蓮房原花青素對(duì)AGEs誘導(dǎo)的小鼠腸道組織損傷和微生物紊亂的改善作用

趙擴(kuò)權(quán)，張 芬，羅 慶，馮瑩娜，歐陽(yáng)宇，肖 娟，吳 茜*

（1 湖北工業(yè)大學(xué) 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖北省工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞調(diào)控與分子藥物“111”引智基地 武漢 430068 2 海南省食品營(yíng)養(yǎng)與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海口 570228）

美拉德反應(yīng)主要發(fā)生在蛋白質(zhì)的氨基和糖的羰基之間，是一種常見的非酶促褐變反應(yīng)[1]，其產(chǎn)物復(fù)雜，包括類黑精、還原酮、含N 和S 的雜環(huán)化合物等，它們賦予食品棕色色澤，同時(shí)也賦予食品各種濃郁芳香的風(fēng)味。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，一些美拉德反應(yīng)產(chǎn)物還可以清除自由基，具有抗氧化活性[2]。其中，類黑精、還原酮等美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性甚至與食品工業(yè)中常用的抗氧化劑不相上下。在關(guān)注美拉德反應(yīng)及其產(chǎn)物的有利的一面時(shí)，也不應(yīng)忽視美拉德反應(yīng)對(duì)食品不利的一面，例如，影響食品的營(yíng)養(yǎng)性，不利于必需氨基酸或礦物元素的吸收利用，以及伴生一些有害物質(zhì)。晚期糖化終 末 產(chǎn) 物 （Advanced glycation end products，AGEs）作為美拉德反應(yīng)的主要產(chǎn)物之一，是糖類和蛋白質(zhì)、氨基酸在非酶促反應(yīng)的情況下生成的產(chǎn)物，在美拉德反應(yīng)在終期階段產(chǎn)生[3]。而熱加工方式、加工溫度和加熱時(shí)間對(duì)食物中AGEs 的生成有極大的影響。例如，加熱溫度越高，加工時(shí)間越長(zhǎng)，食物中AGEs 的含量越高[4]。人體內(nèi)的AGEs主要來(lái)源于膳食AGEs 的攝入，攝入量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于人體內(nèi)自發(fā)形成[5]。高AGEs 食物攝入導(dǎo)致人體組織內(nèi)AGEs 含量增加，造成人體腎臟等器官的損傷[6]，升高人體氧化應(yīng)激和炎癥水平[7]。大量研究表明，人體內(nèi)過多積累的AGEs 與一些人體慢性疾病的發(fā)病機(jī)理密切相關(guān)，如動(dòng)脈粥樣硬化、腎病、炎癥反應(yīng)等[8]。

原花青素（Proanthocyanidins，PC）是一大類酚類聚合物的總稱，在日常食物中廣泛存在，尤其是植物性食品中含量豐富，具有抗氧化、抗炎等生物學(xué)效益。其中，原花青素低聚體以游離態(tài)的形式存在，憑借良好的水溶性，易被人體吸收等特點(diǎn)在國(guó)內(nèi)外被廣泛關(guān)注。目前，對(duì)原花青素的開發(fā)已擴(kuò)展到多個(gè)植物品種，包括蘋果、荔枝、葡萄等水果，茄子、紫薯、紫甘藍(lán)等蔬菜，種子、果皮、堅(jiān)果、茶葉、紅酒等食品，PC 在人類的膳食中占有重要地位[9]。蓮是一種天然植物資源，在我國(guó)分布非常廣泛，在食用和藥用方面具有很高的研究?jī)r(jià)值。蓮的成熟花托（蓮房）中含有豐富的蓮房原花青素低聚體 （Lotus seedpod oligomeric procyanidins，LSOPC），其具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血脂、抗心肌缺血、抗腫瘤、抗輻射等多種生理功能[10-14]。目前LSOPC 的相關(guān)研究主要集中在食品加工過程中對(duì)AGEs 的抑制[15-17]，而對(duì)機(jī)體內(nèi)AGEs 誘導(dǎo)的組織損傷及腸道菌群紊亂的調(diào)節(jié)作用鮮見報(bào)道。

本文選用健康的雄性小鼠作為動(dòng)物模型，對(duì)小鼠體質(zhì)量、進(jìn)食及進(jìn)水情況、臟器指數(shù)、腸道的HE 病理染色情況、結(jié)腸緊密連接蛋白和寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)情況、結(jié)腸腸道內(nèi)炎癥因子及腸道菌群進(jìn)行分析，探究LSOPC 對(duì)AGEs 誘導(dǎo)的小鼠組織損傷和腸道微生物紊亂的改善作用，為開發(fā)以LSOPC 為功能因子添加劑的食品，降低AGEs 引起慢性疾病的風(fēng)險(xiǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料試劑

采摘洪湖藍(lán)田種植區(qū)“武植2 號(hào)”蓮房，去籽后按照本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)確定的原花青素提取工藝（中華人民共和國(guó)專利CN 1169804C）進(jìn)行提取[18]，得到蓮房原花青素粗提物粉末，再經(jīng)乙酸乙酯3 次萃取，冷凍干燥后得到蓮房原花青素低聚體（LSOPC）。用鹽酸正丁醇法檢測(cè)，LSOPC 中的原花青素含量相當(dāng)于葡萄籽原花青素含量的（106.22±0.46）%；用液相-質(zhì)譜聯(lián)用分析LSOPC，發(fā)現(xiàn)聚合度為3.2，在末端單元中有74.2%的兒茶素和25.8%的表兒茶素；而擴(kuò)展單位的兒茶素、表兒茶素和表沒食子兒茶素分別占26.0%，43.1%和30.9%。

吐溫-20，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇，美國(guó)Sigma 公司；DNA 試劑盒，賽默飛世爾科技有限公司；膜蛋白提取試劑盒，南京凱基生物技術(shù)有限公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒，上海索寶技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-3000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)CHRIST 公司；KQ-50B 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UV-1601 紫外-可見分光光度計(jì)，北京瑞麗分析儀器有限公司；全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀，Thermo Fisher Co；Alliance e2695 高效液相色譜儀，美國(guó)Waters 公司；Q-trap 液相質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型的建立 ICR 4 周齡雄性小鼠【SPF 級(jí)，從三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心獲得，許可證號(hào)：SCXK （鄂）2017-0012】，共36 只，體質(zhì)量為16～20 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分籠喂養(yǎng)，每籠飼養(yǎng)4～5 只。

控制的飼養(yǎng)環(huán)境條件為：溫度為21～23 ℃，濕度55%～70%，12 h 白晝循環(huán)。

適應(yīng)2 周，分為4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組隨機(jī)選擇9只。具體分組為：1）對(duì)照組（N）：以標(biāo)準(zhǔn)的AIN-93G 飼料喂食，該飼料由美國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦，廣泛應(yīng)用于嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；2）H-AGEs 組（H）：將配制好的AIN-93 飼料粉末，在150 ℃高溫條件下烘焙2 h，壓制成型，40 ℃烘干（維生素和礦物質(zhì)在烘烤結(jié)束后，粉末降至室溫再添加） 制成高AGEs AIN-93G 飼料喂養(yǎng)老鼠；3）H-AGEs+0.2%LSOPC 組（H2）：向高AGEs AIN-93G 飼料添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的LSOPC 制成飼料喂養(yǎng)老鼠；4）HAGEs+0.5% LSOPC 組 （H5）：向高AGEs AIN-93G 飼料添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的LSOPC 制成飼料喂養(yǎng)老鼠。

測(cè)定4 組飼料中的碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)、能量及總AGEs 的含量。4 組實(shí)驗(yàn)小鼠正常進(jìn)食和進(jìn)水，進(jìn)食和進(jìn)水量2 d 測(cè)定1 次，體質(zhì)量1周測(cè)定1 次，4 d 更換1 次墊料，飼養(yǎng)12 周。最后1 周，將每只老鼠單獨(dú)安置在代謝籠中，收集小鼠24 h 糞便，便于后期腸道微生物試驗(yàn)和糞便組學(xué)分析。收集的糞便立即放入無(wú)菌冷凍管內(nèi)，液氮驟冷，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。給小鼠腹腔注射水合氯醛（10%，300 mg/kg）麻醉，腹主動(dòng)脈取血（麻醉前空腹12 h），摘除脾、腎臟、肝臟、肺、心、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸，生理鹽水清洗后，再用濾紙吸干，稱重，用4%的多聚甲醛溶液浸泡十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸等部分組織，用于組織病理分析，其余組織置于-80 ℃保存。根據(jù)湖北工業(yè)大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)的規(guī)定，所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序都遵循了實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的護(hù)理和使用指南。

1.3.2 飼料AGEs 含量測(cè)定 于100 mL 離心管中加入1 g 粉末狀飼料，再加入1.2 mg/mL 的鏈霉蛋白酶E（Pronase E）溶液3 mL 溶于含5 mg/mL SDS 和1.47 mg/mL CaCl2的Tris-HCl 中，pH 7.5）。漩渦振蕩，置于搖床中40 ℃振蕩消化36 h。消化后冷卻，于4 500×g，4 ℃條件下離心10 min。取上清，0.45 μm 濾膜過濾，用PBS 稀釋到適當(dāng)濃度后，再用熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光值，激發(fā)波長(zhǎng)（λex）為347 nm，發(fā)射波長(zhǎng)（λem）為415 nm。熒光強(qiáng)度以AU/g 表示。

1.3.3 臟器指數(shù)的測(cè)定 準(zhǔn)確測(cè)定各組小鼠的臟器質(zhì)量，小鼠的臟器指數(shù)計(jì)算公式如下：

臟器指數(shù) （g/kg）=（臟器質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量）×1000

式中，臟器中腎臟的質(zhì)量為雙腎的總質(zhì)量。

1.3.4 腸道組織病理的觀察 用4%的多聚甲醛溶液將小鼠的十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸等組織固定24 h 以上，然后用梯度為75%～95%乙醇組織脫水，二甲苯清洗使組織透明。再進(jìn)行石蠟包埋，切片和烤片，二甲苯脫蠟和95%～70%乙醇脫水。用蘇木素對(duì)組織進(jìn)行5～7 min 染色，1%鹽酸酒精分化2～5 s，自來(lái)水浸洗返藍(lán)后，再用1%伊紅對(duì)組織進(jìn)行2 min 染色，染色完成后用自來(lái)水浸洗、酒精脫水和二甲苯透明后進(jìn)行鏡檢。

1.3.5 小鼠結(jié)腸組織免疫組化的測(cè)定 采用鏈霉菌抗生物素蛋白2 過氧氫化酶（Strep tavidin peroxidase，SP）免疫組化技術(shù)，測(cè)定結(jié)腸中緊密連接蛋白（ZO-1、Occludin）和寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Pept-1）在腸道黏膜上皮細(xì)胞的表達(dá)。

將結(jié)腸石蠟切片置于（65±3）℃的烤箱烘烤10 min，讓組織與切片緊密黏附；石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫苯，水化；去離子水清洗，中性PBS緩沖液平衡；切片傾泡在pH=6，濃度為0.01 mol/L的枸櫞酸鹽緩沖液，加熱使抗原修復(fù)，自然冷卻，PBS 緩沖液清洗3 次；3%過氧化氫溶液孵育15 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS 緩沖液清洗3 次，每次3 min；山羊血清工作液孵育15 min，傾去，滴加ZO-1 溶液（1∶50，體積比）或者Occludin 溶液（1∶150，體積比），4 ℃條件下過夜；恢復(fù)至室溫后PBS 緩沖液清洗3 次，每次3 min；滴加生物素化二抗工作液（IgG），在37 ℃條件下靜置15 min，用二胺基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，顯微鏡下控制顯色反應(yīng)程度，蘇木精復(fù)染40 s，再用水沖洗5 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片，鏡檢拍照，陰性對(duì)照為以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗。ZO-1，Occludin，Pept-1 蛋白均為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)的棕黃色顆粒。

1.3.6 小鼠結(jié)腸組織內(nèi)炎癥因子和黏附分子表達(dá)的測(cè)定[19]采用RT-PCR 分析小鼠結(jié)腸組織內(nèi)炎癥因子和黏附分子表達(dá)情況。

1.3.6.1 RNA 提取 向結(jié)腸組織中加入1 mL Trizol，充分勻漿。再滴加200 μL 氯仿，搖勻后室溫靜置5 min。在4 ℃條件下離心15 min，轉(zhuǎn)速為12 000 r/min，轉(zhuǎn)上層水相（約400 μL）于新1.5 mL EP 管中，再滴加400 μL 異丙醇，搖勻后靜置10 min。再次離心后棄上清，沉淀用預(yù)冷的70%無(wú)水乙醇洗3 次，空氣干燥5～10 min，復(fù)溶于20 μL DEPC 水中。分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度。

1.3.6.2 逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA 反應(yīng)體系包括RNA 3.689 μg、10 μmol/L Oligo （dT）2 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、Rnase free ddH2O 約14.5 μL。反應(yīng)條件：70 ℃5 min，短暫離心后置于冰上。再取上述反應(yīng)液14.5 μL、5×RT 緩沖液 4 μL、HRP（RRI）/RNase 抑制劑 0.5 μL、M-MLV 1 μL、Rnase free ddH2O 20 μL。反應(yīng)條件：42 ℃60 min，95 ℃5 min。

1.3.6.3 RT-PCR 引物設(shè)計(jì) RT-PCR 引物見表1，反應(yīng)體系包括10 μmol/L β-actin F 0.5 μL、10 μmol/L β-actin R 0.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、Ex Taq 0.25 μL、10×Ex Taq E 緩沖液2.5 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 約25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃4 min；94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃25 s（30 個(gè)循環(huán)）；72 ℃4 min；4 ℃4 min。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR 的引物設(shè)計(jì)Table 1 Primer sequences design for real-time PCR

1.3.7 小鼠腸道菌群的分析

1.3.7.1 糞便菌群基因組總DNA 的提取與檢測(cè)糞便樣本需置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存，提取DNA 前應(yīng)避免反復(fù)凍融。總DNA 采用試劑盒提取，用酶標(biāo)儀測(cè)定其濃度及純度，結(jié)果表明糞便樣本DNA可用于后續(xù)試驗(yàn)。為了檢測(cè)DNA 完整性，在電壓150 V 的條件下用1%瓊脂糖凝膠電泳40 min。發(fā)現(xiàn)可見基因組DNA 主條帶，符合后續(xù)PCR 試驗(yàn)要求。

1.3.7.2 16S rRNA V4 高變區(qū)PCR 擴(kuò)增及Hiseq測(cè)序 以樣本提取的總DNA 為模板，采用細(xì)菌16S rRNA V4 區(qū)通用引物 515F （GTGCCAGCMGCCGCGGTAA） 和 806R （GGACTACHVGGGTWTCTAAT） 擴(kuò)增其中的16S rRNA V4 區(qū)基因。本試驗(yàn)PCR 反應(yīng)體系為50 μL：30 ng模板DNA，4 μL 引物，25 μL PCR 預(yù)混合溶液，加ddH2O 至50 μL。PCR 擴(kuò)增條件：98 ℃條件下預(yù)變性3 min，然后98 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30 個(gè)循環(huán)，72 ℃最終延伸7 min。所得PCR 產(chǎn)物使用Agencourt AMPure XP 磁珠進(jìn)行純化，用Agilent 2100 生物分析儀和實(shí)時(shí)定量PCR 對(duì)純化后的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行定量和質(zhì)量分析。用純化后的PCR 產(chǎn)物構(gòu)建文庫(kù)，應(yīng)用Illumina Hiseq 2500 測(cè)序平臺(tái)對(duì)擴(kuò)增的16S rRNA V4高變區(qū)進(jìn)行雙末端（Paired-end）測(cè)序，再進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.3.7.3 生物信息學(xué)分析 處理原始的下機(jī)數(shù)據(jù)時(shí)，先進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾，再利用每個(gè)樣品引物的barcode 序列識(shí)別各自的序列，進(jìn)行序列拆分。使用軟件FLASH （Fast length adjustment of shortreads，v1.2.11）拼接經(jīng)過處理和過濾的序列，利用重疊關(guān)系將每個(gè)樣品雙末端測(cè)序得到的成對(duì)序列（Pair end reads）組裝成一條序列，得到最終的16S rDNA V4 高變區(qū)序列。將處理拼接后的序列通過軟件USEARCH 聚類為分類操作單元（Operational taxonomy units，OUT）。得到OTU 代表序列后，通過RDP classifer（v2.2）軟件將OTU 代表序列比對(duì)Greengene 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋，將置信度閾值設(shè)置為0.6。過濾注釋結(jié)果，確保后期分析用到的OTU 都有注釋結(jié)果，再用選出的OTU 進(jìn)行操作單元聚類分析、菌群多樣性分析、稀釋性曲線分析和菌群分類學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料成分分析

4 組實(shí)驗(yàn)組飼料的營(yíng)養(yǎng)成分及總AGEs 的含量如下表2所示。4 組飼料在碳水化合物含量、脂肪、蛋白質(zhì)以及熱量方面均沒有顯著差異，排除因?yàn)轱暳蠣I(yíng)養(yǎng)成分不同對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的影響。AIN-93G 飼料經(jīng)過高溫加熱以后，AGEs 的含量顯著提高（P<0.05），H-AGEs 組中總AGEs 的含量約為對(duì)照組的3.7 倍。研究表明，影響食物中AGEs 增加的因素有很多，如加熱溫度、加工時(shí)間、加工方式、pH 值及食物組成成分等。其中，加熱時(shí)間和加工方式尤為重要，它能增加食物中AGEs的含量，促進(jìn)食物中的糖氧化和脂質(zhì)氧化[20]。

表2 飼料成分分析Table 2 Feed composition analysis

2.2 LSOPC 對(duì)不同組別小鼠進(jìn)食、進(jìn)水量和體質(zhì)量的影響

小鼠實(shí)驗(yàn)周期中進(jìn)食、進(jìn)水量及體質(zhì)量變化是反應(yīng)生物學(xué)特征指標(biāo)[21]。健康小鼠分別喂食4組飼料12 周后，分析不同組別小鼠的進(jìn)食、進(jìn)水量及體質(zhì)量變化。如表3所示，喂食期間，進(jìn)食和進(jìn)水量呈動(dòng)態(tài)波動(dòng)趨勢(shì)。第2 周到第10 周，HAGEs 實(shí)驗(yàn)組小鼠每日進(jìn)食和進(jìn)水量整體上低于其它組別，且差異顯著（P<0.05）。加入LSOPC 后進(jìn)食量有所改善，0.5% LSOPC 添加量組的改善效果好于0.2% LSOPC 添加量組，和正常組相當(dāng)。高AGEs AIN-93G 飼料的口感可能不如標(biāo)準(zhǔn)的AIN-93G 飼料口感，進(jìn)而影響了進(jìn)食，其進(jìn)食量低于其它3 組，而LSOPC 的添加，改善了高AGEs AIN-93G 飼料的風(fēng)味，使得小鼠的進(jìn)食量提高。然而，第10 周到第12 周，與對(duì)照組相比，另外3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)食量并無(wú)顯著性差異（P>0.05）。

圖1 4 種飼料形態(tài)Fig.1 The pictures of four feeds

表3 進(jìn)食量和進(jìn)水量Table 3 Food intake and water intake

圖2所示，小鼠的體質(zhì)量隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的增加而增加，對(duì)照組小鼠的體質(zhì)量在實(shí)驗(yàn)過程中均大于其它組別。從第5 周開始，組間差異顯著（P<0.05），從第9 周開始，與前8 周相比，對(duì)照組小鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)極其明顯（P<0.01），遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于同期其它實(shí)驗(yàn)組，與進(jìn)食量和進(jìn)水量的量呈正相關(guān)關(guān)系。而H-AGEs、H-AGEs+0.2% LSOPC、H-AGEs+0.5% LSOPC 3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠的體質(zhì)量差異不顯著，由于LSOPC 的添加使得小鼠的進(jìn)食和進(jìn)水量都高于H-AGEs 組，然而體重并無(wú)顯著差異，表明LSOPC 對(duì)于小鼠體質(zhì)量控制有一定程度的影響，這與王勇[22]在原花青素對(duì)肥胖小鼠脂解作用和機(jī)制中的研究結(jié)果一致。

圖2 飼養(yǎng)過程中4 組小鼠的體質(zhì)量變化情況Fig.2 Weight changes of mice in four groups during feeding

2.3 LSOPC 對(duì)不同組別小鼠臟器指數(shù)的影響

動(dòng)物的臟器指數(shù)是評(píng)價(jià)其在實(shí)驗(yàn)階段的生物學(xué)特征指標(biāo)之一[23]。正常小鼠體質(zhì)量與臟器的比值，即臟器指數(shù)值較為恒定，而臟器指數(shù)的波動(dòng)往往反應(yīng)動(dòng)物機(jī)體的變化。各實(shí)驗(yàn)組小鼠的臟器指數(shù)如表4所示：與對(duì)照組相比，除肺臟外，HAGEs、H-AGEs+0.2% LSOPC、H-AGEs+0.5%LSOPC 3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠的心臟、肝臟、脾臟和腎臟的臟器指數(shù)均大于正常組。H-AGEs 組小鼠各器官臟器指數(shù)最大，其中脾臟的臟器指數(shù)約為其它組別的2 倍，且差異顯著（P<0.05）。隨著LSOPC的 添加，與H-AGEs 組相比，H-AGEs+0.2%LSOPC 和H-AGEs+0.5% LSOPC 實(shí)驗(yàn)組器官的臟器指數(shù)均降低，且臟器指數(shù)與LSOPC 的添加量呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），表明H-AGEs 飼料的攝入導(dǎo)致小鼠臟器指數(shù)增大，而臟器指數(shù)的增加也反映出小鼠在實(shí)驗(yàn)過程中可能出現(xiàn)臟器充血、水腫或者肥大增生等健康問題[24]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示LSOPC作為一種外源抗氧化劑的攝入能改善小鼠生長(zhǎng)過程中器官的損傷。

表4 小鼠臟器指數(shù)Table 4 Organ indexs of mice

2.4 小鼠腸道組織切片HE 染色分析

飼養(yǎng)12 周，通過檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組小鼠腸道組織的病變情況，發(fā)現(xiàn)攝入H-AGEs 飼料小鼠胃腸組織均出現(xiàn)不同程度的脂肪滴積累和病變，部分組織內(nèi)部產(chǎn)生炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。而在H-AGEs 飼料中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)LOSPC，能很大程度上降低小鼠的腸道組織表面的脂肪滴富集，減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，對(duì)小鼠胃腸組織病變有很好的改善作用。

2.5 小鼠結(jié)腸內(nèi)免疫組化分析

AGEs 分為游離態(tài)和結(jié)合態(tài)（肽結(jié)合態(tài)和蛋白結(jié)合態(tài)）兩種類型。其中，游離態(tài)AGEs 的吸收與腸細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1 和Occludin 的表達(dá)密切相關(guān)，ZO-1 和Occludin 的表達(dá)越高則游離態(tài)AGEs 的吸收越低。寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pept-1 的表達(dá)量越高則結(jié)合態(tài)AGEs 的吸收量越高[25]。如圖4所示，與對(duì)照組相比，H-AGEs 組ZO-1 蛋白表達(dá)量顯著降低（P<0.05），向H-AGEs 組中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)LSOPC，H-AGEs+0.2% LSOPC 和HAGEs+0.5% LSOPC 組ZO-1 的表達(dá)量均有提高，且表達(dá)量與添加LSOPC 質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)；Occludin 在對(duì)照組的表達(dá)量最大，與H-AGEs 和HAGEs+0.2% LSOPC 組相比，差異顯著（P<0.05），而飼料中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)LSOPC 喂養(yǎng)的小鼠，結(jié)腸組織內(nèi)Occludin 表達(dá)量均有顯著增加 （P<0.05）；Pept1 蛋白表達(dá)量在H-AGEs 組最大，在對(duì)照組小鼠結(jié)腸的表達(dá)量較少，LSOPC 的添加量與Pept-1 的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。

圖3 小鼠腸道組織HE 染色結(jié)果Fig.3 HE staining results of mice gastrointestinal tissues

圖4 小鼠結(jié)腸組織免疫組化結(jié)果Fig.4 Immunohistochemical results of mice colon tissue

2.6 小鼠結(jié)腸組織內(nèi)炎癥反應(yīng)分析

膳食AGEs 的攝入，使得機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化水平增加，加劇了自由基鏈反應(yīng)，導(dǎo)致體內(nèi)促炎因子的釋放[26]。研究表明，腸道內(nèi)AGEs的累計(jì)會(huì)導(dǎo)致炎癥性腸病患者的炎癥反應(yīng)[27]。如圖5所示，與對(duì)照組相比，3 組攝入H-AGEs 的實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸內(nèi)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)量均顯著增加（P<0.05），其中H-AGEs 組小鼠結(jié)腸內(nèi)TNF-α 表達(dá)量約為對(duì)照組的4.5 倍，IL-6 的表達(dá)量約為對(duì)照組的5.5 倍。不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)LSOPC 的添加，均能改善小鼠結(jié)腸內(nèi)炎癥水平，且改善效果與LSOPC添加量呈正相關(guān)，與H-AGEs 組小鼠相比，0.2%LSOPC 的添加使小鼠結(jié)腸內(nèi)TNF-α 和IL-6 的表達(dá)量分別下降了36.17%和40.86%（P>0.05），而0.5% LSOPC 的添加使結(jié)腸內(nèi)TNF-α 和IL-6 的表達(dá)量分別下降了59.87%和54.86%（P>0.05）。膳食中AGEs 的攝入，上調(diào)了結(jié)腸內(nèi)炎癥細(xì)胞因子水平，減弱了腸道內(nèi)抗氧化的防御，刺激了小鼠結(jié)腸內(nèi)的炎癥反應(yīng)。血管細(xì)胞黏附因子（VCAM-1）和細(xì)胞間黏附因子（ICAM-1）在促進(jìn)炎癥部位的黏附性和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)中起重要作用，影響小鼠結(jié)腸內(nèi)炎癥反應(yīng)。H-AGEs 組小鼠體內(nèi)的VCAM-1 和ICAM-1 的表達(dá)量均大于對(duì)照組組（P<0.05），而LSOPC 的添加，能下調(diào)小鼠結(jié)腸內(nèi)VCAM-1 和ICAM-1 的表達(dá)量，且與LSOPC 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。

圖5 小鼠結(jié)腸炎癥因子表達(dá)情況Fig.5 Expression of inflammatory factors in mice colon

2.7 小鼠腸道微生物的Alpha 多樣性分析

Alpha 多樣性采用稀釋曲線（Rarefaction curve）和香農(nóng)指數(shù)曲線（Shannon Index）來(lái)分析，Shannon 和Simpson 指數(shù)反映了物種的豐富度，Chao1 和ACE 指數(shù)反應(yīng)了物種數(shù)量的多少[28]。隨著隨機(jī)抽取的序列條數(shù)的增加，持續(xù)抽樣下新物種出現(xiàn)的速率急劇上升，表明群落中有大量的新物種被發(fā)現(xiàn)。如圖6所示，4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組的稀釋性曲線和香農(nóng)指數(shù)曲線基本持平，說明4 個(gè)分組的樣品中大部分的腸道菌群微生物已被發(fā)現(xiàn)。對(duì)照組OTU 數(shù)量明顯大于其它3 個(gè)組，說明當(dāng)測(cè)定序列條數(shù)充分的情況下，隨著測(cè)序數(shù)量的增加，對(duì)照組中樣品物種的豐富和均勻度最大。兩者結(jié)合得出，抽樣條件充分，可用于數(shù)據(jù)分析。與H-AGEs 組相比，對(duì)照組和添加LSOPC 組Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)、Chao1 指數(shù)和ACE 指數(shù)都較高（P<0.05），說明這3 組小鼠腸道微生物的種類和數(shù)量都更多。這表明LSOPC 的添加，能增加腸道微生物種類的均勻性和多樣性。

圖6 小鼠腸道微生物Alpha 多樣性分析Fig.6 Analysis of Alpha diversity of intestinal microorganisms in mice

2.8 小鼠腸道微生物的Beta 多樣性分析

在UniFrac 距離未加權(quán)與加權(quán)的基礎(chǔ)上，圖7中PCoA 圖（a～f）直觀的顯示了4 個(gè)分組中的微生物群的結(jié)構(gòu)差異[29]。4 個(gè)組別中的差別明顯分離，且4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組別中，33.15%和48.63%的變化由PC1 解釋，17.80%和21.94%的變化由PC2 解釋，10.58%和15.22%的變化由PC3 解釋?；赨PGMA 構(gòu)建的聚類樹（g）顯示了AGEs 依賴性的結(jié)構(gòu)重排，H-AGEs+0.5% LSOPC，H-AGEs+0.2%LSOPC，H-AGEs 和對(duì)照組4 個(gè)分組中的小鼠完全聚集在各自的組中，相同分組內(nèi)不同平行組間物種組成相似度較高。UPGMA 構(gòu)建的聚類樹顯示，3 組小鼠糞便內(nèi)的生物菌群明顯區(qū)別于HAGEs。H-AGEs+0.5% LSOPC 組內(nèi)物種相似匹配度與對(duì)照組較高，說明高質(zhì)量分?jǐn)?shù)LSOPC 的添加，對(duì)小鼠糞便內(nèi)生物菌群的物種改善效果明顯。

圖7 小鼠腸道微生物的Beta 多樣性分析Fig.7 Analysis of Beta diversity of intestinal microorganisms in mice

2.9 小鼠腸道微生物物種注釋及分類學(xué)分析

正常人群的腸道微生物主要有厚壁菌門，擬桿菌門，變形菌門，梭桿菌門和放線菌門。如圖8所示，對(duì)照組的腸道微生物主要是擬桿菌門和厚壁菌門，且厚壁菌門與擬桿菌門的比值約為1.00，其次為變形菌門，放線菌門及梭桿菌門所占比例較少。4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，H-AGEs 組厚壁菌門所占比例最大，厚壁菌門與擬桿菌門的比值約為1.50。隨著不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)LSOPC 的添加，厚壁菌門相對(duì)豐度下降，擬桿菌門相對(duì)豐度增加，H-AGEs+0.2%LSOPC 組厚壁菌門與擬桿菌門的比值約為1.41，H-AGEs+0.5% LSOPC 組厚壁菌門與擬桿菌門的比值則下降到1.14。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，厚壁菌門在腸道微生物中主要產(chǎn)丁酸[30]，LSOPC 可降低腸道微生物產(chǎn)生的丁酸含量，這一結(jié)果可能與該組厚壁門菌占比減少有關(guān)。同時(shí)，這一結(jié)果也間接表明，腸道微生物可能是LSOPC 的靶點(diǎn)之一。

圖8 小鼠腸道微生物生物物種注釋及分類學(xué)分析Fig.8 Annotation and taxonomic analysis of intestinal microflora of mice

3 結(jié)論

本研究以健康小鼠為模型，比較不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)LSOPC 對(duì)攝入膳食AGEs 后的小鼠體質(zhì)量、腸道組織以及腸道菌群的影響。結(jié)果顯示，H-AGEs飼料的攝入導(dǎo)致小鼠臟器指數(shù)增大，LSOPC 作為一種外源抗氧化劑的攝入能改善小鼠生長(zhǎng)過程中器官的損傷；攝入H-AGEs 飼料小鼠腸道組織均出現(xiàn)不同程度的脂肪滴積累和病變，部分組織內(nèi)部產(chǎn)生炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)LSOPC，能很大程度上降低小鼠的胃腸組織表面的脂肪滴富集，減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，對(duì)小鼠腸道組織病變有很好的改善作用；膳食AGEs 的攝入，增加了小鼠結(jié)腸內(nèi)炎癥細(xì)胞因子水平，減弱了腸道內(nèi)抗氧化的防御，刺激了小鼠結(jié)腸內(nèi)的炎癥反應(yīng)，LSOPC 的添加，能改善小鼠結(jié)腸炎癥疾病，且與LSOPC 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)（P<0.05）；膳食AGEs 的攝入能夠?qū)е履c道菌群的紊亂，LSOPC 的添加，能提高小鼠腸道微生物多樣性，厚壁門菌占比減少，改善小鼠腸道菌群的紊亂現(xiàn)象，且與LSOPC 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)（P<0.05）。研究結(jié)果為開發(fā)以LSOPC 為基礎(chǔ)的膳食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑改善AGEs 引起的慢性疾病提供支撐。