UPLC-MS/MS法測(cè)定不同附子炮制品中14種生物堿

代 珊， 朱紅梅， 李 帥， 毛九州， 張愛(ài)軍*

(1.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041)

附子是毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根的加工品，6月下旬至8月上旬采挖，除去母根、須根及泥沙，習(xí)稱“泥附子”，具有回陽(yáng)救逆、補(bǔ)火助陽(yáng)、散寒止痛之功效，但它屬于毒性中藥材，需經(jīng)過(guò)炮制后方可入藥。經(jīng)典名方是指目前仍廣泛應(yīng)用、療效確切、具有明顯特色與優(yōu)勢(shì)的清代及清代以前醫(yī)籍所記載的方劑[1]，2018年，國(guó)家中醫(yī)藥管理局發(fā)布了《古代經(jīng)典名方目錄(第一批)》[2-3]，其中5個(gè)經(jīng)典名方中附子炮制方法記載為“炮”，如小續(xù)命湯中附子[4]，但古法費(fèi)時(shí)繁瑣，火候難以控制，無(wú)法適應(yīng)現(xiàn)代工業(yè)化需求。研究表明，炒[5]、烘[6]、蒸[6]、煮[7]、煨[8]等現(xiàn)代炮制方法均可對(duì)附子達(dá)到減毒存效的目的。

為了解決附子現(xiàn)代生產(chǎn)工藝問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)選擇炒、蒸、烘、白附片和黑順片的炮制方法，通過(guò)UPLC-MS/MS法測(cè)定其中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭堿、苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿、烏頭原堿、新烏頭原堿、次烏頭原堿、附子靈、尼奧靈、塔拉薩敏、多根烏頭堿、宋果靈14種生物堿含量，并與古法進(jìn)行比較?；瘜W(xué)計(jì)量學(xué)是一種綜合分析方法，可將多個(gè)對(duì)象與多指標(biāo)相互關(guān)聯(lián)，從大量復(fù)雜的數(shù)據(jù)中提取信息[9-10]，故本實(shí)驗(yàn)采用該方法尋找與古法相似的附子現(xiàn)代炮制方法，以期為該藥材生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290型超高效液相色譜儀、Agilent 6460型三重四極桿質(zhì)譜儀、MassHunter Qualitative Analysis B.03.00軟件(美國(guó)Agilent公司)；AUW220D型電子天平(日本島津公司)；KQ-300B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)；DB-207型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(成都電烘箱廠)。

1.2 試劑與藥物 烏頭原堿(批號(hào)DST200807-007)、新烏頭原堿(批號(hào)DST191117-026)、次烏頭原堿(批號(hào)DST200807-059)、多根烏頭堿(批號(hào)DST201017-059)對(duì)照品均購(gòu)于成都德思特生物科技有限公司，純度均≥98%；附子靈(批號(hào)MUST-20062606)、塔拉薩敏(批號(hào)MUST-20051801)對(duì)照品均購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司，純度均≥98%；尼奧靈(批號(hào)PS010183)、宋果靈(批號(hào)001150)對(duì)照品均購(gòu)于成都普思生物科技有限公司，純度均≥98%；苯甲酰烏頭堿(批號(hào)111794-201705，純度≥98%)、苯甲酰次烏頭堿(批號(hào)111796-201705，純度≥98%)、苯甲酰新烏頭堿(批號(hào)111795-201805，純度93.1%)、新烏頭堿(批號(hào)110799-201608，純度98.5%)、次烏頭堿(批號(hào)110798-201609，純度99.2%)對(duì)照品及烏頭雙酯型生物堿對(duì)照提取物(批號(hào)112029-201601，烏頭堿純度31.8%，次烏頭堿純度30.0%，新烏頭堿純度31.7%)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。3批泥附子采自四川布拖，經(jīng)四川省中醫(yī)藥科學(xué)院周先建副研究員鑒定為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根。甲醇、乙腈(色譜純，美國(guó)Fisher公司)；甲酸(色譜純，成都市科隆化學(xué)品有限公司)；其余試劑均為分析純。

a. 對(duì)照品 b. 供試品a. reference substance b. test sample圖1 各生物堿MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of various alkaloids

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制品制備 取3批藥材，每批平均分成6份，常壓蒸制3 h，去皮，切片，干燥，即得蒸附子。藥材用錫箔紙包裹，置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，在150 ℃下烘制6～10 h至透心，去皮，切片，干燥，即得烘附子。將藥材掩埋在熱火灰中，炮至微裂，去皮，切片，干燥，即得炮附子[4]。將藥材洗凈，浸入食用膽巴的水溶液中數(shù)日，連同浸液煮至透心，撈出，水漂，縱切成約5 mm的厚片，再用水浸漂，用調(diào)色液使附片染成濃茶色，取出，蒸到出現(xiàn)油面、光澤后烘至半干，再曬干或繼續(xù)烘干，即得黑順片[11]。將藥材洗凈，浸入膽巴水溶液中數(shù)日，連同浸液煮至透心，撈出，剝?nèi)ネ馄?，縱切成約3 mm的厚片，用水浸漂，取出，蒸透，曬干，即得白附片。將藥材洗凈，切片，干燥，即得生附片。將中等細(xì)度的河砂投入炒藥機(jī)內(nèi)，炒至滑利，投入生附片，砂炒至外表皮黃棕色，斷面黃色，取出，迅速篩去河砂，晾干，即得炒附片[12]。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取各對(duì)照品適量，甲醇制成含烏頭堿8.140 8 μg/mL、新烏頭堿8.115 2 μg/mL、次烏頭堿7.680 0 μg/mL、苯甲酰烏頭堿22.198 4 μg/mL、苯甲酰次烏頭堿14.592 8 μg/mL、苯甲酰新烏頭堿17.875 2 μg/mL、烏頭原堿19.600 0 μg/mL、新烏頭原堿20.000 0 μg/mL、次烏頭原堿20.000 0 μg/mL、附子靈17.978 4 μg/mL、尼奧靈18.518 0 μg/mL、塔拉薩敏22.743 0 μg/mL、多根烏頭堿18.400 0 μg/mL、宋果靈21.560 0 μg/mL的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備 取藥材粉末(過(guò)3號(hào)篩)約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入氨試液3 mL，精密加入異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲(功率300 W、頻率40 kHz、水溫25 ℃以下)處理30 min，放冷，混合溶液補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 mL，40 ℃以下減壓回收至干[8]，殘?jiān)眉状既芙庥?5 mL量瓶中，再精密移取1 mL至5 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，濾過(guò)，續(xù)濾液用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.4 分析條件

2.4.1 色譜 Agilent SB-C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相2 mmol/L醋酸銨(含0.1%甲酸)(A)-乙腈(含0.1%甲酸)(B)；梯度洗脫(0～1.5 min，10%～20%B；1.5～5 min，20%～70% B；5～5.1 min，70%～100%B；5.1～8 min，100%B)；體積流量0.4 min/L；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

2.4.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源(ESI)，正離子模式；毛細(xì)管電壓4 000 kV；干燥氣溫度300 ℃，體積流量11 L/min；霧化器壓力310 kPa；MRM模式掃描。各生物堿主要質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1，MRM色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 各生物堿主要質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 Main mass spectrometric parameters for various alkaloids

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，精密配制成不同質(zhì)量濃度，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，并分別以信噪比(S/N)3∶1、10∶1為檢出限、定量限，結(jié)果見(jiàn)表2，可知各生物堿在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各生物堿線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various alkaloids

2.5.2 精密度試驗(yàn) 將“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液稀釋10倍，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得各生物堿峰面積RSD為0.76%～2.88%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，于0、2、4、8、10、12、24 h在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各生物堿RSD為1.81%～4.83%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份炮制品約2 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各生物堿含量RSD均小于4.33%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各生物堿含量已知的同一份炮制品6份，每份約1 g，按100%水平精密加入對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭堿、苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿、烏頭原堿、新烏頭原堿、次烏頭原堿、附子靈、尼奧靈、塔拉薩敏、多根烏頭堿、宋果靈平均加樣回收率分別為102.80%、101.49%、103.33%、96.91%、102.92%、105.52%、100.37%、106.77%、96.92%、99.83%、104.19%、105.20%、105.20%、101.91%，RSD分別為3.66%、4.59%、1.08%、4.05%、3.91%、2.52%、3.31%、3.80%、1.76%、3.42%、1.05%、3.49%、2.61%、3.63%。

2.6 樣品含量測(cè)定 取各炮制品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。由此可知，炮附子中生物堿總含量最高，現(xiàn)代炮制品中較低；蒸附子、烘附子、炒附片減毒存效作用較好；黑順片、白附片中毒性成分雖然大大減少，但有效成分也流失較多；古法炮附子中有效成分雖然保留較多，但減毒效果較差。

表3 各生物堿含量測(cè)定結(jié)果(μg/g)Tab.3 Results of content determination of various alkaloids(μg/g)

2.7 聚類分析 采用SPSS 26.0軟件，以各生物堿含量為變量進(jìn)行分析，選擇組間連接和平方歐式距離，結(jié)果見(jiàn)圖2。由此可知，當(dāng)平方歐氏距離為5時(shí)，6種炮制品可分為3類，白附片和黑順片為第1類，蒸附子和烘附子為第2類，炒附片和炮附子為第3類，與炮附子最相似的是炒附片。

圖2 不同炮制品聚類樹(shù)狀圖Fig.2 Cluster dendrogram of different processed products

2.8 主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA) 將各生物堿含量導(dǎo)入SIMCA13.0.3軟件中進(jìn)行PCA處理，結(jié)果見(jiàn)圖3A。由此可知，白附片、黑順片遠(yuǎn)離炮附子，即與后者存在較大差異，但兩者之間差異較小，表明不同膽巴工藝對(duì)生物堿的影響程度具有趨同性；炒附片比烘附子、蒸附子更接近炮附子，表明它對(duì)生物堿的影響程度與炮附子具有相似性。

再采用OPLS-DA模型進(jìn)行分析，測(cè)得R2X=0.996，R2Y=0.841，Q2=0.657，表明模型穩(wěn)定，預(yù)測(cè)能力較好。除了白附片、黑順片外，炒、蒸、烘、炮這些炮制工藝的區(qū)分比較明顯，所得成分也存在差異，見(jiàn)圖3B。然后，以變量權(quán)重值(VIP)為指標(biāo)篩選出對(duì)附子質(zhì)量影響顯著的生物堿，發(fā)現(xiàn)VIP>1者為苯甲酰次烏頭堿、苯甲酰新烏頭堿、附子靈、新烏頭堿、多根烏頭堿、次烏頭堿，見(jiàn)圖3C。

圖3 各炮制品PCA-X、OPLS-DA得分圖及VIPFig.3 PCA-X, OPLS-DA score plots and VIPs for different processed products

4 討論

附子生物堿是該藥材主要藥效物質(zhì)，其中雙酯型生物堿烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿是劇毒成分，而單酯型生物堿苯甲酰烏頭堿、苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿是有效成分，同時(shí)其余原堿類成分也證實(shí)具有不同程度的藥理活性，如烏頭原堿[13]、新烏頭原堿[13]、次烏頭原堿[13]、多根烏頭堿[13]、塔拉薩敏[14]、尼奧靈[15]具有強(qiáng)心和降壓作用，附子靈、宋果靈具有鎮(zhèn)痛、降壓[16]的作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與古法差異較小的炮制品為炒附片，其原因可能是兩者炮制溫度接近，均約為170 ℃，而且炮制過(guò)程中均未有水蒸氣參與；烘附子炮制溫度為150 ℃，受熱不均勻；蒸附子炮制溫度為100 ℃，其間有水蒸氣的不斷參與，導(dǎo)致其相似度不及炒附片；白附片和黑順片與古法差異較大，這是因?yàn)閮烧呔?jīng)膽巴和水浸制、煮、漂、蒸等工序的處理，生物堿大量流失。但有研究發(fā)現(xiàn)，不同規(guī)格附子炮制品所制備復(fù)方湯劑的質(zhì)量和藥效存在顯著差異[16-17]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)從化學(xué)成分的角度出發(fā)，發(fā)現(xiàn)炒附片與古法炮附子具有相似性，可為后續(xù)經(jīng)典名方中該藥材的炮制研究提供了理論依據(jù)。