硫醚類香料對(duì)金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的抑制作用

許宇航，王 巖，畢景然，侯紅漫，郝洪順，張公亮

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 遼寧大連 116034）

近年來(lái)，由于天然香料的分離技術(shù)不斷地改進(jìn)，天然香料在市場(chǎng)中的比例逐漸增加，其中含硫香料在食品香料和食品添加劑中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[1]。含硫香料作為一種安全、無(wú)毒的天然香料，在美國(guó)食品香料和萃取物制造協(xié)會(huì)（FEMA）公布的一些安全性物質(zhì)中，也占了很大的比例[2]。硫醚香料作為含硫香料中的代表，主要來(lái)源于大蒜素[3-4]。目前，對(duì)于硫醚類香料的抑菌構(gòu)效研究較少，多用于抗癌的研究，一般通過(guò)干擾細(xì)胞周期來(lái)誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡[5]。

金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌是食品中最常見(jiàn)的兩種革蘭氏陽(yáng)性致病菌。金黃色葡萄球菌是多種臨床感染的病原菌，它能夠引發(fā)菌血癥、感染性心內(nèi)膜炎和骨關(guān)節(jié)感染，以及皮膚和軟組織感染和化靜膿腫形成[6-7]。單增李斯特菌可以進(jìn)入人和動(dòng)物的腸道，進(jìn)而引起腦膜炎等疾病，感染人群主要集中于免疫力低下的人群，如孕婦、老人和新生兒等[8-9]。尋找一種新型、有效，可應(yīng)用于食品行業(yè)的抑制劑，來(lái)控制食源性致病菌的傳播和感染具有重要的研究意義。

耐熱核酸酶與金黃色葡萄球菌侵染宿主細(xì)胞的能力有著重要關(guān)系，直接影響它的毒性，由nuc基因編碼，它的存在能夠增強(qiáng)細(xì)菌侵襲能力，同時(shí)耐熱核酸酶也是檢測(cè)金黃色葡萄球菌污染食品的重要特征標(biāo)志[10-11]。本研究選取10 種硫醚類香料，通過(guò)測(cè)量抑菌圈的直徑來(lái)比較和判斷它們的抑菌效果，并討論硫醚香料的結(jié)構(gòu)與其抑菌能力的關(guān)系。同時(shí)也篩選出抑菌能力最強(qiáng)的硫醚類香料，研究其對(duì)金黃色葡萄球菌nuc 基因表達(dá)量的影響，為硫醚類香料作為食源性致病菌的抑制劑在食品行業(yè)中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究根據(jù)GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[12]選取了10 種硫醚類香料，均從美國(guó)Sigma 公司訂購(gòu)。名稱及結(jié)構(gòu)見(jiàn)表1。

表1 10 種硫醚類香料的名稱及結(jié)構(gòu)Table 1 Name and structure of ten kinds of sulfide flavors

金黃色葡萄球菌ATCC 6538、單增李斯特菌ATCC 19115 取自大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

RNAprep pure 培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA 提取試劑盒，天根生化科技 （北京） 有限公司；SYBRRPremix Ex TaqTM、Random primers[pd（N）6]、Reverse Transcriptase M-MLV （RNase H-）、5×MMLV Buffer、dNTP Mixture、Recombinant RNase Inhibitor，寶生物工程（大連）有限公司；RNase-free water、熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）引物，生工生物工程（上海）股份有限公司；胰蛋白胨、酵母浸粉、氯化鈉、瓊脂粉、大豆蛋白胨、磷酸二氫鉀、葡萄糖（分析純級(jí)），大連博諾生物化學(xué)試劑公司；無(wú)水乙醇（分析純級(jí)），沈陽(yáng)力誠(chéng)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

FA（A）型電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器公司；01J2003-04 型高壓滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；ZHWY-1008 型恒溫培養(yǎng)振蕩器、ZHWY-2102C 型雙層小容量全溫度恒溫?fù)u床，上海智城分析儀器制造有限公司；DRP-9162 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UV-1750 型紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)，日本津島儀器有限公司；MyiQTM2 型熒光定量PCR 儀，美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.3 方法

1.3.1 硫醚香料的處理 選擇乙醇作為硫醚類香料的溶劑，所需原液和無(wú)水乙醇的體積可按如下公式計(jì)算出，稀釋至適當(dāng)濃度后，置于4 ℃冰箱密封備用。

式中，c——稀釋的硫醚類香料的濃度，mol/L；ρ——硫醚類香料的密度，g/mL；V1——硫醚類香料的體積，L；M——硫醚類香料的摩爾質(zhì)量，g/mol；V2——無(wú)水乙醇的體積，L。

1.3.2 培養(yǎng)基的制備 金黃色葡萄球菌用溶菌肉湯（Lysogeny broth，LB 培養(yǎng)基）培養(yǎng)，每配置100 mL 培養(yǎng)基需要添加1 g 胰蛋白胨、0.5 g 酵母浸粉和1 g 氯化鈉，用100 mL 去離子水將其混勻后，調(diào)節(jié)pH 值至7.0，在121 ℃下滅菌20 min。

單增李斯特菌用胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)，每配置100 mL 培養(yǎng)基需要添加1.7 g 胰蛋白胨、大豆蛋白胨0.3 g、氯化鈉0.5 g、磷酸二氫鉀0.25 g、葡萄糖0.25 g，最后用100 mL 去離子水將其混勻后，調(diào)節(jié)pH 值至（7.3±0.2），在121 ℃下滅菌20 min。

在配制固體培養(yǎng)基時(shí)，都需要向兩種培養(yǎng)基中添加1.5 g/100 mL 的瓊脂粉。

1.3.3 菌種的活化及培養(yǎng) 取-80 ℃冰箱中凍存的菌液100 μL 于100 mL 的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行第1 次傳代，在37 ℃下震蕩培養(yǎng)24 h 后，在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行第2 次傳代，在37 ℃恒溫箱培養(yǎng)12 h后，挑取單菌落至液體培養(yǎng)基并在37 ℃下震蕩培養(yǎng)12 h。配制無(wú)菌的生理鹽水并用其將上述得到的菌液稀釋至107CFU/mL，保存于4 ℃冰箱中備用。

1.3.4 抑菌圈的測(cè)定 抑菌圈的測(cè)定采用了濾紙片法[13-14]。取100 μL 上述被稀釋后的菌液于固體培養(yǎng)基上，用玻璃珠搖勻，使菌液能夠均勻地分布在整個(gè)固體培養(yǎng)基上，將準(zhǔn)備好的無(wú)菌直徑為1 cm 的濾紙片放置平板中央，添加6 μL 濃度為5 mol/L 的硫醚類香料于濾紙片上，最后將固體培養(yǎng)基放置于37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。每種硫醚類香料進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，最終結(jié)果取平均值。

1.3.5 最低抑菌濃度的測(cè)定 根據(jù)1.3.4 節(jié)試驗(yàn)結(jié)果選取抑菌效果最好的硫醚類香料作為研究對(duì)象，用二倍稀釋法測(cè)定它的最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）。用60%的乙醇水溶液將5 mol/L 的硫醚類香料進(jìn)行2 倍稀釋，分別為2.5，1.25，0.625，0.3125 mol/L 以 及0.15625 mol/L。精確量取0.1 mL 菌液添加至0.8 mL 的液體培養(yǎng)基中，再將0.1 mL 不同濃度的硫醚類香料分別添加至液體培養(yǎng)基中，震蕩混勻之后，在37 ℃下培養(yǎng)24 h。再取培養(yǎng)完之后的菌液100 μL 接種于固體培養(yǎng)基中，用玻璃珠震蕩混勻后，在37 ℃下培養(yǎng)24 h[15]。最后觀察固體培養(yǎng)基上是否有菌生長(zhǎng)，并且以無(wú)菌生長(zhǎng)的硫醚類香料的最低濃度為MIC。每個(gè)濃度做3 次平行試驗(yàn)，最終結(jié)果取平均值。

1.3.6 硫醚類香料對(duì)生長(zhǎng)曲線的影響 根據(jù)1.3.4節(jié)和1.3.5 節(jié)結(jié)果，將抑菌能力最強(qiáng)的硫醚類香料稀釋至亞抑菌濃度1/16MIC、1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC 和MIC。先取1 mL 的菌液于99 mL 的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再將0.1 mL 各亞抑菌濃度下的硫醚類香料分別滴加到液體培養(yǎng)基中，以僅添加0.1 mL 無(wú)水乙醇的菌液為對(duì)照組，37 ℃下震蕩培養(yǎng)24 h，并且每隔2 h 測(cè)一次菌液在波長(zhǎng)600 nm 下的吸光度值，以吸光度值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制供試菌的生長(zhǎng)曲線。

1.3.7 RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR 在液體培養(yǎng)基中添加各亞抑菌濃度的硫醚類香料，以未添加硫醚香料的為對(duì)照組，培養(yǎng)12 h 后，取適量的菌液，按照RNA 試劑盒的說(shuō)明書(shū)提取RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA 即可[16-17]。nuc 基因引物：上游5'-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3'、下游5'-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3'[18]；16S rRNA 內(nèi)參基因引物：上游5'-GCTGCCCTTTGTATTGTC-3'、下游5'-AGATGTTGGGTTAAGTCCC-3'[19]。最后在65～90 ℃的范圍內(nèi)建立熔解曲線，采用方程法2-ΔΔCT來(lái)確定基因的相對(duì)表達(dá)量[20]。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

所有的數(shù)據(jù)都以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，并均用SPSS 軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫醚類香料對(duì)金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的抑制效果

將各硫醚類香料都稀釋至5 mol/L，在此濃度下對(duì)金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的抑制效果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，在10 種硫醚類香料中，有9 種抑制了金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，有7 種抑制了單增李斯特菌的生長(zhǎng)，說(shuō)明單增李斯特菌對(duì)硫醚類香料不如金黃色葡萄球菌敏感，其中DMTS、DADS、DAS、MMTF、MFDS、FIPDS 對(duì)金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌均有抑制作用，MPDS、DPDS和BMFDS 只對(duì)金黃色葡萄球有抑制作用。

表2 10 種硫醚類香料抑制作用Table 2 The inhibitory effect of ten kinds of isulfide flavors

2.2 硫醚類香料的抑菌作用

選取具有抑菌能力的硫醚類香料進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，得到的抑菌圈結(jié)果如圖1所示。在圖1a 中，9種硫醚類香料對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用各不相同，抑菌能力依次為：BMFDS≈DADS＞MFDS≈DAS ＞FIPDS ≈MMTF ＞DMTS ≈MPDS ≈DPDS。BMFDS 和DADS 有顯著的抑菌效果，抑菌圈直徑分別達(dá)到（2.83±0.21）cm 和（2.46±0.35）cm。在圖1b 中，7 種有抑菌作用的硫醚類香料對(duì)單增李斯特菌的抑菌能力為：DADS ＞MFDS ＞MMFDS ≈MMT F≈FIPDS＞DAS≈DMTS，其中DADS 有最強(qiáng)的抑菌效果，抑菌圈直徑為（1.98±0.22）cm。

圖1 硫醚類香料對(duì)金黃色葡萄球菌（a）和單增李斯特菌（b）的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of sulfide flavors on Staphylococcus aureus （a） and Listeria monocytogenes （b）

MPDS 和DADS 雖然含有相同數(shù)目的硫原子，但是側(cè)鏈不一樣，MPDS 的-S-S-兩側(cè)連接的基團(tuán)是甲基和丙基，DADS 是烯丙基，DADS 對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果比MPDS 強(qiáng) （P＜0.05），并且根據(jù)2.1 節(jié)得出MPDS 對(duì)單增李斯特菌無(wú)明顯抑制作用，可以推測(cè)出由于DADS 的側(cè)鏈中烯丙基或是雙鍵的存在，增強(qiáng)了硫醚類香料的抑菌活性。這與前期研究[21]含有雙鍵可能會(huì)影響二硫醚類化合物的抑制效果，存在二烯丙基的單硫醚化合物會(huì)有很好的抑制效果的結(jié)論相似。

DADS 和DAS 雖具有相同的側(cè)鏈烯丙基，但是前者擁有的硫原子多于后者，DADS 中有2 個(gè)硫原子形成了二硫鍵。從圖1結(jié)果可以看出，DADS 對(duì)金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的抑制能力均強(qiáng)于DAS（P＜0.05），可見(jiàn)對(duì)于結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的對(duì)稱型硫醚類香料，側(cè)鏈的基團(tuán)相同，隨著所含硫原子數(shù)目的增多，抑菌能力增強(qiáng)。

MMFDS 和MFDS 是同分異構(gòu)體，它們的分子式都是C6H8OS2，MMFDS 二硫鍵連接著呋喃基，MFDS 連接的基團(tuán)是糠基，MFDS 對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果更強(qiáng)，而MMFDS 無(wú)抑菌作用，顯示出對(duì)于MMFDS 和MFDS，含有糠基的硫醚類香料的抑菌效果比呋喃基強(qiáng)。對(duì)于MMFDS 和MMTF，兩者所含的硫原子數(shù)目不一樣，側(cè)鏈所含的基團(tuán)相同，對(duì)于單增李斯特菌，兩者的抑菌效果無(wú)明顯差異（P＞0.05），說(shuō)明如果硫醚類香料的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，所含有硫原子數(shù)目的多少對(duì)其抑制作用沒(méi)有太大的影響。

由此可見(jiàn)，硫醚類香料的結(jié)構(gòu)對(duì)于它們的抑菌活性有著重要的影響，硫原子的數(shù)量和側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)在很大程度上決定了它們的抑菌能力，這一結(jié)論與前期研究含氧硫醚類香料的抑菌作用的結(jié)論類似[22]。根據(jù)本研究的結(jié)果可以看出，DADS 由于硫原子的數(shù)目多和側(cè)鏈上帶有烯丙基的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致了它的抑菌能力明顯強(qiáng)于其它的硫醚類香料。與此結(jié)論類似的是，有研究表明異硫氰酸酯類含硫香料由于它們側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)不同，同樣導(dǎo)致了它們對(duì)金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的抑制效果不同，側(cè)鏈上的苯基能夠大幅度提高異硫氰酸酯類香料的抑菌效果[23]。

2.3 DADS 對(duì)金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的MIC

選取對(duì)金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌抑菌效果最好的DADS 作為研究對(duì)象，測(cè)定其MIC，結(jié)果見(jiàn)表3。當(dāng)DADS 的濃度大于或者等于1.25 mol/L 時(shí)，兩種菌都無(wú)法生長(zhǎng)，該濃度的DADS 對(duì)這兩種革蘭氏陽(yáng)性致病菌都有著很強(qiáng)的抑制作用。當(dāng)DADS 的濃度低于1.25 mol/L 時(shí)，可以觀察到單增李斯特菌能生長(zhǎng)，因此，單增李斯特菌的MIC 為1.25 mol/L；當(dāng)DADS 的濃度低于0.3125 mol/L 時(shí)，可以觀察到金黃色葡萄球菌能生長(zhǎng)，因此，金黃色葡萄球菌的MIC 為0.3125 mol/L。

表3 DADS 對(duì)兩種革蘭氏陽(yáng)性致病菌的MICTable 3 MIC of DADS against two Gram-positive pathogens

2.4 DADS 對(duì)兩種革蘭氏陽(yáng)性致病菌生長(zhǎng)曲線的影響

在亞抑菌濃度下的DADS 對(duì)兩種革蘭氏陽(yáng)性菌正在曲線的影響見(jiàn)圖2。當(dāng)DADS 的濃度在1/16MIC 和1/8MIC 時(shí)，金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的生長(zhǎng)并沒(méi)有受到明顯的影響，它們的生長(zhǎng)曲線與對(duì)照組幾乎一致；當(dāng)DADS 的濃度提高到1/4MIC 時(shí)，此時(shí)能夠觀察到兩種菌的生長(zhǎng)開(kāi)始受到抑制，只是在該濃度下，DADS 對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用并不明顯，而該濃度的DADS 對(duì)單增李斯特菌已經(jīng)有了相當(dāng)明顯的抑制效果，當(dāng)進(jìn)入穩(wěn)定期后，OD600nm的值僅有對(duì)照組的一半，菌液的密度已經(jīng)大幅度減少；當(dāng)DADS 的濃度提高到1/2MIC 時(shí)，此時(shí)兩種革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)均受到了明顯的抑制；當(dāng)DADS 的濃度繼續(xù)提高至MIC 時(shí)，可以看到兩種菌幾乎停止了生長(zhǎng)。由此可見(jiàn)，DADS 的濃度在1/16MIC～MIC 時(shí)，它對(duì)金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的抑制作用都具有濃度依賴性。與此結(jié)論類似的是，DADS 對(duì)大腸桿菌的抑制同樣具有濃度依耐性[24]。

圖2 DADS 對(duì)金黃色葡萄球菌（a）和單增李斯特菌（b）生長(zhǎng)曲線的影響Fig.2 Effect of DADS on the growth curve of Staphylococcus aureus （a） and Listeria monocytogenes （b）

2.5 DADS 對(duì)金黃色葡萄球菌毒力基因nuc 表達(dá)的影響

如圖3所示，與未添加DADS 的對(duì)照組相比，添加不同亞抑菌濃度的DADS 后，毒力基因nuc的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）。DADS 的亞抑菌濃度由1/64MIC、1/32MIC、1/16MIC、1/8MIC 增加至1/4MIC，與未添加DADS 相比，nuc 的相對(duì)表達(dá)水平分別為77.08%，57.59%，48.7%，28.29%和15.22%。結(jié)果表明：逐漸增加DADS 的濃度，nuc基因的相對(duì)表達(dá)水平逐漸降低，即DADS 濃度增加，對(duì)nuc 基因的抑制作用增強(qiáng)，具有明顯的濃度依耐性。與本研究結(jié)論類似的是，有研究表明大蒜素同樣以一種劑量依賴性的方式來(lái)抑制金黃色葡萄球菌hla 基因的表達(dá)水平，而大蒜素的主要成分就是二烯丙基二硫醚等硫醚類香料[19]。也有研究表明，DADS 對(duì)單增李斯特菌毒力基因inlA、hylA 和prfA 的表達(dá)水平也具有一定的抑制作用，并且也呈濃度依耐性[25]。DADS 對(duì)大腸桿菌的毒力基因同樣也存在著抑制作用，隨著DADS 的濃度提升，大腸桿菌的毒力基因的表達(dá)水平逐漸降低[24]。綜合來(lái)看，DADS 對(duì)食源性致病菌的毒力基因的表達(dá)具有很強(qiáng)的抑制作用，隨著濃度的提升，對(duì)其表達(dá)水平的抑制也增強(qiáng)，具有濃度依耐性。將DADS 與其它含硫香料相比較，在周倩倩等[26]的研究中，異硫氰酸芐酯（Benzyl isothiocyanate，BITC） 的濃度為1/4MIC 時(shí)，此時(shí)副溶血弧菌tdh基因的表達(dá)水平相比于對(duì)照組降低了4.8 倍，與本研究結(jié)果相類似，可見(jiàn)硫醚類香料和異硫氰酸酯類香料對(duì)于食源性致病菌毒力基因的表達(dá)均有著很強(qiáng)的抑制能力。

圖3 二烯丙基二硫醚對(duì)nuc 基因表達(dá)的影響Fig.3 Effects of diallyl disulfide on expression of nuc gene

3 結(jié)論

在本研究選取的10 種硫醚類香料中，DADS、MFDS 和DAS 均對(duì)金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌有著不錯(cuò)的抑制效果，其中抑制能力最強(qiáng)的是DADS，原因可能是DADS 側(cè)鏈中烯丙基的存在以及硫原子的數(shù)目較多，從而增強(qiáng)了硫醚類香料對(duì)這兩種革蘭氏陽(yáng)性致病菌的抑制能力。DADS 對(duì)金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的MIC 分別為0.3125 mol/L 和1.25 mol/L。DADS 對(duì)兩種菌的抑制作用均呈現(xiàn)濃度依賴性。DADS 在亞抑菌濃度下同樣以濃度依賴性的方式降低了金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因nuc 的表達(dá)水平。