泊馬度胺改善腦缺血小鼠神經(jīng)功能的機(jī)制研究

王夢涵 張麗敏 楊賀城 王景濤 王建平 盧 宏鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052

腦卒中（cerebral stroke）分為出血性及缺血性，其中缺血性腦卒中（cerebral ischemic stroke）又稱腦梗死（cerebral infraction），因具有高發(fā)病率、高致殘率及高病死率的特點，使其躋身于中國致死病因的首位，據(jù)此，積極尋找有效治療腦梗死方法或能改善這一現(xiàn)狀［1］。當(dāng)腦梗死事件發(fā)生后，多種細(xì)胞因子參與機(jī)體免疫反應(yīng)，炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生可以引起梗死區(qū)域神經(jīng)元的損傷，而神經(jīng)營養(yǎng)因子的產(chǎn)生也在神經(jīng)元存活中起著關(guān)鍵作用［2］。腦梗死后的病理生理過程中，小膠質(zhì)細(xì)胞（microglia，MG）與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［3］，MG活化后促使炎癥因子的表達(dá)上調(diào)，協(xié)同產(chǎn)生的氧自由基、基質(zhì)金屬蛋白酶等不僅導(dǎo)致缺血區(qū)域腦組織的損傷還能擴(kuò)大腦梗死范圍［4-5］。

泊馬度胺是一種新型的免疫調(diào)節(jié)藥物（immunomodulatory drug，IMiD），可下調(diào)單核細(xì)胞炎癥因子的生成，而這一作用主要是通過增強(qiáng)天然殺傷（NK）細(xì)胞與T 淋巴細(xì)胞參與的免疫應(yīng)答實現(xiàn)的［6］。在多發(fā)骨髓瘤（multiple myeloma，MM）的研究中泊馬度胺被認(rèn)為具有良好的抗炎作用［7］。關(guān)于泊馬度胺對腦梗死的治療未見報道，本研究擬通過MCAO 模型觀察小鼠腦缺血后神經(jīng)功能評分、細(xì)胞因子的表達(dá)、小膠質(zhì)細(xì)胞的增生等，探討泊馬度胺在小鼠腦梗死后的神經(jīng)保護(hù)作用及可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組清潔雄性C57/BL6 小鼠，體質(zhì)量18～22 g。標(biāo)準(zhǔn)實驗環(huán)境下實驗動物自由進(jìn)食水。實驗動物按隨機(jī)盲法的原則分組，分為Sham組、MCAO 組、Vehicle 組、Pom 組。每組15 只小鼠于造模成功后進(jìn)行神經(jīng)功能評分和免疫熒光染色。每組12 只造模成功3 d 后Western blotting 方法檢測梗死側(cè)腦組織炎癥因子、營養(yǎng)因子的表達(dá)。

1.2 主要試劑兔抗BDNF、兔抗TNF-α、兔抗IL-1β、兔抗GDNF、過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG（上海生工）；兔抗IBA1（日本W(wǎng)ako）；羊抗兔FITC（美國Abcam）。

1.3 主要方法

1.3.1 造模及分組：實驗動物術(shù)前禁食12 h，禁水4 h。10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔麻醉后采取仰臥位，頸正中切口分離右側(cè)的頸動脈鞘，充分暴露頸內(nèi)動脈（internal carotid artery，ICA）、頸外動脈（external carotid artery，ECA）和頸總動脈（common carotid artery，CCA）。對游離的頸總動脈進(jìn)行結(jié)扎，同側(cè)的頸內(nèi)動脈暫時夾閉，線栓經(jīng)離斷的頸外動脈段插入，沿頸內(nèi)動脈方向到達(dá)同側(cè)大腦中動脈起始處，插入深度（8±2）mm～（10±2）mm。術(shù)畢固定插入的線栓，縫合創(chuàng)口，分籠飼養(yǎng)。手術(shù)過程中維持小鼠肛溫約37 ℃，采取無菌操作的原則。Sham 組只暴露血管。MCAO 組、Vehicle 組、Pom 組暴露血管并插入線栓。Pom組及Vehicle組小鼠分別給予相同體積的泊馬度胺（0.5 mg/kg）及PBS 溶液。Zea-Longa 評分1～3分視為成功模型。

1.3.2 神經(jīng)行為學(xué)評價：采用改良的神經(jīng)功能缺損評分（modified neurological severity scores，mNSS）評估實驗動物的神經(jīng)功能缺損情況。實驗動物于造模后第1～35 天進(jìn)行mNSS 評分，每7 d 進(jìn)行一次評估。神經(jīng)功能的評估項目包括小鼠運(yùn)動、感覺、平衡、反射能力，mNSS 評分在12～16 分的小鼠入組實驗。mNSS評分高則損害較重，分?jǐn)?shù)為0～22分。

1.3.3 免疫熒光染色

1.3.3.1 腦組織切片制備：實驗組小鼠腹腔麻醉，固定后使其心臟暴露，經(jīng)左心室插入穿刺針至升主動脈處約0.5 cm 進(jìn)行固定，采用溫度37 ℃、壓力150 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）PBS溶液經(jīng)剪開的右心耳進(jìn)行灌注，待實驗組小鼠黏膜、四肢蒼白后，4%多聚甲醛繼續(xù)灌注，最終取出腦組織并用新的4%多聚甲醛固定24 h。腦組織按順序置于4 ℃的濃度梯度分別為15%、20%、30%的蔗糖溶液沉底。腦組織置于冰凍切片機(jī)中，調(diào)整厚度約10 μm 的冠狀位連續(xù)切片，切片置于防凍液—80 ℃保存。

1.3.3.2 腦組織免疫熒光染色：腦組織冰凍切片復(fù)溫后置于4%的多聚甲醛固定10 min；用PBS溶液漂洗3次，5 min/次；5%山羊血清封閉切片1 h；切片甩去血清后，加入一抗并置于4 ℃的濕盒。過夜后，切片再次經(jīng)PBS 溶液清洗3 次，5 min/次。室溫條件下加入二抗并孵育2 h，PBS溶液再次清洗2次，5 min/次，整個操作過程避光進(jìn)行，抗熒光劑封片后顯微鏡觀察。

1.3.4 Western blotting檢測

1.3.4.1 蛋白樣品的制備及定量：各組小鼠實驗第3天取腦，用預(yù)冷的組織剪將冠狀切前囪前l(fā).0 mm 至前囪后3.0 mm 梗死區(qū)腦組織剪碎。按1 g 腦組織與0.06 mL 的RIPA 裂解液的比例加入裂解液，并于冰上勻漿，充分搖勻。在4 ℃、12 000 r/min 條件下離心20 min，上清為樣品蛋白。操作嚴(yán)格按照BCA 蛋白定量試劑盒說明，測定并且計算出樣品的蛋白濃度。最后分裝并于—80 ℃保存。

1.3.4.2 SDS-PAGE電泳：配置10 mL的12%分離膠，用去離子進(jìn)行水封閉。室溫條件下約30 min后棄去去離子水，配制3 mL的15%壓縮膠，迅速加入至分離膠上并插入梳子。室溫約15 min，待壓縮膠聚合凝固后將梳子拔出并清洗，凝膠置于電泳槽中。按設(shè)計的順序等劑量進(jìn)行加樣。連接所需電泳設(shè)備，設(shè)定電壓80 V 跑膠至壓縮膠底部，后電壓110 V 跑膠至底部為止。轉(zhuǎn)膜液浸泡保留的膠并待轉(zhuǎn)膜。

1.3.4.3 轉(zhuǎn)膜：用去離子水清洗經(jīng)甲醇浸泡活化的PVDF膜，置于轉(zhuǎn)膜液中備用。在轉(zhuǎn)膜儀上，按濾紙、膜、膠、濾紙的順序依次進(jìn)行排列，在電流100 mA 50 min條件下轉(zhuǎn)膜。

1.3.4.4 免疫反應(yīng)：將5%脫脂奶粉與PVDF膜放于塑料薄膜中封口并于搖床封閉2 h。將PVDF膜從脫脂奶粉取出，放入含有一抗的塑料薄膜中封口4 ℃過夜。應(yīng)用TBST 液將PVDF 膜清洗5 次，10 min/次。PVDF膜置于含有二抗的塑料薄膜中封口，在室溫條件下?lián)u床孵育2 h。最后應(yīng)用TBST液清洗5次PVDF膜，10 min/次。

1.3.4.5 化學(xué)顯像及分析：將清洗后的PVDF膜置于含有ECL 發(fā)光液的掃描儀中進(jìn)行掃描。Western blotting圖像分析軟件分析內(nèi)參條帶和目的條帶光密度值，光密度值的比值則為目的蛋白表達(dá)含量。

1.3.4.6 小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量評估及分析：采用圖像分析軟件Imaging-Pro-Plus（OLYMUPS）處理系統(tǒng)分析測量梗死灶周圍MG Iba1 陽性數(shù)量。每張免疫熒光染色腦片均取相同部位視野進(jìn)行軟件分析。

1.4 統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù)，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）形式表示，組內(nèi)采用單因素方差分析法比較，組間采用LSD 法比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

2.1 泊馬度胺對神經(jīng)功能的影響采用mNSS 評分評估小鼠腦梗死后的神經(jīng)功能缺損情況。與無神經(jīng)功能缺損的Sham組小鼠相比，其他各組均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損。實驗過程中，Pom 組小鼠缺損的神經(jīng)功能在第7～35天表現(xiàn)出持續(xù)恢復(fù)。第7天時，盡管MCAO 組和Vehicle 組mNSS 評分也表現(xiàn)為下降的趨勢，而Pom組評分則顯著下降，重復(fù)測量方差分析顯示組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.601，P＜0.05），LSD 檢驗顯示，Pom 組mNSS 評分相較MCAO組和Vehicle 組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1、表1。

表1 腦梗死小鼠神經(jīng)功能評分比較Table 1 Neurological function score of cerebral infarction mice （±s）

表1 腦梗死小鼠神經(jīng)功能評分比較Table 1 Neurological function score of cerebral infarction mice （±s）

注：與MCAO組和Vehicle組相比，*P＜0.05

組別MCAO組Vehicle組Pom組神經(jīng)功能評分35 d 6.35±0.87 5.99±0.83 4.46±0.91*1 d 13.46±0.92 13.24±0.96 13.31±0.98 7 d 11.07±1.05 10.64±1.13 9.42±1.05*14 d 9.64±1.06 9.94±1.27 6.15±1.04*21 d 7.63±1.23 7.62±0.94 6.15±1.04*28 d 6.59±0.72 6.45±0.65 5.03±0.95*

2.2 泊馬度胺對細(xì)胞因子的影響

2.2.1 泊馬度胺對腦組織內(nèi)TNF-α、IL-1β的影響：采用Western blotting 技術(shù)測定腦梗死組織周圍的TNF-α、IL-1β水平。Sham 組小鼠腦組織內(nèi)低水平表達(dá)TNF-α和IL-1β；與Vehicle組和MCAO組小鼠腦組織內(nèi)高水平表達(dá)TNF-α和IL-1β不同，Pom 組小鼠腦組織的TNF-α、IL-1β表達(dá)水平明顯降低，與Vehicle組和MCAO 組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2、表2。

表2 不同時間點梗死側(cè)腦組織勻漿中TNF-α、IL-1β的Western blotting結(jié)果比較 （±s）Table 2 Western blotting results of TNF-α and IL-1β in brain homogenate of infarct side at different time points （±s）

表2 不同時間點梗死側(cè)腦組織勻漿中TNF-α、IL-1β的Western blotting結(jié)果比較 （±s）Table 2 Western blotting results of TNF-α and IL-1β in brain homogenate of infarct side at different time points （±s）

注：與Vehicle組和MCAO組相比，*P＜0.05

指標(biāo)TNF-α IL-1β Pom組0.481±0.035*0.513±0.042*Sham組0.149±0.031 0.159±0.036 Vehicle組0.712±0.036 0.692±0.041 MCAO組0.681±0.042 0.712±0.033

2.2.2 泊馬度胺對腦組織內(nèi)BDNF、GDNF 的影響：采用Western blotting 技術(shù)測定腦梗死組織周圍的BDNF、GDNF水平。Sham組小鼠腦組織內(nèi)低水平表達(dá)BDNF、GDNF。與MCAO 組和Vehicle 組升高的BNDF、GDNF表達(dá)水平相比，Pom組小鼠腦組織中營養(yǎng)因子蛋白表達(dá)水平達(dá)到最高。對小鼠腦組織BNDF、GDNF 蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，MCAO 組、Vehicle組和Pom 組結(jié)果差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖3、表3。

表3 不同時間點梗死腦組織勻漿中BDNF、GDNF的Western blotting結(jié)果比較 （±s）Table 3 Western blotting results of BDNF and GDNF in infarcted brain tissue at different time points （±s）

表3 不同時間點梗死腦組織勻漿中BDNF、GDNF的Western blotting結(jié)果比較 （±s）Table 3 Western blotting results of BDNF and GDNF in infarcted brain tissue at different time points （±s）

注：與Vehicle組和MCAO組相比，*P＜0.05

指標(biāo)BDNF GDNF Pom組0.693±0.039*0.731±0.032*Sham組0.181±0.031 0.171±0.034 Vehicle組0.413±0.036 0.412±0.043 MCAO組0.434±0.041 0.461±0.032

2.3 泊馬度胺對小膠質(zhì)細(xì)胞的影響腦梗死后第1、7、14、28天，與Sham組相比，其余各組腦梗死灶周圍組織MG數(shù)目均增多，Pom組增加的MG數(shù)目與MCAO組及Vehicle 組相比明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），MCAO 組與Vehicle 組MG 增加數(shù)目相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。腦梗死后第7 天MG數(shù)目最多，第14、28天時數(shù)量明顯下降。見圖4～5。

3 討論

實驗表明，通過靜脈注射泊馬度胺可抑制MG過度增生來減輕缺血后其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌，顯著改善腦梗死小鼠神經(jīng)功能的缺損情況，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。腦梗死發(fā)生后，組織缺血缺氧造成神經(jīng)元的死亡［8-9］，受損細(xì)胞釋放損傷相關(guān)的細(xì)胞因子和興奮性毒性谷氨酸［10-12］，從而引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)［13］。MG激活作為炎癥反應(yīng)的重要一環(huán)［14-15］，可產(chǎn)生多種介質(zhì)，包括促炎細(xì)胞因子（TNF-α）［16］、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）［17］，不僅通過產(chǎn)生毒性物質(zhì)而加重神經(jīng)元的損傷，而且通過產(chǎn)生BDNF等生長因子促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)［18-19］。

泊馬度胺作為新一代免疫調(diào)節(jié)劑類藥物［20］，在小鼠視網(wǎng)膜抗炎實驗中發(fā)現(xiàn)，其在抗炎濃度下不具有神經(jīng)毒性。關(guān)于創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）的研究顯示，單次給藥泊馬度胺（0.5 mg/kg）可減輕動物模型的病變大小，減少神經(jīng)元的凋亡，顯著改善運(yùn)動功能障礙［21］。在難治性骨髓瘤實驗中［22］，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)泊馬度胺不僅通過抑制MM 細(xì)胞的功能產(chǎn)生抗骨髓瘤的作用，也能通過下調(diào)炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8 等的表達(dá)，使靶細(xì)胞的存活率下降。腦梗死動物模型中，TNF-α和IL-1β在梗死后24 h 內(nèi)腦脊液中顯著升高［23-25］，與梗死面積呈正相關(guān)［26-28］。而本實驗中Pom組活化MG的數(shù)目明顯減少，發(fā)現(xiàn)泊馬度胺也同樣抑制促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β表達(dá)，推測可能是通過抑制MG實現(xiàn)的。

小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)的免疫細(xì)胞，可產(chǎn)生多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進(jìn)腦梗死后損傷腦組織的神經(jīng)恢復(fù)。有研究者嘗試將外源性MG直接移植入腦內(nèi)，結(jié)果提示MG 對腦梗死有保護(hù) 作 用［29-30］。在 短 暫 性MCAO 組動物模型中，腦缺血發(fā)生2 d后移植MG有效減少凋亡的神經(jīng)元，增加包括GDNF、BDNF 在內(nèi)的神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)［31］。本實驗發(fā)現(xiàn)，Pom 組GDNF、BDNF 神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)明顯高于Vechile 組，推測可能是小膠質(zhì)細(xì)胞的分泌作用所致。

泊馬度胺可以抑制腦梗死后MG 的過度活化，減輕其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，顯著改善缺損的神經(jīng)功能。因此，泊馬度胺可能是缺血性腦卒中潛在的治療靶點。