秘魯魷魚肌動(dòng)蛋白的分離純化及結(jié)構(gòu)初探

牛付閣，胡得妹，張秀真，杜藝軒，張 斌，馬 爽，潘偉春

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 杭州 310018）

秘魯魷魚產(chǎn)量豐富，物美價(jià)廉，特別是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。含有8 種人體必需氨基酸，且魚肉中的微量元素具有高鉀低鈉的特點(diǎn)，這些特點(diǎn)足以讓人們把目光聚焦在魷魚上，魷魚也因此成為銷量逐年上升的海產(chǎn)品[1]。目前，魷魚的主要加工方式是制作成魚糜，對(duì)魚糜原材料的要求主要是凝膠性能好，然而受到所含蛋白溶解度高、凝膠性能差、有特定的異味（酸、澀）等的限制[2]，魷魚在食品加工中的應(yīng)用并不充分，利用價(jià)值低，導(dǎo)致資源的浪費(fèi)。

蛋白質(zhì)是一類復(fù)雜多變的生物大分子，其結(jié)構(gòu)和性能密切相關(guān)。建立蛋白結(jié)構(gòu)與蛋白凝膠特性間的聯(lián)系，利用各種物理和化學(xué)手段調(diào)控蛋白的結(jié)構(gòu)以優(yōu)化其凝膠性能，是目前食品加工過程中常用的技術(shù)策略，如利用多糖與蛋白之間的互作形成多糖-蛋白凝膠[3]，加入凝膠強(qiáng)化劑[4]，改變其外界環(huán)境條件[5]等。肌原纖維蛋白是秘魯魷魚蛋白形成凝膠過程中的主要作用成分，它由肌動(dòng)蛋白（AC）、原肌球蛋白（TM）及副肌球蛋白（PM）等單質(zhì)蛋白組成[6]。為生產(chǎn)出大眾所接受和喜愛的產(chǎn)品，需進(jìn)一步研究肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)與性能[7]。由于肌原纖維蛋白含多組分蛋白，且蛋白間存在強(qiáng)相互作用，這些作用力不僅會(huì)影響蛋白質(zhì)整個(gè)失活過程，對(duì)調(diào)節(jié)不同分子間的交聯(lián)過程也起到一定的作用[8]。因?yàn)檫@些表征參數(shù)大多取決于肌原纖維蛋白的組成成分，所以整體表征肌原纖維蛋白幾乎是不可能的。肌原纖維蛋白組成的細(xì)微變化，可能引起這些理化指標(biāo)的巨大差異，導(dǎo)致食品實(shí)際生產(chǎn)過程中經(jīng)驗(yàn)遠(yuǎn)比理論模型更常用。理論系：Bottom-up 方法是目前解決這類問題很常見的科研策略。獲取高純度的單個(gè)組分是這一策略能否實(shí)施的關(guān)鍵。然而，秘魯魷魚肌原纖維蛋白溶液中的蛋白納米顆粒（Nano protein particle）的存在[9]揭示各組分間存在強(qiáng)相互作用，是分離純化該體系的主要障礙。同時(shí)多組分的存在導(dǎo)致各組分在溶液中的濃度很低，進(jìn)一步增大了體系分離純化的難度；此外，分離純化前目標(biāo)蛋白質(zhì)分子自身的折疊會(huì)影響分離純化的pH 值、溫度和壓力等條件。因此常用的條件為室溫或低溫、常壓以及pH 值接近等電點(diǎn)。這些制約條件使實(shí)驗(yàn)者不得不采用特殊的分離純化儀器（蛋白純化系統(tǒng)）和單元操作（色譜分離純化技術(shù)）。同時(shí)，為達(dá)到分離純化蛋白的目的，研究者需優(yōu)化分離程序，包括色譜柱的選型，不同色譜柱的排序，色譜柱的操作條件。

目前，對(duì)肌原纖維蛋白的研究主要集中在外界環(huán)境條件，如pH 值、壓強(qiáng)和溫度等對(duì)其凝膠性能的影響，如林偉偉等[10]研究pH 值和KCl 對(duì)肌原纖維蛋白的影響；廖慧琦等[11]研究NaCl 不同添加量對(duì)大黃魚肌原纖維蛋白凝膠性能的影響；韓柯穎等[12]通過控制微波功率和時(shí)間，研究溫度對(duì)雞胸肉肌原纖維蛋白凝膠性能的影響；李釗等[13]研究超高壓對(duì)肌原纖維蛋白凝膠性能的影響。然而，目前尚未見從秘魯魷魚中分離純化出單體蛋白的報(bào)道。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，為全面了解其結(jié)構(gòu)和性能之間的關(guān)系，本研究通過陰離子交換層析和凝膠過濾層析聯(lián)用的技術(shù)，從多組分且存在強(qiáng)相互作用的蛋白體系中分離純化出較高純度的單質(zhì)蛋白，為食品蛋白構(gòu)效關(guān)系的研究提供更精準(zhǔn)的模型。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

秘魯魷魚（4.5±1.5）kg，舟山第二海洋漁業(yè)公司；曲拉通-X10、Tris，美國(guó)Amrosco 公司；30%丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺預(yù)混液（質(zhì)量比29∶1）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、二硫蘇糖醇（DTT）、過硫酸銨（APS）、四甲基乙二胺（TEMED），美國(guó)BIORAD 公司；即用型蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Marker（6.5～200 ku），杭州寶誠(chéng)生物技術(shù)有限公司；酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、氫氧化鈉、乙醇等分析純級(jí)試劑均來自于杭州捷誠(chéng)生物科技有限公司。

1.2 試劑制備

1.2.1 磷酸鹽緩沖液 pH 7.5，10 mmol/L EDTA，3.5 mmol/L KH2PO4，15.6 mmol/L Na2HPO4。

1.2.2 上樣緩沖液 2 mL 的Tris-HCl 0.5 mol/L，（pH 6.8）+4 mL 10% SDS+2 mL 甘油+0.05 mL 1% 溴酚藍(lán)，超純水定容至10 mL，4 ℃保存。試驗(yàn)前加入200 mmol/L DTT（v上樣緩沖液∶mDTT=1∶0.03）。

1.2.3 脫色液 40%無水乙醇+10%冰醋酸+50%去離子水。

1.2.4 緩沖液 緩沖液A：含0.1 mol/L KCl 的磷酸鹽緩沖溶液；緩沖液B：含0.15 mol/L KCl的磷酸鹽緩沖溶液。

1.2.5 考馬斯亮藍(lán)染液 100 mg 考馬斯亮藍(lán)G-250+50 mL 90%的乙醇+100 mL 80%的磷酸，超純水稀釋至1 L。

1.3 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

變性梯度凝膠電泳儀、GS800 高分辨光密度掃描儀，美國(guó)BIO-RAD 公司；HPLC-1260KW-804 液相色譜儀，美國(guó)Agilent 公司；Millipore-Q超純水儀，美國(guó)MILLIPORE 有限公司；AKTA 蛋白純化儀，美國(guó)GE 公司；ALVCGS-3 廣角光散射儀，德國(guó)ALV 公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 肌原纖維蛋白的提取 參考Hashimoto等[14]的方法，稱取25 g 秘魯魷魚胴體肉（去除魚皮、骨頭、內(nèi)臟、眼球、尾巴等），加入200 mL 磷酸鹽緩沖液和50 mL 1%曲拉通（Triton），用IKA 組織勻漿機(jī)勻漿（1 000 r/min），整個(gè)勻漿過程在冰浴上進(jìn)行，每勻漿30 s 停30 s，重復(fù)5 次，最后一次得到的勻漿液用2 層紗布過濾得到濾液，離心（冷凍離心機(jī)，8 000×g，10 min，4 ℃），沉淀用10 倍體積的緩沖液B 漂洗，離心，將以上過程重復(fù)進(jìn)行3次，最后所得沉淀即為肌原纖維蛋白。

1.4.2 肌原纖維蛋白溶液的制備 磷酸鹽緩沖液先抽濾（0.22 μm 濾膜）再超聲30 min。將上述肌原纖維蛋白沉淀在4 ℃下按一定的質(zhì)量比充分溶解在磷酸鹽緩沖液中后離心，取上清液過0.45 μm濾膜即為目標(biāo)溶液。

1.4.3 考馬斯亮藍(lán)G-250 染色法測(cè)定蛋白濃度采用Brodford 法對(duì)肌原纖維蛋白進(jìn)行定量，以牛血清蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。配置濃度梯度的牛血清蛋白溶液1 mL，加入考馬斯亮藍(lán)染色液5 mL，充分混勻反應(yīng)5 min，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定溶液在波長(zhǎng)595 nm 處的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出肌原纖維蛋白的濃度。

1.4.4 秘魯魷魚肌原纖維蛋白分離純化 將提取得到的肌原纖維蛋白溶液過HiTrap Q FF 16 離子交換層析，用含0.15～1 mol/L KCl 的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫流速為3 mL/min，收集各峰洗脫液超濾濃縮脫鹽，然后過SurperdexTM 200 10/300 凝膠層析，用1 mol/L KCl 的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行洗脫，洗脫流速為0.5 mL/min，收集各峰洗脫液超濾濃縮脫鹽，進(jìn)行純度鑒定[7]。

1.4.5 蛋白的SDS-PAGE 分析

1.4.5.1 梯度膠的制備 按配方配制6%～18%的梯度膠，然后用BioRad 梯度膠灌膠器進(jìn)行灌膠，制成蛋白變性單向電泳所用的梯度膠。

1.4.5.2 制樣 用提取液及鹽溶液將蛋白溶液稀釋至適合的倍數(shù)（3～5 mg/mL），然后按體積比1∶1加入上樣緩沖液，于沸水中煮沸3～5 min。

1.4.5.3 上樣 將10 μL 蛋白Marker 及煮沸過的樣品依次加入膠孔。

1.4.5.4 電泳 凝膠板通電電泳，30 min 后將電壓由70 V 調(diào)到110 V，當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到離膠板下沿約1 cm 時(shí)，停止電泳。

1.4.5.5 染色 取出凝膠放在考馬斯亮藍(lán)G-250染色液中染色2 h 以上，過程中保護(hù)膠面不被污染。

1.4.5.6 脫色 將染好的凝膠放入脫色液中脫色至蛋白條帶清晰。

1.4.5.7 膠圖像掃描和分析 用GS-800 光密度掃描儀對(duì)染色后的凝膠進(jìn)行掃描（光學(xué)分辨率為300 DPx，像素標(biāo)準(zhǔn)為8 bits）。為保證重復(fù)性，對(duì)每個(gè)樣品的蛋白質(zhì)電泳重復(fù)3 次。

1.4.6 HiTrap Q FF 16 離子交換層析 在溫度為4 ℃的冰箱中，將提取得到得肌原纖維蛋白按照質(zhì)量比1∶3 溶解在緩沖液A 中，充分溶解過夜后離心10 min （5 000×g，4 ℃），取上清液過0.45 μm 的微孔濾膜；上樣量5 mL，起始緩沖液為緩沖液A，洗脫緩沖液為緩沖液B，速度為2 mL/min，洗脫梯度為30%，50%和100%。

1.4.7 SurperdexTM 200 10/300 凝膠層析柱分離純化 將離子交換層析得到的蛋白組分峰用Millipore 超濾管 （微孔超濾管） 濃縮脫鹽，再用SurperdexTM 200 10/300 凝膠層析柱分離純化，上樣量500 μL，洗脫液用緩沖液A，洗脫流速為0.5 mL/min，用分步收集器收集，每管0.5 mL。

1.4.8 HPLC 測(cè)定蛋白的純度 利用高效液相色譜儀自帶的KW-804 凝膠蛋白柱（排阻極限為106Pa）分離純化，所需的流動(dòng)相為緩沖溶液A，在室溫下以0.5 mL/min 的速度進(jìn)行分離，在波長(zhǎng)280 nm 處檢測(cè)蛋白含量。

1.4.9 MALDI-TOF 蛋白的鑒定 收集經(jīng)凝膠電泳分離得到的單一條帶，重新溶解提取蛋白質(zhì)，然后利用MALDI-TOF/MS 對(duì)分離得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，并將獲得的信息與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)。

1.4.10 動(dòng)態(tài)光散射粒徑分析 利用激光光散射儀對(duì)純化得到的蛋白質(zhì)粒徑進(jìn)行表征，測(cè)量參數(shù)為（波長(zhǎng)628 nm，角度90°，溫度25 ℃），每次累積30 s，平行測(cè)量3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 離子交換層析分離蛋白的結(jié)果分析

如圖1所示，經(jīng)過離子交換層析分離后，肌原纖維蛋白溶液中總共分離出5 個(gè)組分峰，峰A 為沒有被凝膠柱吸附的組分；峰B 和C 顯示這兩組分峰沒有完全分開，但依然依次收集；峰D 和E可單獨(dú)收集，收集得到的各洗脫液取少量做SDSPAGE 檢測(cè)，其余的用Millipore 超濾管進(jìn)行濃縮脫鹽處理。

圖1 肌原纖維蛋白的分離洗脫曲線圖Fig.1 Isolation and elution diagram of myofibril protein

2.2 SDS-PAGE 凝膠電泳結(jié)果鑒定

由圖2可知，電泳條帶A 中顏色較深的為肌動(dòng)蛋白，較淺的條帶為少量的副肌球蛋白和肌球蛋白重鏈；電泳條帶B 和C 為30%的洗脫液分離的組分峰，由于沒有完全分離所以收集的時(shí)候界面不明確，導(dǎo)致電泳條帶中兩組分種類類似，都含有較多的副肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白和原肌球蛋白；電泳條帶D 中主要成分是肌動(dòng)蛋白和原肌球蛋白；在電泳條帶E 中顯示出單一條帶，主要成分為肌動(dòng)蛋白，分子質(zhì)量為44.3 ku。單純選擇離子交換層析技術(shù)分離肌原纖維蛋白，僅能從洗脫峰E 中得到電泳純的肌動(dòng)蛋白，且純化得到的蛋白量較少。而其它洗脫峰中肌動(dòng)蛋白含量雖然高，但是不能得到較純的單一蛋白質(zhì)，因此還需要結(jié)合其它層析柱進(jìn)一步分離純化。

圖2 離子柱分離得到的各洗脫液的SDS-PAGE 電泳圖Fig.2 SDS-PAGE electrophoretogram of each eluent obtained by ion column separation

2.3 凝膠層析柱分離純化的結(jié)果分析

如圖3a所示，收集液A 用凝膠柱分離后得到3 個(gè)洗脫峰，分別標(biāo)記為AA、AB 和AC；收集液B 進(jìn)一步分離得到3～4 個(gè)洗脫峰，由圖3b 可看出幾個(gè)峰依然沒有完全分離開；而50%洗脫峰被進(jìn)一步分離出3 個(gè)峰，分別被命名為DA、DB、DC，由圖3c（30%洗脫峰）可看出分離度良好。對(duì)比圖3a 和3d 可以看出，峰AA 和DA 被分離出時(shí)所需的洗脫液的體積和出峰位置相似，初步猜測(cè)這兩個(gè)峰可能含有相同的蛋白組分。收集每個(gè)洗脫峰溶液，經(jīng)濃縮脫鹽后用于SDS-PAGE 電泳鑒定。

圖3 凝膠柱分離肌原纖維蛋白的洗脫峰Fig.3 Separation of elution peak from myofibrillar protein by gel column

2.4 SDS-PAGE 凝膠電泳結(jié)果

用Millipore 超濾管（截留分子質(zhì)量為10 ku）濃縮經(jīng)凝膠層析得到的所有洗脫峰用于SDSPAGE 進(jìn)行純度鑒定，鑒定結(jié)果如圖4所示。

如圖4所示，泳道AA、AB、DA 和DC 均顯示出分子質(zhì)量約44.3 ku 的均勻單一條帶。根據(jù)文獻(xiàn)可知，這些條帶均為電泳純肌動(dòng)蛋白。而BA 泳道中不僅含有肌動(dòng)蛋白還有較多的復(fù)肌球；從BC泳道中分離得到了肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白以及少量的副肌球蛋白；DB 峰只能得到肌動(dòng)蛋白和原肌球蛋白的復(fù)合物；C 峰 （即CA、CB、CC、CD 峰）的副肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白和原肌球蛋白沒有分離；AC 峰未檢測(cè)到蛋白質(zhì)。

圖4 凝膠柱分離得到的各洗脫液的SDS-PAGE 電泳圖Fig.4 SDS-PAGE electrophoretogram of each eluent obtained by gel column separation

綜上所述，秘魯魷魚肌原纖維蛋白經(jīng)離子交換柱和凝膠色譜法柱聯(lián)合處理后，可從AA、AB、DA 和DC 洗脫液中得到較純的肌動(dòng)蛋白（電泳純級(jí)）。

2.5 肌動(dòng)蛋白的高效液相色譜洗脫峰分布

由以上結(jié)果可知，肌動(dòng)蛋白可從峰AA、AB、DA 及DC 中獲得，對(duì)于該蛋白純度的檢測(cè)，以從DA 峰中收集到的蛋白液為代表，檢測(cè)結(jié)果顯示為單一、對(duì)稱性良好的峰，說明肌動(dòng)蛋白在層析介質(zhì)上是均一的（除去鹽離子所引起的吸收峰）。

2.6 肌動(dòng)蛋白的MALDI-TOF-MS 鑒定及純度分析

利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜分析分離純化得到的肌動(dòng)蛋白，然后根據(jù)數(shù)據(jù)庫比對(duì)，獲得肌動(dòng)蛋白的信息（圖6）。

圖6 肌動(dòng)蛋白的MS/MS 質(zhì)譜圖Fig.6 MS/MS mass spectra of actin

由表1可知，Mascot 峰值為829，而當(dāng)Mascot峰值≥95 時(shí)即為鑒定成功，說明經(jīng)過離子交換色譜和凝膠色譜聯(lián)合從肌原纖維蛋白中分離得到了電泳純和色譜純的肌動(dòng)蛋白。

表1 肌動(dòng)蛋白的鑒定Table 1 Identification of actin

2.7 肌動(dòng)蛋白粒徑分布

由圖7可知，在0.15 mol/L KCl 鹽溶液條件下，肌動(dòng)蛋白光強(qiáng)度自相關(guān)衰減速度較快，在弛豫時(shí)間為1.64 ms 時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)，說明該溶液肌動(dòng)蛋白溶解性良好。由圖8可知，肌動(dòng)蛋白溶液的粒徑分布呈單峰狀態(tài)，對(duì)稱性好，說明溶液體系比較均勻，進(jìn)一步間接說明本試驗(yàn)純化的肌動(dòng)蛋白相對(duì)純凈。肌動(dòng)蛋白在0.15 mol/L KCl 中的平均水力半徑（Rh）為3.46 nm，這與Kanzaki 等[15]的測(cè)定結(jié)果一致，說明該方法獲得的肌動(dòng)蛋白保持了其天然的結(jié)構(gòu)，未發(fā)生變性聚集。

圖5 肌動(dòng)蛋白的高效液相色譜分析Fig.5 HPLC analysis of actin

圖7 肌動(dòng)蛋白溶液的自相關(guān)函數(shù)分布Fig.7 Autocorrelation function distribution of actin solution

圖8 肌動(dòng)蛋白溶液的粒徑分布圖Fig.8 Particle size distribution of actin solution

3 結(jié)論

整個(gè)分離純化肌動(dòng)蛋白流程中均沒有加入蛋白酶抑制劑EDTA，提取液用磷酸鹽緩沖液分步洗脫，梯度30%，50%，100%，洗脫流速2 mL/min，肌原纖維蛋白過離子柱后，獲得5 個(gè)洗脫峰，100%洗脫峰E 中獲得電泳純肌動(dòng)蛋白，其余的洗脫峰再進(jìn)一步利用凝膠柱分離純化，在A 峰和D峰中獲得較高純度的肌動(dòng)蛋白；SDS-PAGE 和HPLC 分析結(jié)果顯示肌動(dòng)蛋白為電泳純級(jí)和色譜純級(jí)蛋白，經(jīng)MALDI-TOF-MS 進(jìn)一步驗(yàn)證確定所得到的蛋白質(zhì)為肌動(dòng)蛋白。利用動(dòng)態(tài)光散射多所獲得的肌動(dòng)蛋白進(jìn)行了表征，0.15 mol/L KCl 中光強(qiáng)自相關(guān)衰減速率較快，弛豫時(shí)間1.64 ms 處達(dá)到最小值，肌動(dòng)蛋白水力學(xué)半徑（Rh）為3.46 nm，說

明獲得的肌動(dòng)蛋白保持了其天然結(jié)構(gòu)，未發(fā)生變性聚集。本研究詳細(xì)探討了秘魯魷魚肌動(dòng)蛋白的分離純化，對(duì)進(jìn)一步分析秘魯魷魚蛋白之間的構(gòu)效關(guān)系和產(chǎn)品開發(fā)具有重要的意義。