基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討鐵皮石斛抗結(jié)直腸腫瘤的作用機(jī)制

張子函， 陳雨莎， 韋文娥， 張力圖， 劉海洲*

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣西 南寧 530021)

結(jié)直腸癌是全球常見的惡性腫瘤之一，它在男性和女性中的發(fā)病率分別排第3位和第2位，大多數(shù)患者在確診時(shí)已處于晚期，早期癥狀不顯著[1]。基于鉑類和氟嘧啶的化療(例如奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶)已被用作結(jié)直腸癌新輔助化療和晚期結(jié)直腸癌化療的一線用藥，但是因耐藥而產(chǎn)生的治療失敗仍然不可避免，因此亟需尋找新的治療方法。鐵皮石斛是一種十分有價(jià)值的中藥，在我國(guó)已有近千年的使用歷史，多糖、菲類、芐類、黃酮等是從鐵皮石斛中分離的主要活性物質(zhì)。研究認(rèn)為，石斛中活性物質(zhì)(毛蘭素、石斛酚、柚皮素等)[2-7]具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、降血脂等多種藥理活性[8]，對(duì)多種惡性腫瘤細(xì)胞具有一定的抑制作用，同時(shí)對(duì)結(jié)直腸癌有一定的預(yù)防作用[9]，但其機(jī)制尚不明確。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討鐵皮石斛抗結(jié)直腸癌作用的主要活性成分及靶基因，以及相應(yīng)的作用通路。

1 方法

1.1 鐵皮石斛有效成分和靶點(diǎn)篩選 在CNKI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索關(guān)鍵詞“鐵皮石斛”和“成分”，經(jīng)過(guò)篩選得到鐵皮石斛中的主要活性成分。在PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中分別檢索鐵皮石斛中的主要活性化合物，得到它們的3D化學(xué)結(jié)構(gòu)式，保存為“SDF”格式。將先前獲得的化合物SDF文件上傳至pharmmapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)預(yù)測(cè)鐵皮石斛中主要活性化合物的藥效團(tuán)及其作用靶點(diǎn)。

1.2 鐵皮石斛中主要活性成分治療結(jié)直腸癌作用靶點(diǎn)的收集 在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)中以“colorectal cancer”作為檢索詞檢索結(jié)直腸癌作用的靶點(diǎn)，將鐵皮石斛主要活性化合物相關(guān)靶點(diǎn)與結(jié)直腸癌作用靶點(diǎn)用在線工具得到交集靶點(diǎn)并繪制韋恩圖。

1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過(guò)STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)分析蛋白相互作用，把先前獲取到的靶基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)中，并選擇物種為Homosapiens, 其余參數(shù)均為默認(rèn)值，得到初步的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。在MCODE中找到最有意義的模塊，然后在Cytoscape中進(jìn)行展示，并利用cytoHubba篩選得到樞紐基因。

1.4 GO功能、KEGG通路富集分析 通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)鐵皮石斛中3種主要成分的作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(GO)功能和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析，使用R語(yǔ)言包ggpolt2繪制GO功能和KEGG通路的氣泡圖。

1.5 核心基因的數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證 利用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)對(duì)獲得的核心基因進(jìn)行驗(yàn)證，得到它們?cè)诮Y(jié)直腸癌組織與正常組織之間的差異表達(dá)。并利用The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.proteinatlas.org/)得到核心基因的蛋白表達(dá)情況，觀察結(jié)直腸癌組織與正常腸組織之間的表達(dá)差異。

1.6 核心基因與主要化合物分子對(duì)接 利用分子對(duì)接技術(shù)探究鐵皮石斛主要成分與核心基因之間的相互作用。通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)下載鐵皮石斛中主要成分的2D結(jié)構(gòu)，利用ChemOffice將2D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為3D結(jié)構(gòu)，之后在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)中獲得蛋白三維結(jié)構(gòu)，用PyMOL對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)加水并用AutoDockTools對(duì)其加氫并預(yù)測(cè)對(duì)接，并確定坐標(biāo)相關(guān)參數(shù)，最后使用AutoDock Vina進(jìn)行分子對(duì)接并獲得相應(yīng)自由能。

2 結(jié)果

2.1 鐵皮石斛主要活性成分化學(xué)結(jié)構(gòu)及靶點(diǎn) 通過(guò)CNKI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，時(shí)間為2020年12月10日，初檢得到597篇，篩選結(jié)果見表1，可知毛蘭素、石斛酚、柚皮素是鐵皮石斛主要成分。通過(guò)PubChem獲得毛蘭素、石斛酚、柚皮素結(jié)構(gòu)式，見圖1，由Pharmmapper預(yù)測(cè)得到這3個(gè)化合物的藥效團(tuán)和其作用靶點(diǎn)，見表2。

表1 鐵皮石斛主要活性成分的文獻(xiàn)檢索

注：A、B、C分別為毛蘭素、石斛酚、柚皮素2D結(jié)構(gòu)，D、E、F分別為毛蘭素、石斛酚、柚皮素3D結(jié)構(gòu)。圖1 毛蘭素、石斛酚、柚皮素結(jié)構(gòu)

表2 鐵皮石斛主要活性成分的作用靶點(diǎn)(排名前10)

2.2 鐵皮石斛中主要活性成分治療結(jié)直腸癌的作用靶點(diǎn) 在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到9 329個(gè)與結(jié)直腸癌相關(guān)的基因，與鐵皮石斛中主要活性成分作用的141個(gè)潛在靶點(diǎn)取交集，得到94個(gè)交集靶點(diǎn)，見圖2。

圖2 結(jié)直腸癌靶基因和鐵皮石斛中主要活性成分靶基因的交集

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò) 在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中上傳94個(gè)交集靶點(diǎn)，下載其數(shù)據(jù)和初步的蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)由94個(gè)節(jié)點(diǎn)和175條邊組成。在Cytoscape中運(yùn)用MCODE找到最有意義的模塊，如圖3A所示；利用cytoHubba篩選得到最有意義的10個(gè)樞紐基因，如圖3B所示(圓形節(jié)點(diǎn)為基因)，分別是HSP90AA1、ESR1、XPO1、AR、HCK、EIF4A1、CBL、RUVBL1、CCND1、GTF2B，這些靶基因最有可能是鐵皮石斛發(fā)揮抗結(jié)直腸癌作用時(shí)的作用靶點(diǎn)。

圖3 蛋白質(zhì)相互作用及樞紐基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO功能、KEGG通路富集分析 通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)鐵皮石斛中3種主要成分作用的靶基因進(jìn)行GO功能、KEGG通路富集分析，獲得靶基因參與的信號(hào)通路和生物學(xué)過(guò)程，使用R軟件進(jìn)行可視化，繪制氣泡圖，P值越小，說(shuō)明富集的程度越高。GO功能富集分析結(jié)果顯示，細(xì)胞組分(CC)主要集中于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中(圖4)，分子功能(MF)主要集中于類固醇激素受體活性(Steroid hormone receptor activity)、核受體的活動(dòng)(Nuclear receptor activity)、核受體結(jié)合(Nuclear receptor binding)等(圖5)，生物過(guò)程(BP)主要集中于類固醇激素反應(yīng)(Response to steroid hormone)、前列腺上皮形態(tài)發(fā)生(Prostate gland epithelium morphogenesis)、前列腺形態(tài)發(fā)生(Prostate gland morphogenesis)、細(xì)胞對(duì)類固醇激素刺激的反應(yīng)(Cellular response to steroid hormone stimulus)、類固醇激素介導(dǎo)的信號(hào)通路(Steroid hormone mediated signaling pathway)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始(Transcription initiation from RNA polymerase Ⅱ promoter)等(圖6)。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，谷胱甘肽代謝(Glutathione metabolism)、前列腺癌(Prostate cancer)、非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer)、PD-L1在癌癥中的表達(dá)及PD-1檢查點(diǎn)通路(PD-L1 expression and PD-1 checkpoint pathway in cancer)、癌癥中的蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)、細(xì)胞衰老(Cellular senescence)、toll樣受體信號(hào)通路(Toll-like receptor signaling pathway)、p53信號(hào)通路(p53 signaling pathway)、慢性骨髓性白血病(Chronic myeloid leukemia)、病毒致癌作用(Viral carcinogenesis)、化學(xué)致癌作用(Chemical carcinogenesis)、Rap1信號(hào)通路(Rap1 signaling pathway)、胃癌(Gastric cancer)，甲狀腺癌(Thyroid cancer)、小細(xì)胞肺癌(Small cell lung cancer)、膀胱癌(Bladder cancer)等32條通路與鐵皮石斛中主要活性成分的藥物作用通路相關(guān)(圖7)。由此可見，鐵皮石斛中主要活性化合物可作用于多種腫瘤通路對(duì)腫瘤產(chǎn)生影響，同時(shí)也能作用于多條不同的通路對(duì)結(jié)直腸癌產(chǎn)生抑制作用。

圖4 GO細(xì)胞組分富集分析

圖5 GO分子功能富集分析

圖6 GO生物過(guò)程富集分析

圖7 KEGG通路富集分析

2.5 核心基因的數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證 通過(guò)TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)獲得核心基因的蛋白表達(dá)，比較正常組織與結(jié)直腸癌組織之間表達(dá)量，可以發(fā)現(xiàn)除了CBL以外，HSP90AA1、ESR1、XPO1、AR、HCK、EIF4A1、RUVBL1、CCND1、GTF2B表達(dá)在正常組織與結(jié)腸癌，正常組織與直腸癌之間均有顯著差異(圖8)。通過(guò)The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)獲得核心基因的蛋白的免疫組化結(jié)果，XPO1、EIF4A1在結(jié)直腸癌組織中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而在正常結(jié)直腸組織中相對(duì)較弱；HCK在結(jié)直腸癌組織中呈中低表達(dá)，在正常組織中表達(dá)量很低甚至不表達(dá)；CBL、RUVBL1在結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸組織之間均有表達(dá)，但在腫瘤組織中的表達(dá)量相對(duì)較高(圖9)。

圖8 核心基因在正常結(jié)直腸組織與結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)量

圖9 核心基因在正常結(jié)直腸組織、結(jié)直腸癌組織中的蛋白表達(dá)(免疫組化染色)

2.6 核心基因與主要化合物分子對(duì)接 分別針對(duì)PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索HSP90AA1、XPO1、ESR1、AR、HCK、RUVBL1、EIF4A1、CBL、CCND1、GTF2B，以獲得蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)。表3顯示，3種核心化合物均與10種核心靶點(diǎn)具有相對(duì)緊密的結(jié)合。

3 討論

鐵皮石斛具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、抗菌等作用[10]，其活性成分毛蘭素是一類小分子聯(lián)芐類化合物，在結(jié)直腸中，可通過(guò)Toll樣受體4以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)發(fā)揮抗?jié)冃越Y(jié)腸炎活性[11]，具有一定的抗宮頸癌[12]、鼻咽癌[13]、乳腺癌[14]作用；柚皮素是一種黃烷酮，可通過(guò)抑制PI3K/Akt/NF-κB通路抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖[15]，能有效抑制由N-亞硝基二乙胺引發(fā)的肝癌及癌前病變[16]，也被證實(shí)對(duì)小鼠皮膚腫瘤模型具有一定的抗腫瘤作用[17]；石斛酚也是一種聯(lián)芐類化合物，能通過(guò)調(diào)控NF-κB/PRL-3通路對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的增殖起到抑制作用[18]，也是Wnt/β-catenin途徑的新型抑制劑，在乳腺癌細(xì)胞中表現(xiàn)出抗癌活性，對(duì)肝癌細(xì)胞增殖也具有一定的抑制作用[19]。目前暫無(wú)研究這3種主要活性成分之間的協(xié)同抗腫瘤作用及機(jī)制的報(bào)道。

本研究中分析發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛主要活性成分作用于腫瘤相關(guān)通路中的核心基因，其中HSP90AA1基因可調(diào)節(jié)對(duì)腫瘤進(jìn)展至關(guān)重要的幾種蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，并被確定為治療癌癥的有希望的靶標(biāo)[20]，Vaseghi Maghvan等[21]通過(guò)生物信息學(xué)分析表明了HSP90AA1是包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的胃腸道腫瘤的關(guān)鍵基因；XPO1是調(diào)控細(xì)胞周期的基因，與結(jié)直腸癌的發(fā)病和增殖相關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織比較，XPO1在腫瘤組織中過(guò)表達(dá)，并與結(jié)直腸癌晚期分期顯著相關(guān)[22]；EIF4A1在細(xì)胞增殖和病毒復(fù)制的過(guò)程中起到重要作用，而EIF4A1在原發(fā)性結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)也顯著上調(diào)[23]；Poh等[24]研究發(fā)現(xiàn)HCK水平與結(jié)直腸癌患者生存率降低有關(guān)，而小鼠體內(nèi)HCK活性的增加也會(huì)促進(jìn)內(nèi)源性結(jié)腸惡性腫瘤與人結(jié)直腸癌細(xì)胞異種移植物的生長(zhǎng)；在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的RUVBL1負(fù)調(diào)控p53表達(dá)，從而干擾p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，可以抑制結(jié)直腸腫瘤中凋亡細(xì)胞的死亡[25]；AR基因的聚谷氨酰胺(CAG)重復(fù)次數(shù)會(huì)影響結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[26]，以上結(jié)果提示，鐵皮石斛對(duì)結(jié)直腸癌具有一定的治療作用，所預(yù)測(cè)的機(jī)制靶點(diǎn)也為后續(xù)研究提供了參考。

綜上所述，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)平臺(tái), 通過(guò)對(duì)鐵皮石斛內(nèi)3種活性物質(zhì)治抗腫瘤作用的分子機(jī)制進(jìn)行分析, 結(jié)合TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析核心蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)和預(yù)后狀態(tài)，結(jié)果表明, 毛蘭素、石斛酚和柚皮素可協(xié)同作用結(jié)腸癌相關(guān)通路發(fā)揮抗結(jié)直腸癌作用。