對(duì)腸道發(fā)育和神經(jīng)發(fā)育有潛在的健康益處。