海棠茶水提物對黃嘌呤氧化酶的影響

王 宇， 汪鋆植，2*， 王丹陽， 聶淞瑩， 張宏岐,2

(1.三峽大學天然產物研究與利用湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443002；2.湖北省生物酵素工程技術研究中心，湖北 宜昌 443002)

尿酸是人體內嘌呤代謝的終產物，在正常嘌呤飲食狀態(tài)下當人體內尿酸值超過一定濃度(男性>420 μmol/L，女性>360 μmol/L)時，即發(fā)展為高尿酸血癥[1]。黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)是嘌呤代謝的關鍵酶，可將黃嘌呤催化生成尿酸，因此以其抑制劑阻斷尿酸合成是治療高尿酸血癥的有效方法之一，其中別嘌醇可有效抑制體內黃嘌呤氧化酶，使其不能被氧化成尿酸，從而達到控制尿酸水平的目的[2]，但不良反應較多，如史-約綜合征(stevens-Johnson syndrome，SJS)、中毒性皮膚壞死癥(toxic epidermal necrolysis，TEN)，死亡率達20%～25%[3]。因此，尋找安全性高、效果顯著的黃嘌呤氧化酶抑制劑具有重要意義。

湖北海棠Malushupehensis(Pamp.) Rehder為薔薇科蘋果屬植物，藥食兩用，海棠茶是其葉部位，也為三峽地區(qū)歷史悠久的清涼飲料[4]，富含根皮苷、根皮素、三羥基根皮苷等黃酮類物質，以及齊墩果酸、熊果酸等三萜類化合物[5-6]，具有保肝護肝[7-8]、抗氧化[9]、降血糖[10]、抗病毒[11]等多種作用，但其對尿酸代謝的影響未見報道。有研究表明，高尿酸血癥與糖尿病密切相關，相互促進[12]，鑒于海棠茶及其主要成分根皮苷具有降糖作用，本實驗觀察該藥材對黃嘌呤氧化酶的影響，并對根皮苷、根皮素、三羥基根皮苷等黃酮類物質進行體外黃嘌呤氧化酶抑制活性研究，以期為其開發(fā)利用提供依據。

1 材料

1.1 試劑與藥物 海棠茶由湖北省生物酵素工程技術研究中心(三峽大學)提供，經三峽大學王玉兵博士鑒定為湖北海棠Malushupehensis(Pamp.) Rehder的葉。根皮苷、根皮素、三羥基根皮苷純度均大于95%，由湖北省生物酵素工程技術研究中心(三峽大學)提供。黃嘌呤(批號D1828210，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；氧嗪酸鉀(批號C10652334，上海麥克林生化科技有限公司)；尿酸檢測試劑盒(批號20200925)、黃嘌呤氧化酶檢測試劑盒(批號20200630)(南京建成生物工程研究所)。

1.2 動物 70只昆明小鼠，雌雄各半，體質量(20±2)g，由三峽大學動物實驗中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK(鄂)2017-0012，實驗動物使用許可證號SYXK(鄂)2017-0061，在溫度20～26 ℃、相對濕度40%～70%下正常喂養(yǎng)，自由飲水。

1.3 儀器 JA2003型電子分析天平(上海天平儀器技術有限公司)；Infinite M200PRO酶聯免疫檢測儀(美國ATI公司)；Centrifuge 5415R高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；KFS-C電子數字天平(永康市凱豐集團有限公司)；PH計(上海儀電科學儀器股份有限公司)；超純水儀(美國Aquapro公司)。

1.4 藥液

1.4.1 水提液 取海棠茶葉50 g，加10倍量水，在98 ℃下回流提取3次，抽濾，合并濾液，減壓濃縮除去水分，真空干燥，即得。

1.4.2 底物溶液 1 mol/L氫氧化鈉溶解黃嘌呤，加入30 mL蒸餾水，1 mol/L鹽酸調節(jié)pH至7.5，即得(濃度為1.5 mmol/L)。

1.4.3 酶液 PBS緩沖液溶解XOD，即得(0.4 U)，在-80 ℃下保存，臨用前稀釋成不同濃度，并在冰水浴中保存。

1.4.4 樣品溶液 DMSO溶解根皮苷、根皮素、三羥基根皮苷，即得，在4 ℃下保存，臨用前稀釋至不同濃度。

2 方法

2.1 黃嘌呤氧化酶活力測定 參考文獻[13]報道并稍作修改，記錄295 nm波長處每1 min增加的光密度(OD)值(ΔOD/min)來計算XOD活性。取樣品、空白溶液各100 μL，0.1 U/mL酶液50 μL，依次加到96孔板中，在37 ℃下孵育5 min，加入0.05 mmol/L底物溶液，混勻，在295 nm波長處每隔15 s記錄1次OD值，共監(jiān)測5 min，計算抑制率，公式為抑制率={[(ΔOD/min)空白-(ΔOD/min)樣品]/(ΔOD/min)空白}×100%，(ΔOD/min)空白為空白組反應速率，(ΔOD/min)樣品為樣品反應速率。

2.2 海棠茶水提物、根皮苷對高尿酸小鼠血尿酸的影響

2.2.1 分組、造模及給藥 將70只小鼠按體質量隨機分為空白組，模型組，別嘌呤醇組(5 mg/kg)，海棠茶水提物低、高劑量組(300、600 mg/kg)，根皮苷低、高劑量組(30、60 mg/kg)，每組10只。除空白組外，各組小鼠灌胃給予500 mg/kg氧嗪酸鉀建立高尿酸血癥模型，1 h后給藥組灌胃給予相應藥液；空白組、模型組灌胃給予等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)14 d。末次給藥1 h后，各組小鼠眼球靜脈叢取血，3 000 r/min離心10 min，取血清，置于-20 ℃冰箱中保存。再脫頸椎處死小鼠，取肝臟組織，置于-80 ℃冰箱中保存。

2.2.2 小鼠血清尿酸水平和肝組織黃嘌呤氧化酶活性測定 取小鼠血清，按照尿酸檢測試劑盒說明書檢測尿酸水平。稱取小鼠肝組織適量，按1∶9比例加入生理鹽水，在-20 ℃下勻漿，制成10%勻漿液，2 500～3 000 r/min離心10 min，取上清液，按照相關試劑盒說明書檢測黃嘌呤氧化酶活性。

2.3 黃嘌呤氧化酶抑制作用機制研究 參考文獻[13-14]報道，保持反應體系中底物黃嘌呤濃度不變，設定XOD濃度分別為0、0.2、0.1、0.05、0.025 U/mL(0 U/mL為加等量PBS緩沖液)。以反應速率對酶活性作圖，若得到平行直線，則為不可逆抑制；若所有直線均過原點，則為可逆抑制。

2.4 黃嘌呤氧化酶抑制類型和抑制常數測定 參考文獻[13-14]報道，在黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶測活體系中保持酶濃度0.1 U/mL不變，設定黃嘌呤濃度分別為1、0.5、0.25、0.012 5、0 mmol/L(0 mmol/L為加入等量PBS緩沖液)。以酶的反應速率倒數為縱坐標，底物黃嘌呤濃度倒數為橫坐標，采用以Lineweaver-Burk雙倒數法作圖，判斷樣品對XOD的抑制類型。

采用Dixon作圖法，選取2個底物濃度，以抑制劑質量濃度為橫坐標，反應速率倒數為縱坐標作圖，得到2條相較于一點的直線，其交點處橫坐標的絕對值即為抑制常數(Ki)。

2.5 根皮苷與根皮素對黃嘌呤氧化酶的聯合抑制作用研究 參考文獻[14]報道，采用等毒法，將根皮苷、根皮素對XOD抑制率為25%時所需的劑量混合，測定混合物對XOD的抑制率，以50%為預期抑制率，計算共毒系數，公式為共毒系數=[(實測抑制率-預期抑制率)/預期抑制率]×100%。當共毒系數大于10但小于20時，屬于弱協同作用；大于20時，屬于協同作用；小于-10時，屬于拮抗作用。

3 結果

3.1 海棠茶水提物、根皮苷對小鼠血清尿酸水平、肝組織黃嘌呤氧化酶活性的影響 表1顯示，空白組、給藥組小鼠血清尿酸水平低于模型組(P<0.05)，給藥組小鼠肝組織XOD活性低于模型組(P<0.05)，表明海棠茶水提物、根皮苷均具有體內XOD抑制活性，可有效降低小鼠血清尿酸水平，而且根皮苷可能為主要活性物質。

表1 海棠茶水提物、根皮苷對小鼠血清尿酸水平、肝組織黃嘌呤氧化酶活性的影響

3.2 海棠茶水提物及其所含成分對黃嘌呤氧化酶的抑制作用 表2顯示，三羥基根皮苷對XOD的抑制活性最強，IC50值為(2.02±1.79) μg/mL；根皮苷、根皮素IC50值分別為(355.2±1.78)、(123.4±1.03) μg/mL，對XOD表現出較強的抑制活性；海棠茶水提物IC50值為(1 379±1.93)μg/mL，抑制活性不明顯。

表2 海棠茶水提物及其所含成分對黃嘌呤氧化酶的抑制作用

3.3 根皮苷、根皮素、三羥基根皮苷對黃嘌呤氧化酶的抑制作用 圖1～3顯示，根皮苷、根皮素、三羥基根皮苷對XOD的抑制均為可逆抑制，均是通過降低酶活性來達到減少催化效率的目的。

圖1 根皮苷對黃嘌呤氧化酶的抑制作用

圖2 根皮素對黃嘌呤氧化酶的抑制作用

圖3 三羥基根皮苷對黃嘌呤氧化酶的抑制作用

3.4 根皮苷、根皮素、三羥基根皮苷對黃嘌呤氧化酶的抑制類型及抑制常數

3.4.1 抑制類型 圖4顯示，隨著根皮苷質量濃度升高，直線斜率逐漸增大，并相交于第一象限，屬于混合型抑制。圖5顯示，隨著根皮素質量濃度升高，直線縱軸截距基本不變，并相交于Y軸，屬于競爭性可逆抑制。圖6顯示，隨著三羥基根皮苷質量濃度升高，直線斜率基本不變，并相互平行，屬于反競爭性可逆抑制。最終，選擇IC50值相差不明顯、均為競爭性抑制作用的根皮苷和根皮素進行后續(xù)研究。

圖4 根皮苷對黃嘌呤氧化酶的抑制類型

圖5 根皮素對黃嘌呤氧化酶的抑制類型

圖6 三羥基根皮苷對黃嘌呤氧化酶的抑制類型

3.4.2 抑制常數 圖7～9顯示，根皮苷、根皮素、三羥基根皮苷對黃嘌呤氧化酶的抑制常數分別為411.04、80.05、3.0 μg/mL。

圖7 根皮苷對黃嘌呤氧化酶的抑制常數

3.5 根皮苷、根皮素對黃嘌呤氧化酶的聯合抑制作用 表3顯示，共毒系數大于20，表明根皮苷與根皮素聯用抑制黃嘌呤氧化酶活性時，具有協同作用。

表3 根皮苷、根皮素對黃嘌呤氧化酶的聯合抑制作用

4 討論

圖8 根皮素對黃嘌呤氧化酶的抑制常數

圖9 三羥基根皮苷對黃嘌呤氧化酶的抑制常數

高尿酸血癥是由于尿酸的生成增多和/或排泄減少導致的代謝性疾病。本研究從尿酸生成途徑檢測了體外海棠茶水提物對尿酸生成關鍵酶——黃嘌呤氧化酶的抑制作用，并分析了其水提物中主要的黃酮類成分對黃嘌呤氧化酶的影響以及作用機理。結果顯示，水提物中主要的黃酮類成分對黃嘌呤氧化酶活性具有抑制作用，其中三羥基根皮苷體外黃嘌呤氧化酶抑制活性極強，三羥基根皮苷在海棠茶中含量較高，可以深入研究。根皮苷和根皮素聯合使用后對體外XOD抑制率達(73.75±2.18)%，表現出較強的協同作用，表明海棠茶水提物中不同抑制類型的不同成分通過對黃嘌呤氧化酶抑制的協同作用，使水提物具有更好的作用。

高尿酸血癥與糖尿病密切相關，相互促進[12]，而海棠茶葉水煎液具有降血糖作用[15]。海棠茶中主要成分為根皮苷為鈉葡萄糖協同轉運蛋白(SGLT)抑制劑，Kimura等[16]報道，因SGLT抑制劑對SGLT2的抑制作用，導致腎集合管腔中葡萄糖濃度的增加刺激尿酸轉運蛋白在近端小管中介導的尿酸排泄，并抑制腎臟收集管中的尿酸重吸收，從而降低血尿酸。有研究表明，根皮素可通過協同抑制NLRP3和尿酸重吸收，改善高尿酸性腎損傷，且具有降尿酸作用[17]。本實驗結果顯示，海棠茶水提物以及主要成分根皮苷等均可有效降低小鼠血清尿酸水平(P<0.05)，且可有效降低肝組織黃嘌呤氧化酶活性。因此，本課題組認為海棠茶對尿酸的體內代謝具有積極的意義，更適合2型糖尿病兼高尿酸血癥患者飲用。海棠茶對調節(jié)尿酸代謝具有良好的應用潛景，但其對痛風的作用及機制有待進一步深入研究。

綜上所述，海棠茶對黃嘌呤氧化酶具有抑制活性，主要活性成分為根皮苷等黃酮類成分。海棠茶對調節(jié)尿酸代謝，防治高尿酸血癥，減少痛風風險具有積極作用。